本發(fā)明涉及一種化合物，更具體的講涉及一種具有抗癌活性的五倍子酸衍生物及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

惡性腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一大疾病。近年來(lái)惡性腫瘤的治療有了明顯的進(jìn)步，抗腫瘤藥物研究經(jīng)過(guò)40余年的努力已發(fā)展到一個(gè)新的階段，其研究領(lǐng)域已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)的以核酸及其組成成分為靶點(diǎn)的細(xì)胞毒類(lèi)藥物。為尋找有新的作用機(jī)理及獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒類(lèi)藥物人們一直在做著努力，最近人們認(rèn)為治療惡性腫瘤的藥物應(yīng)該是通過(guò)刺激腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)使其死亡，而不是象以前提出的且被廣泛接受的作為一種生長(zhǎng)抑制劑。此外，抗腫瘤藥物應(yīng)該對(duì)腫瘤細(xì)胞而不對(duì)正常細(xì)胞具有選擇性。五倍子酸及其衍生物具有廣泛的生物活性，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性作用，因此，其抗腫瘤作用日益受到人們的重視。

五倍子酸抗腫瘤作用機(jī)制人們做了大量的研究，得到一個(gè)共同的結(jié)論：五倍子酸抗腫瘤作用是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用實(shí)現(xiàn)的。研究了五倍子酸對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，HL-60RG，dRLh-84，Hela，PLC/PRF/5，KB的IC50分別為：5.4μg/ml，6.2μg/ml，6.1μg/ml，6.6μg/ml，和13.2μg/ml，而且細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析五倍子酸對(duì)這幾種細(xì)胞均產(chǎn)生凋亡作用。五倍子酸在IC50為4.8～13.2μg/ml時(shí)，對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不顯細(xì)胞毒作用，對(duì)纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞顯示較小的細(xì)胞毒作用；當(dāng)濃度超過(guò)20μg/ml時(shí)，五倍子酸與細(xì)胞dRLh-84作用6h后，細(xì)胞死亡。相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)研究顯示五倍子酸的細(xì)胞毒作用不是酚類(lèi)化合物所共有的，而是依賴于五倍子酸結(jié)構(gòu)上特有的特征：3個(gè)相鄰的酚羥基是主要的活性基團(tuán)。在早幼粒細(xì)胞白血病HL-60RG的細(xì)胞培養(yǎng)中，五倍子酸與HL-60RG細(xì)胞接觸幾分鐘后即增加其細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物水平，并且可被過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶或維生素C酸抑制。這揭示了細(xì)胞內(nèi)ROS誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。人胃癌KATOIII和人克隆腺癌COLO205細(xì)胞用五倍子酸處理后導(dǎo)致這兩種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡。五倍子酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用不依賴細(xì)胞周期，ROS的產(chǎn)生(如H2O2)和胞內(nèi)Ca²⁺濃度上升可作為五倍子酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的共同信號(hào)，且細(xì)胞凋亡可被胞內(nèi)抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸、過(guò)氧化氫酶和胞內(nèi)Ca²⁺鰲合劑抑制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，五倍子酸使細(xì)胞內(nèi)ROS呈劑量依賴性的增加，可能由胞外產(chǎn)生的超氧陰離子得到的H2O2內(nèi)流，增加胞內(nèi)H2O2水平，與胞內(nèi)Ca²⁺一起使染色體DNA在核小體間斷裂，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另?yè)?jù)報(bào)道五倍子酸誘導(dǎo)人口腔腫瘤細(xì)胞株HSC-2和HSG的凋亡，是以細(xì)胞核縮合，半胱氨酸蛋白酶caspase活化為特征。此外，五倍子酸具有抑制鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞P815、鼠黑色素瘤細(xì)胞B16和鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178等轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞增殖的作用，IC50分別為6.5μg/ml,8.0μg/ml和3.6μg/ml，用50mg/kg的五倍子酸治療靜脈注射P815的DBA/2小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠肝內(nèi)的腫瘤數(shù)量下降，在肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中升高的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶均降低，五倍子酸通過(guò)殺滅轉(zhuǎn)移至肝臟的P815而抑制肥大細(xì)胞瘤的肝轉(zhuǎn)移，從而延長(zhǎng)了生存期。

五倍子酸對(duì)HL-60RG，dRLh-84，Hela，PLC/PRF/5和KB細(xì)胞的敏感性高于正常細(xì)胞(如原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和纖維原細(xì)胞)。從大鼠原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞和細(xì)胞漿中得到游離血清的條件培養(yǎng)液可阻止五倍子酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而在肝腫瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系如dRLh-84，PLL/PRF/5，HLE和HUH以及兩種其它類(lèi)型腫瘤細(xì)胞如Hela和KB中條件培養(yǎng)液和細(xì)胞漿內(nèi)很少產(chǎn)生這種抑制活性，表明大量抑制劑的生成使正常細(xì)胞對(duì)五倍子酸不敏感。

五倍子酸在動(dòng)物體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)有明顯的毒性作用。在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠五倍子酸5g/kg，沒(méi)有出現(xiàn)毒性和死亡的任何體征；在亞急性試驗(yàn)中，給予小鼠口服1g/kg的五倍子酸未顯著改變血液學(xué)參數(shù)，且各種生化參數(shù)如SGOT，SGPT和許多血清組成如蛋白質(zhì)、膽固醇、尿素和膽紅素等都沒(méi)有明顯改變，表明五倍子酸沒(méi)有蓄積毒性。另一研究給予F344大鼠含有5種濃度五倍子酸(0％，0.2％，0.6％，1.7％和5％)的食物，維持13周，研究五倍子酸的長(zhǎng)期毒性，結(jié)果顯示5％雌雄二治療組與對(duì)照組比較，體重顯著減輕?！?.6％五倍子酸的雄性治療組和5％五倍子酸的雌性治療組的毒性作用包括血紅蛋白濃度，血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，網(wǎng)織細(xì)胞增加。5％五倍子酸治療組組織病理學(xué)上出現(xiàn)脾髓外造血，血鐵黃素沉積和充血，表明有溶血性貧血。此外，1.7％五倍子酸雌雄二治療組發(fā)現(xiàn)大鼠肝小葉肥大，反映肝臟重量增加。目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示0.2％五倍子酸治療組沒(méi)有觀察到不良反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在上述現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種具有抗癌活性的五倍子酸衍生物，其結(jié)構(gòu)通式為：

其中R1為酸酐官能基團(tuán)，R2為1,3,5-三甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、1-羥基苯并三唑、1-氯代苯并三唑或3-甲基吲哚官能基團(tuán)中的一種。

所述R1為乙酸酐，R2為1,3,5-三甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、1-羥基苯并三唑、1-氯代苯并三唑、3-甲基吲哚或3-氯吲哚官能基團(tuán)中的一種。

所述R1為正丁酸酐，R2為1,3,5-三甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、1-羥基苯并三唑、1-氯代苯并三唑、3-甲基吲哚或3-氯吲哚官能基團(tuán)中的一種。

所述五倍子酸衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

所述五倍子酸衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

所述五倍子酸衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

所述五倍子酸衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

上述所述的具有抗癌活性的五倍子酸衍生物在制備治療口腔癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提供的五倍子酸衍生物對(duì)口腔癌細(xì)胞具有良好的活性，且選擇性強(qiáng)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1五倍子酸衍生物A的ESI-MS圖譜；

圖2五倍子酸衍生物B的ESI-MS圖譜；

圖3五倍子酸衍生物C的ESI-MS圖譜；

圖4五倍子酸衍生物D的ESI-MS圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1反應(yīng)中間體的制備

NaOH(13.2g，330mMol)分批加入300ml水中，磁力攪拌直到NaOH溶解，冰浴降溫至0℃。五倍子酸(14.1g，75mMol)分批加入NaOH水溶液中，溶解之后，攪拌半小時(shí)，反應(yīng)液體顏色加深變成深褐色。0℃下用恒壓滴液漏斗，滴加醋酸酐(60ml，634mMol)，醋酸酐在1個(gè)小時(shí)內(nèi)滴加完畢之后，0℃下保溫反應(yīng)一小時(shí)，然后反應(yīng)自然回復(fù)到室溫，溶液顏色變淺，出現(xiàn)白色固體。用布氏漏斗過(guò)濾，固體用少量水洗一次。濾液用乙酸乙酯(3次100ml)萃取，有機(jī)相合并用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到固體與前述過(guò)濾的固體合并，用200ml乙醇重結(jié)晶得到中間體1(15.2g，收率68％)。反應(yīng)式如下：

NaOH(13.2g，330mMol)分批加入400ml水中，磁力攪拌直到NaOH溶解，冰浴降溫至0℃。五倍子酸(14.1g，75mMol)分批加入NaOH水溶液中，溶解之后，攪拌半小時(shí)，反應(yīng)液體顏色加深變成深褐色。0℃下用恒壓滴液漏斗，滴加正丁酸酐(104ml，640mMol))，正丁酸酐一小時(shí)內(nèi)滴加完畢之后，0℃下反應(yīng)一小時(shí)，然后反應(yīng)自然回復(fù)到室溫，溶液顏色變淺，出現(xiàn)白色固體。用布氏漏斗過(guò)濾，固體用少量水洗一次。濾液用乙酸乙酯(3次100ml)萃取，有機(jī)相合并用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到固體與前述過(guò)濾的固體合并，用200ml乙醇重結(jié)晶得到純品的中間體2(17.1g，收率60％)。反應(yīng)式如下：

實(shí)施例2五倍子酸衍生物的制備

將實(shí)施例1中的中間體1(3mMol)溶于30mlTHF中，分別加入3.3mMol的HOBT，3.3mMol的EDCI，3.3mMol的三乙胺，3.3mMol的2,4-二甲基苯胺，室溫下攪拌15分鐘之后，升溫至50℃攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液傾倒入含有150ml純凈水燒杯中。分液，水相加入乙酸乙酯50ml萃取三次。合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到的粗品上層析柱，洗脫液濃度(乙酸乙酯：石油醚＝1:4-6)梯度洗脫，五倍子酸衍生物A純品0.51g(收率42％)。具體方式如下：

將實(shí)施例1中的中間體1(3mMol)溶于30mlTHF中，分別加入3.3mMol的HOBT，3.3mMol的EDCI，3.3mMol的三乙胺，3.3mMol的3-甲基吲哚原料，室溫下攪拌15分鐘之后，升溫至50℃攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液傾倒入含有150ml純凈水燒杯中。分液，水相加入乙酸乙酯50ml萃取三次。合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到的粗品上層析柱，洗脫液濃度(乙酸乙酯:石油醚＝1:4-6)梯度洗脫，得到0.60g五倍子酸衍生物B純品(收率48.9％)。其反應(yīng)式如下：

將實(shí)施例1中的中間體1(3mMol)溶于30mlTHF中，分別加入3.3mMol的HOBT，3.3mMol的EDCI，3.3mMol的三乙胺，3.3mMol的3-氯吲哚原料，室溫下攪拌15分鐘之后，升溫至50℃攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液傾倒入含有150ml純凈水燒杯中。分液，水相加入乙酸乙酯50ml萃取三次。合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到的粗品上層析柱，洗脫液濃度(乙酸乙酯：石油醚＝1-6:1-4)梯度洗脫，得到0.45g五倍子酸衍生物C(收率35.0％)純品。其反應(yīng)式如下：

將實(shí)施例1中的中間體2(3mMol)溶于30mlTHF中，分別加入3.3mMol的HOBT，3.3mMol的EDCI，3.3mMol的三乙胺，3.3mMol的原料，室溫下攪拌15分鐘之后，升溫至50℃攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液傾倒入含有150ml純凈水燒杯中。分液，水相加入乙酸乙酯50ml萃取三次。合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到的粗品上層析柱，洗脫液濃度(乙酸乙酯：石油醚＝1:4-6)梯度洗脫，得到0.81g五倍子酸衍生物D純品(收率54.3％)。其反應(yīng)式如下：

將上述合成獲得的四種五倍子酸衍生物進(jìn)行ESI-MS化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，具體如表1所述：

表1五倍子酸衍生物化合物結(jié)構(gòu)分析

實(shí)施例3五倍子酸衍生物的活性考察

分別將口腔鱗癌細(xì)胞SCC-15、口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27和口腔癌前病變細(xì)胞DOK株在37℃、5％CO₂及飽和濕度環(huán)境下,含10％胎牛血清、100萬(wàn)單位青霉素、80萬(wàn)單位鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)、傳代(必要時(shí)凍存)。接種時(shí)以胰酶消化液(0.25％)消化,加細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞均按5-10×10⁴細(xì)胞/ml接種,培養(yǎng)過(guò)夜后,加入活性物質(zhì),隔天換液。以95％乙醇處理的癌細(xì)胞及未經(jīng)處理的癌細(xì)胞作為對(duì)照。

分別將口腔鱗癌細(xì)胞SCC-15、口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27和口腔癌前病變細(xì)胞DOK接種于96孔培養(yǎng)板。分別加五倍子酸衍生物A、B、C、D及五倍子酸處理后,間隔一定時(shí)間,取出培養(yǎng)板,去除培養(yǎng)液,洗滌2-3次,每孔加100μl 0.2mg/ml MTT 37℃溫育4h,去除MTT液,加200μl堿化DMSO(10％甘氨酸-NaOH緩沖液)37℃溫育1h,并振蕩,于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)定OD值。每次試驗(yàn)安排3孔,取平均值。試驗(yàn)重復(fù)3次以上,結(jié)果基本一致。

依照MTT法操作步驟,在同1塊96孔板上將五倍子酸衍生物A、B、C、D及五倍子酸等5種活性物質(zhì)按4種濃度作用于口腔鱗癌細(xì)胞SCC-15。培養(yǎng)板中,每1行都代表1種活性物質(zhì)；每3列代表同1種濃度,從左向右依次為0.1、0.5、1.0和1.5mg/ml。依據(jù)MTT法作用原理,顏色的深淺可以反映出活細(xì)胞的多少,即顏色越深代表孔內(nèi)活細(xì)胞越多,即活性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的抑制率越低。因此,五倍子酸衍生物B和五倍子酸衍生物D對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(參見(jiàn)表2所示)。

參照上述方法，在同1塊96孔板上將五倍子酸衍生物A、B、C、D及五倍子酸等5種活性物質(zhì)按4種濃度作用于口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27。五倍子酸衍生物C對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(參見(jiàn)表2所示)。

參照上述方法，在同1塊96孔板上將五倍子酸衍生物A、B、C、D及五倍子酸等5種活性物質(zhì)按4種濃度作用于口腔癌前病變細(xì)胞DOK。五倍子酸衍生物A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(參見(jiàn)表2所示)。

表2 MTT法測(cè)定4種活性物質(zhì)對(duì)癌細(xì)胞的作用