專利名稱：抗真菌肽及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗真菌肽，其制備方法和用途。具體地說，是從銀杏中分離純化得到新的肽。
植物利用許多富含半胱氨酸/甘氨酸的小抗菌蛋白抵御病原侵襲。硫素(Bohlmann,H.和Apel,K.(1991)Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.42,227-240)，植保素(Broekaert等，1995,Plant Physiol.108,1353-1358),Ac-AMPs(Broekaert,W.F.,Marien,W.,Terras,F.R.G.,De Bolle,M.F.C.,Proost,P.,VanDamme,J.,Dillen,L.,Claeys,M.,Rees,S.B.,Vanderleyden,J.和Cammue,B.P.A.(1992)Biochemistry 31,4308-4314),henein類和knottin類抗菌肽(Cammue等，1992,J.Biol.Chem.267,2228-2233)都屬于富含半胱氨酸的小肽(29-54個殘基)，但他們一級結構迥異，抗菌活性也不同。其中，hevein類肽和Ac-AMPs都是幾丁質結合肽，它們具有一個hevein區(qū)或一段同源序列。
目前對于許多抗菌肽的抗真菌和/或抗細菌活性的分子機制尚不清楚。VanParijs等認為，hevein和Urtica dioica凝集素(UDA)的抗真菌活性與其蛋白質分子量大小有一定關系。這些蛋白很小，以至能夠透過真菌細胞壁到達原生質膜，然后在那里作用于成細胞膜的活性位點(Van Parijs,J.,Broekaert,W.F.,Goldstein,I.J.和Peumans,W.J.(1991)Planta(Heidelberg)183,258-264)。硫素則在細胞膜上形成孔，造成細胞膜滲漏，導致微生物死亡(Florack,D.E.A.和Stiekema,W.J.(1994)Plant Mol.Biol.26,25-37)。
我國是一個農業(yè)大國，然而，每年因真菌引起的病害都造成農業(yè)上的巨大損失。因此，對于對農作物進行改良和開發(fā)新的有應用價值的抗真菌劑就具有特別重要的意義。
為此，本發(fā)明提供了一種新的抗真菌肽。對N末端的氨基酸序列進行了NIHBLAST檢索，未發(fā)現有與其高度同源的序列，證明這是首次分離得到的新肽。本發(fā)明還提供了從天然植物材料銀杏葉中分離純化得到該抗真菌肽的方法。所述的肽具有顯著的抗真菌活性，所以本發(fā)明還提供了所述肽用于制備抗真菌藥物的用途。
為了獲得新的抗真菌劑，我們在植物中開始篩選工作。我們發(fā)現，銀杏葉中盡管含有豐富的多糖，它們卻很少受到真菌的侵襲；同時，我們還發(fā)現，許多抗真菌蛋白屬于幾丁質結合家族。因此，我們選擇銀杏葉作為分離純化抗真菌劑的材料，用硫酸銨鹽析法抽提蛋白質；幾丁質純化；分子篩分離；和HPLC純化，得到新的抗真菌肽。
所述的新的抗真菌肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.1:
DPTCSVLGDFKCNPGRCCSKINYCGACYQWLAR，分子量為4244.0Da。
為了保持蛋白質的活性，所有的操作均宜在0℃-4℃進行。
為了保持肽的活性，避免不可逆變性，我們采用硫酸銨鹽析法進行蛋白質抽提。為了富集目標肽，同時盡可能減少雜蛋白或雜肽，硫酸銨的濃度以40(w/w)％至80(w/w)％為宜；最好是80(w/w)％。
本發(fā)明采用幾丁質層析從蛋白質粗提物中分離目標肽。為了提高分離效率，同時保持肽的活性，離子強度和pH是其中的重要參數。所以，本發(fā)明采用的幾丁質親和層析包括用20mM NaHCO3,pH7.3-8.3洗柱，以pH7.8為佳；用20mM乙酸鈉，pH5.1-6.1洗柱，以pH5.6為佳；用20mM乙酸，pH3.1-3.5洗脫，以pH3.3為佳，并收集洗脫液。其中的離子強度以200mM為宜，據此，可以選用具有相當離子強度的其它緩沖液，這對本領域熟練技術人員來說并不困難。
利用分子篩分離蛋白是本領域公知的常規(guī)技術，例如Sepherose柱上的FPLC，Sephdex柱層析和PAGE電泳等。條件是，選用的方法不會另目標肽失活。因此，本發(fā)明優(yōu)選Sepherose12柱FPLC。
HPLC純化蛋白是本領域的公知常識。本發(fā)明使用常規(guī)市售HPLC工作站(C18柱)。
本發(fā)明還包括將本發(fā)明的抗真菌肽用于制備抗真菌藥物，用于農業(yè)抗病，獸醫(yī)和人類臨床。
根據Roberts and Selitrennikoff法(Biochem.Biophys.Acta 1986,880,161-170)測定本發(fā)明肽的抗真菌活性。結果發(fā)現，它對水稻紋枯(Pellicularia sasakii Ito)、小麥赤霉(Fusarium graminearum Schw)、煙草赤星(Alternaria alterinate(Fries)Keissler)、水稻惡苗(Fusarium moniliforme)具有明顯的抗性。最低有效濃度為100μg/ml。
附


圖1A-D是本發(fā)明抗真菌分析的結果。A中的真菌為水稻紋枯菌；B中的真菌為水稻惡苗菌；C中的真菌為小麥赤霉；D中的真菌為煙草赤星。各培養(yǎng)皿中，紙片1含純水，紙片2含小牛血清白蛋白(溶于100mM檸檬酸緩沖液，pH5.0)，紙片3含1μg本發(fā)明抗真菌肽(溶于100mM檸檬酸緩沖液，pH5.0)，紙片4含2μg本發(fā)明抗真菌肽(溶于100mM檸檬酸緩沖液，pH5.0)。
圖2是FPLC層析和SDS/PAGE電泳結果。泳道M是分子量標記物；泳道1是鹽析提取物；泳道2是幾丁質親和層析純化物；泳道A是FPLC的A峰。
圖3是HPLC層析。其中B峰是本發(fā)明的抗真菌肽。
以下是本發(fā)明的非限定性實施例。若非特別說明，各種操作均在4℃進行。
實施例1．抗真菌肽的分離與純化粗蛋白的提純在2-3倍體積的檸檬酸緩沖液(30mM,pH5.0,1mM苯甲基磺酰氯)中將銀杏葉充分勻漿。勻漿用3層紗布過濾，濾液在10,000g離心30分鐘。取上清液，加入固體硫酸銨達80(w/w)％飽和度。攪拌過夜，38,000g離心30分鐘，收集粗蛋白。將粗蛋白沉淀重溶于30ml 20mM NaHCO3，用3.5kDa的透析膜對20mMNaHCO3透析。幾丁質親和層析取3.5g幾丁聚糖，根據Molano等所述的方法(Molano,J.,Duran,A.和CabibE.(1977)Anal Biochem.83,648-656)制備新鮮的再生幾丁質，高壓滅菌，用20mMNaHCO3平衡，裝入直徑2.6cm的層析柱，最后的床體積為46ml。
將透析過的蛋白質溶液上樣在再生幾丁質柱上，流速為0.5ml/min。先用20mM NaHCO3,pH7.8洗脫，直到無蛋白質洗出。第二次，用20mM pH5.6的乙酸鈉緩沖液洗脫，進行90分鐘。最后用20mM pH3.3的乙酸溶液洗脫。將洗脫液立即用3.5kDa的透析膜對蒸餾水透析。透析后，將洗脫液真空濃縮干燥。FPLC將蛋白質溶于200mM NaHCO3，上樣在以200mM NaHCO3平衡的Superose 12柱(Pharmacia Biotech)上，進行FPLC(Pharmacia Biotech的FPLC系統(tǒng))。用200mMNaHCO3，以0.4ml/min的流速洗脫。通過測定280nm吸光度來檢測蛋白質。用SDS/PAGE測定各流份的分子量(Laemmli,U.K.(1970)Nature(London)227,680-685)。如實施例3所述對各流份進行抗真菌活性檢測。
如圖2所示，19ml處的洗脫峰表現出很強的抗真菌活性。SDS/PAGE顯示，該流份中只含有本發(fā)明的抗真菌肽。如實施例2所述進行的質譜分析顯示，其分子量為4244.0Da。HPLC使用HP1090 HPLC工作站進一步純化蛋白質。將以上洗脫峰上樣在0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的反相C18柱(ABI)上。以1ml/min的流速，進行如下梯度洗脫0-50min,0-50％溶液B。溶液B為0.1％的TFA乙腈溶液。通過測定214nm處的吸光度來檢測蛋白質。如圖3所示，共洗出兩個峰，A與B。在抗真菌活性測試中，B峰表現出強抗真菌活性，A峰的抗真菌活性則很弱。所以，B峰為本發(fā)明的抗真菌肽。
從500g銀杏葉約可制得4mg純化肽。
實施例2．蛋白質的鑒定在Finnigan LCQ-MS質譜儀上進行肽的質譜分析。將上述純化肽溶于含1％(v/v)乙酸的水/乙醇(50∶50,v/v)，濃度為5μmol/l，然后用于質譜儀。結果測得，本發(fā)明抗真菌肽的分子量為4244Da。
如Hunkapiller等所述(Hunkapiller,M.W.,Hewick,R.M.,Dreyer.W.J.和Hood,L.E.(1983)Methods Enzymol.91,399-413),在Applied Biosystem 473A蛋白質測序儀上測定肽的氨基酸序列，得到氨基酸序列SEQ ID NO.1:DPTCSVLGDFKCNPGRCCSKINYCGACYQWLAR。
實施例3．抗真菌活性測試本發(fā)明測試了抗真菌肽對4種致病真菌的抗真菌活性。測試所用的植物病原菌都由江蘇農業(yè)科學院提供。它們是水稻紋枯菌，小麥赤霉菌，煙草赤星菌和水稻惡苗菌。如Robert,W.K.等所述(Robert,W.K.和Selitrennikoff,C.P.同上)，通過菌絲體延伸抑制試驗來測定抗真菌活性。
在培養(yǎng)皿中制備土豆固體培養(yǎng)基。從生長活躍的真菌平板上收集真菌菌絲，將菌絲塊置于培養(yǎng)基中心。28℃培養(yǎng)48小時，任菌絲生長。將無菌圓濾紙片置于菌絲前沿，在各濾紙片上滴加20μl蛋白質(溶于100mM檸檬酸緩沖液，pH5.0)。在28℃培養(yǎng)24小時，然后拍照。濾紙片周圍出現月牙形的抑制帶說明被測溶液具有抗真菌活性。
如Broekaert等所述(Broekaert,W.F.,Marein,W.,Terras,F.R.G.,De Bolle,M.F.C.,Proost,P.,Van Damme,J.,Dillen,L.,Claeys,M.,Rees,S.B.,Vanderleyden,J.和Cammue,B.P.A.(1992)Biochemistry 31,4308-4314)測定生長抑制百分比。如Duvick等(Duvick,J.P.,Rood,T.,Gururaj Rao,A.和Marshak,D.(1992)J.Biol.Chem.267,18814-20)所述，并使用標準方法(Singleton,L.L.,Mihail,J.D.和Rush,C.M.(1992)Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi, APS press,Minnesota)收集真菌的孢子或菌絲體。含有真菌孢子或菌絲體的90μlPD培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24小時。然后加入10μl各種濃度的肽。繼續(xù)28℃培養(yǎng)48小時，記錄生長情況。測定595nm處的吸光度表示真菌的生長情況(Terras,F.R.G.,Schoofs,H.M.E.,De Bolle,M.F.C.,Van Leuven,F.,Rees,S.B.,Vanderleyden,J.,Cammue,B.P.A.和Broekaert,W.F.(1992)J.Biol.Chem.267,15301-15309)。
如
圖1和所示，本發(fā)明抗真菌肽在100ng/濾紙片的低濃度就表現出了對水稻紋枯菌的強抗性。而且，對其它真菌也有生長抑制作用。
因此，本發(fā)明的銀杏提取物和抗真菌肽可用于配制農藥，直接噴灑于植株，抵抗致病真菌的侵襲。
權利要求
1．抗真菌肽，它具有氨基酸序列SEQ ID NO.1:DPTCSVLGDFKCNPGRCCSKINYCGACYQWLAR，分子量為4244.0Da。
2．根據權利要求1所述的肽的制備方法，它包括從銀杏葉中用硫酸銨抽提粗蛋白；幾丁質親和層析；分子篩純化；HPLC純化。
3．根據權利要求2所述的方法，其中硫酸銨溶液濃度范圍為40(w/w)％至80(w/w)％。
4．根據權利要求3所述的方法，其中硫酸銨溶液的濃度為80(w/w)％。
5．根據權利要求2所述的方法，所述的幾丁質層析包括用20mM NaHCO3,pH7.3-8.3洗柱；用20mM乙酸鈉，pH5.1-6.1洗柱；用20mM乙酸，pH3.1-3.5洗脫，并收集洗脫液。
6．根據權利要求5所述的方法，所述的幾丁質層析包括用20mM NaHCO3,pH7.8洗柱；用20mM乙酸鈉，pH5.6洗柱；用20mM乙酸，pH3.3洗脫，并收集洗脫液。
7．根據權利要求2所述的方法，其中的分子篩法是Sepherose12 FPLC。
8．權利要求1所述的肽的用途，它被用于制備抗真菌的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的抗真菌肽。它以銀杏葉為原料,通過鹽析,幾丁質親和層析,分子篩分離,HPLC純化制得。本發(fā)明還提供所述肽用于制備抗真菌藥物的用途。
文檔編號A01N47/08GK1314362SQ0011494
公開日2001年9月26日 申請日期2000年3月16日 優(yōu)先權日2000年3月16日
發(fā)明者龔蓁蓁, 黃旭 申請人:中國科學院上海生物化學研究所