專利名稱：制備用作細胞種植框架和植入體的生物細胞外基質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從人或動物組織所得到的除皮膚，血管和軟骨外的組織制備生物細胞外基質的方法。
器官或組織的損傷或缺失是人類健康中最經常發(fā)生、最具災難性且花費最昂貴的問題之一。因此，組織工程學作為一個新的領域便應運而生，其是利用生物學和工程學原理來開發(fā)損傷組織的功能替代物。
組織工程是一個應用工程和生命科學原理研究正常和病理狀態(tài)哺乳組織間結構-功能關系并進而研制能恢復，保持或改善組織功能的領域。它包括將活細胞與天然或人工的細胞外基質一起用于研制用于恢復或替代組織功能的移植體。
對于制備新的組織替代物所采取的三種基本構思之一是將細胞置于基質上或之中。該基質來自天然材料或合成的生物降解的聚合物纖維框架，其被作為ECM。
盡管已開發(fā)出許多人工或合成的移植物，但這些組織替代物仍不能恰當地取代天然高度復雜的結構。今天在組織移植中所面臨的挑戰(zhàn)是克服機體的免疫系統(tǒng)并盡力改善移植物的功能。盡管在本領域已取得了很大進展，但目前的組織移植仍存有許多問題，這包括炎癥，降解，瘢痕，感染，鈣化，咬合和排斥。因此，目前廣泛深入的醫(yī)學生物材料研究是面向改善移植組織移植物的工程，但理想的人工移植物還未研制出來。
美國專利4,801,299記載了一種通過用洗滌劑除去組織中細胞成份從而得到供移植用的細胞外基質的方法。但如該組織預先用固定劑固定的話，則該洗滌劑不能用于該組織的制備。
本發(fā)明人在研究中出人意料地發(fā)現通過將來自人或動物供體的組織先用固定液固定，然后用作為消化液的堿性溶液除去固定組織中細胞得到細胞外基質，該細胞外基質具有優(yōu)良的組織完整性和作為移植物所具備的其它性質，并使供體的來源更廣，從而為供體提供了廣泛來源。所述動物可以是豬、?；蜓颉１景l(fā)明基于上述發(fā)現得以完成。
本發(fā)明的目的是提供一種加工來自人或動物的生物組織的方法，其是通過化學處理來制備脫細胞化的以膠原蛋白為主的ECM，所得到的生物組織用于人類或動物的移植。本發(fā)明提供了制備改進的ECM的有效方法，該ECM一般具有該組織的原有形狀且同時保留了所需要的生物結構。該組織可由已知方法得到，該組織可是宿主的或從尸體或供體得到的。該組織在固定后進行脫細胞。
得到該組織后，對其進行固定，然后進行脫細胞，其中脫細胞用的消化液選自堿金屬氫氧化物或其碳酸鹽或碳酸氫鹽，氫氧化銨，堿金屬醇化物，有機胺或它們的混合物?？刹捎醚鯕溲趸c或氫氧化鉀溶液。然后將所得到的ECM洗滌，孵育并保存。
在移植前，作為細胞框架的ECM可用來自宿主(自身細胞)或其它人的細胞種植。該機體組織的ECM也可作為基質材料用于組織替代。
本發(fā)明包括通過固定處理，除去細胞，滅菌和細胞重建步驟獲得生物組織，從而提供用于移植的生物替代組織。
在優(yōu)選實施方案中，所獲得的組織優(yōu)選是與隨后進行植入的移植物相同的組織。例如皮膚用于代替皮膚，血管用于代替血管，軟骨用于代替軟骨，肌鍵代替肌鍵，膀胱代替膀胱，輸尿管代替輸尿管，尿道代替尿道等。
用人的尸體或動物供體得到的生物組織具有1cm3體積或更大，其獲取后馬上置于帶有固定劑的固定液中，如戊二醛或甲醛。該固定液可包含于緩沖液如磷酸鈉緩沖液中(PBS)的2％甲醛和1.5％戊二醛。該組織在固定液中最少保留時間約2小時，或直到該組織完全被固定。組織固定后，用適宜材料對其洗滌幾次，如用蒸餾水。
在優(yōu)選實施方案中，該組織然后被放在NaOH或KOH溶液或任何其它堿性溶液中以進行該組織的孵育，從而除去固定組織中細胞。該組織于室溫在該溶液中的保留時間為約12小時-5天。溶液優(yōu)選含1.5-2.0N NaOH或KOH的堿性溶液。濃度范圍為0.1N-5N，溫度范圍為約4℃-60℃，這取決于所加工供體組織的類型和獲得該脫細胞化ECM所需的時間長度。更高濃度，更高的溫度或更長的消化將損害該結果。實踐中，在室溫用NaOH或KOH處理更長時間會導致彈性纖維的消化。所得ECM可通過顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察到。
組織脫細胞化后，進行組織的洗滌。洗滌組織的溶液可以是蒸餾水和緩沖液，如磷酸鈉。
在該步中，可變化洗滌溶液，優(yōu)選為約30分鐘，且持續(xù)洗滌直到ECM呈半透明狀。洗滌ECM后，將ECM于氨基酸如天門冬氨酸，谷氨酸或甘氨酸溶液中孵育以消除殘余的游離固定劑并降低pH。具體的氨基酸可是0.5％天門冬氨酸或0.1M甘氨酸溶液。緩沖液中ECM孵育最好將洗滌液pH帶到約7.4。加工后，可以在移植前不損害ECM結構的任何方式放置并貯存該脫細胞的ECM。
該ECM結構提供了用于細胞粘著，生長和分化的適宜有效的生物底物。該ECM可在移植前通過細胞培養(yǎng)技術在其上種植活細胞作為細胞框架而成為替代組織，或通過各種醫(yī)學步驟直接作為體內或體外植入的模板。
本發(fā)明提供了一種組織產品，其包括良好防腐的ECM。該ECM調節(jié)與其接觸的細胞行為上起著活性的并且綜合的作用。
本發(fā)明就是制備一個完好保留的細胞外基質，目前大量的研究已經證明了細胞外基質對與其相接觸的細胞的各種行為起著非常重要的調節(jié)作用，圍繞在細胞外的基質是一種相對很穩(wěn)定的結構物質，但是只認為圍繞在細胞外的基質對于細胞僅僅起著惰性的支持和框架的作用，這種看法已成為了過去，構成細胞外基質的每一種成份對于與它相接觸的細胞的生長，分化都有著特殊的功能，由它們結合而構成的三維立體空間的細胞外基質，對于細胞的生長、分化、代謝、調節(jié)都起著不可替代的作用，反過來由于這些細胞外基質是由細胞所產生，所以細胞對于圍繞在其周圍的細胞外基質的形成起著這樣或那樣的作用和影響，在細胞的表面有著與ECM相連結的特殊的受體，這樣細胞基質的組成成分和空間結構對于細胞的代謝、形態(tài)生長分化有著密切相關的作用。
因此，對于通過該技術特殊處理過的組織，由于所有能夠被宿主識別出對宿主表達組織免疫抗原性的細胞物質被去除，而完整保留下來的ECM其形態(tài)，組織結構，超微結構，定位和耐受性等都與原有組織的基質一樣。
當與目前市場的移植物比較時，本發(fā)明所制備的ECM具有難以模仿的天然生物構造并在應用中具有優(yōu)越性能。該ECM與由ECM成份如膠原或纖維蛋白涂覆的化學聚合物底物組成的移植體比較，其絕對無毒，不會引起不良過敏活性且可促進細胞繁殖。當本發(fā)明與美國專利4,801,299的ECM和方法比較時，本發(fā)明通過更簡易，低花費的方法在更短的時間內制備ECM，同時保留了所需的天然結構，且供體的來源更廣泛，方便。
權利要求
1．一種通過去除了細胞成份，保留細胞外基質而制備除皮膚、血管和軟骨外的方法，其包括以下步驟a．從人或動物供體獲得除皮膚、血管和軟骨外的組織b．將所得的組織用固定劑固定，c．將選自堿金屬氫氧化物或其碳酸鹽或碳酸氫鹽，氫氧化銨，堿金屬醇化物，有機胺或它們的混合物的堿性溶液用于所述組織，d．用緩沖液對組織進行洗滌，e．將所獲得的細胞外基質在孵育溶液中進行孵育的步驟以便消除殘留的固定液成分并降低細胞外基質的pH值。
2．權利要求1所述的方法，其中的孵育液是天門冬氨酸。
3．權利要求1所述的方法，其中的孵育液是谷氨酸。
4．權利要求1所述的方法，其中孵育液是甘氨酸。
5．權利要求1所述的方法，其中的堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
6．權利要求2所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
7．權利要求3所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
8．權利要求4所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
9．權利要求1所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
10．權利要求2所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
11．權利要求3所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
12．權利要求4所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
13．權利要求1-12任一所要求的方法，其中所制備的ECM可作為移植用的模板直接用于人或動物的移植。
14．權利要求1-12任一所要求的方法，其中所制備的ECM可被種植上來自宿主或其它人或動物的活細胞而用作人或動物移植的移植體。
15．權利要求1所述的方法，其中所述的動物可以是豬、牛、羊。
全文摘要
由人類或動物供體得到的組織。該組織可通過固定方法來固定?？梢鹋懦獾募毎煞菘赏ㄟ^化學處理從組織中除去,從而使細胞外基質(ECM)保留了它們原有的形狀,生物結構,超微結構,定位和耐久性。將活細胞種植在作為細胞框架的所得ECM上,形成用于移植或同種異體移植的有生命的移植物。
文檔編號A01N1/02GK1304655SQ0012021
公開日2001年7月25日 申請日期2000年7月13日 優(yōu)先權日2000年7月13日
發(fā)明者胡杰 申請人:胡杰