專利名稱：：脂肪酸低碳酯尤其生化柴油的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種提升固定化脂肪分解酵素(lipase)的活性的技術(shù)，以及有關(guān)一種將失活的固定化脂肪分解酵素加以再生的技術(shù)，其中該固定化脂肪分解酵素特別有用于一種通過三酸甘油酯與一低碳數(shù)醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)來生產(chǎn)生化柴油的方法。在歐洲、美國、日本等國家已有利用強(qiáng)堿做催化劑來生產(chǎn)生化柴油的工業(yè)化制造過程(例如美國專利5,354,878)。有數(shù)十萬噸的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。雖然如此，強(qiáng)堿制造過程還是有一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)，強(qiáng)堿制造過程無法順利的處理雜質(zhì)含量較高的油及脂，這里所說的雜質(zhì)主要是指在廢食用油(renderedfeedstockoils)、廢動物油脂(renderedanimalfats)、食用油精制造過程中的廢油或廢脂中常含有的水分和游離脂肪酸，這些雜質(zhì)的存在會使強(qiáng)堿制造過程產(chǎn)生許多不要的副產(chǎn)物(肥皂)，造成生化柴油的轉(zhuǎn)化率下降及產(chǎn)品純化困難。所以現(xiàn)有的商業(yè)上生化柴油強(qiáng)堿制造過程幾乎都只使用純的植物油為原料。目前要使用脂肪分解酵素來生產(chǎn)生化柴油有兩個主要關(guān)鍵難題，第一個是酵素制造過程的轉(zhuǎn)化速率不夠，在Watanabe等人提出的報告中[“ContinuousProductionofBiodieselFuelfromVegetableOilUsingImmobilizedCandidaantarcticaLipase”，JAOCS，vol.77，pp.355-360，2000]可以看到，酵素制造過程需要36小時來完成反應(yīng)，比強(qiáng)堿制造過程的1個小時高出甚多；另一個難題是酵素的價格高出強(qiáng)堿制造過程所使用的氫氧化鈉(NaOH)太多，除非使用可被回收再循環(huán)使用的固定化脂肪分解酵素(ImmobilizedLipase)，且酵素的活性可維持一段長的時間，否則將很難在成本上和強(qiáng)堿制造過程競爭。但很不幸的固定化脂肪分解酵素會受到反應(yīng)物中的低碳數(shù)醇類所毒害，當(dāng)該醇類的濃度太高即會使酵素完全失活。所以要使得利用固定化脂肪分解酵素的制造過程在經(jīng)濟(jì)上可行，從而取代傳統(tǒng)的強(qiáng)堿制造過程，如何將固定化脂肪分解酵素活性及壽命提高，及如何將部份或完全失活的固定化脂肪分解酵素有效的再生便成為重要的課題。本發(fā)明的一目的在于提供一種合適的方法來提高固定化脂肪分解酵素的活性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種在固定化脂肪分解酵素活性下降時加以再生活化方法。本發(fā)明的又一目的在于提供一種利用依本發(fā)明方法預(yù)處理的或再生的固定化脂肪分解酵素來催化一脂肪酸甘油酯或一游離脂肪酸(freefattyacids)與一低碳醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)或酯化反應(yīng)，來制備脂肪酸低碳酯的方法，尤其是生化柴油的制備方法。本發(fā)明提供一種由脂肪酸甘油酯或游離脂肪酸與-C1-C3醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)或酯化反應(yīng)而制備脂肪酸C1-C3烷基酯的方法，其特征在于包含使用一預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素催化該轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及該酯化反應(yīng)，其中該預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素是將一固定化脂肪分解酵素浸于一碳原子數(shù)不小于3的醇一段時間而制備。優(yōu)選的，該碳原子數(shù)不小于3的醇具有3-8個，更優(yōu)選的具有3或4個碳原子數(shù)。優(yōu)選的，該碳原子數(shù)不小于3的醇為1-丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇或叔丁醇。優(yōu)選的，該段時間介于0.5-48小時，更優(yōu)選的是0.5-1.5小時。優(yōu)選的，該預(yù)處理進(jìn)一步包含將浸于該碳原子數(shù)不小于3的醇的固定化脂肪分解酵素取出，再浸于一植物油0.5-48小時。優(yōu)選的，該固定化脂肪分解酵素被固定于一多孔性載體。優(yōu)選的，該固定化脂肪分解酵素來自Pseudomanas或Candida。在本發(fā)明方法中，該固定化脂肪分解酵素可以是新鮮的或失活的固定化脂肪分解酵素。當(dāng)該固定化脂肪分解酵素是失活的固定化脂肪分解酵素時，優(yōu)選的，是將該失活的固定化脂肪分解酵素以該碳原子數(shù)不小于3的醇加予清洗而制備該預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素。更優(yōu)選的，進(jìn)一步將清洗過的固定化脂肪分解酵素浸于一植物油0.5-48小時。優(yōu)選的，在本發(fā)明方法中該脂肪酸C1-C3烷基酯是通過該脂肪酸甘油酯與C1-C3醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)而制備。更優(yōu)選的，該脂肪酸C1-C3烷基酯為脂肪酸甲酯，且該脂肪酸甲酯通過一包含三酸甘油酯的油或脂與甲醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)而被制備。該包含三酸甘油酯的油或脂，優(yōu)選的為植物油。優(yōu)選的，在本發(fā)明方法中該脂肪酸C1-C3烷基酯是通過該脂肪酸甘油酯與C1-C3醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及該游離脂肪酸與C1-C3醇進(jìn)行酯化反應(yīng)而制備。更優(yōu)選的，該脂肪酸C1-C3烷基酯為脂肪酸甲酯，且該脂肪酸甲酯通過一包含三酸甘油酯及游離脂肪酸的油或脂與甲醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及酯化反應(yīng)而被制備。該包含三酸甘油酯及游離脂肪酸的油或脂，優(yōu)選的為植物油、動物油脂、回收廢食用油，或食用油精練過程中產(chǎn)生的廢油或廢脂。適合使用在本發(fā)明的固定化脂肪分解酵素并無特別限制，可為本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過已知技術(shù)制備，例如USP4798793；4940845；5156963；5342768；5776741及WO89/01032。使用固定化脂肪分解酵素催化一脂肪酸甘油酯或一游離脂肪酸與一低碳醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)或酯化反應(yīng)來制備脂肪酸低碳酯的方法，包括生化柴油的制備方法，已為本項技術(shù)人士所熟知，且非為本發(fā)明的重點(diǎn)，因此在此處并不多作贅述。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)或酯化反應(yīng)的較佳的條件為一介于室溫至80℃的溫度、及脂肪酸甘油酯或游離脂肪酸與該低碳醇的摩爾比大子1∶1，更佳的約3∶1。本發(fā)明一開始先探討甲醇及其它低碳數(shù)醇如乙醇、n-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇(isobutylalcohol)、叔丁醇(tert-Butanol)對固定化脂肪分解酵素的活性的影響。一定量的植物油(臺糖黃豆油)5.7克加上不同摩爾數(shù)比的醇類(油∶醇類＝8∶1，5∶1，3∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶2，1∶3)，再加上油重量5％的固定化脂肪分解酵素(商品代號Novozyme435，NovoNordisk公司所生產(chǎn))，其中酵素事先在油中浸泡24小時。在有蓋試管內(nèi)反應(yīng)，在30℃培養(yǎng)箱，震蕩速率200rpm，反應(yīng)5分鐘后取樣，以高效液相層析儀(HPLC)分析生化柴油和未反應(yīng)油的含量，并計算出酵素在不同條件下的初反應(yīng)速率，以作為酵素活性的指針。結(jié)果如圖1及2所示。所有的直鏈低碳數(shù)醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)對固定化脂肪分解酵素都有明顯的毒害，只是幅度稍有不同，該毒害程度和碳數(shù)有負(fù)相關(guān)，碳數(shù)越多的醇類對酵素的毒害程度越小。圖2則是所使用的支鏈醇類對酵素的毒害情形，可以看到支鏈的醇類對酵素的毒害程度比直鏈的醇類對酵素的毒害程度較低。尤其是異丙醇和2-丁醇毒害曲線幾乎呈現(xiàn)水平，也就是說異丙醇和2-丁醇對酵素沒有明顯的毒害。另外較特別的是叔丁醇(tert-Butanol)，不管在哪一種濃度之下，它都無法和脂肪酸甘油酯在所使用的酵素催化下形成鍵結(jié)，轉(zhuǎn)化率為零。在以上實驗中有兩個重要的發(fā)現(xiàn)，第一、當(dāng)甲醇、乙醇對Novozyme435發(fā)生毒害時，Novozyme435顆粒的外觀有明顯的改變，從原本金黃色透明的顆粒轉(zhuǎn)變成灰白不透明，還伴隨著顆粒膨脹結(jié)塊的情形，和未被毒害的Novozyme435有很大的不同；第二、甲醇和乙醇和植物油的互溶性極差，加入超過九分之一理論摩爾數(shù)的低碳數(shù)醇(甲醇、乙醇)(醇∶油＞1∶3)，整個混合物成乳化狀態(tài)(Emulsion)，和產(chǎn)生乳化現(xiàn)象的濃度和發(fā)生毒害的濃度幾乎完全相同。越多碳數(shù)的碳類則和油的互溶性較好，超過三個碳以上的醇類(丙醇以上)至少在完全反應(yīng)所需的理論摩爾數(shù)之內(nèi)(醇∶油≤3∶1)和植物油可以完全互溶。基于這兩點(diǎn)，在以下的實施例我們使用對Novozyme435無明顯毒性的異丙醇(iso-Propanol)和2-丁醇(2-Butanol)以及對脂肪酸甘油酯完全不反應(yīng)的叔丁醇(tert-Butanol)進(jìn)行Novozyme435的浸泡預(yù)處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過這三種溶劑的浸泡對活性不但沒有毒害，在某些狀況下反而有提高酵素活性、增加酵素對甲醇和乙醇毒害的抵抗力。另外，以異丙醇對失活的Novozyme435清洗、浸泡，也可以有效恢復(fù)酵素的活性。本發(fā)明人認(rèn)為固定化脂肪分解酵素在一脂肪酸甘油酯與一低碳醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中活性的降低大部分來自于物理性的因素。亦即甲醇或乙醇和脂肪酸甘油酯不互溶。所以當(dāng)甲醇或乙醇吸附到固定化脂肪分解酵素的孔洞中時，將會阻絕脂肪酸甘油酯進(jìn)入，使反應(yīng)無法進(jìn)行。本發(fā)明人亦觀察到甲醇比油容易被固定化脂肪分解酵素所吸收。本發(fā)明人首先揭示一種理想的溶劑來沖洗失活的固定化脂肪分解酵素，這個溶劑必須對酵素沒有毒害，且能和油、脂、水分、甲醇或乙醇有良好的溶解力，例如碳原子數(shù)3以上(包括3)的酵，較佳的為異丙醇(iso-Propanol)，2-丁醇(2-Butanol)和叔丁醇(tert-Butanol)，于是有效的使失活的固定化脂肪分解酵素恢復(fù)活性。本發(fā)明人同時發(fā)現(xiàn)以此理想溶劑對固定化脂肪分解酵素進(jìn)行浸泡的預(yù)處理，可顯著的提升酵素的活性。在本發(fā)明的較佳實施例中，一商業(yè)上可獲得的固定化脂肪分解酵素Novozyme435的活性被提高8-10倍；及失活的Novozyme435被成功的再生，恢復(fù)未毒害前的活性水準(zhǔn)。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。圖1.為已知的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的初反應(yīng)速率ri對各種直鏈醇的濃度的作圖，其中方形代表甲醇，圓代表乙醇，三角形代表正丙醇，及倒三角形代表1-丁醇。圖2.為已知的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的初反應(yīng)速率ri對各種支鏈醇的濃度的作圖，其中方形點(diǎn)代表異丙醇，三角形點(diǎn)代表2-丁醇，及圓代表異丁醇。圖3.為轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的初反應(yīng)速率ri對甲醇的濃度的作圖，其中黑方形點(diǎn)代表固定化脂肪分解酵素經(jīng)過本發(fā)明的異丙醇預(yù)處理，空心方形點(diǎn)代表習(xí)知的黃豆油預(yù)處理，三角形點(diǎn)代表本發(fā)明的2-丁醇預(yù)處理，及菱形點(diǎn)代表本發(fā)明的叔丁醇預(yù)處理。圖4.顯示使用過的固定化脂肪分解酵素，在通過黃豆油清洗(黑方形點(diǎn))所再生的酵素在最適甲醇濃度下的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的初反應(yīng)速率ri，及通過本發(fā)明的異丙醇清洗所再生一次(三角形)及再生二次的初反應(yīng)速率(空心圓)，其中橫軸的實驗號第1至8號分別代表該使用過的固定化脂肪分解酵素所催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中油對甲醇的摩爾比＝8∶1，5∶1，3∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶2，及1∶3。實施例1固定化脂肪分解酵素預(yù)處理方式對酵素活性的影響將從NovoNordisk公司買得的Novozyme435固定化酵素，稱重0.3公克，置于有蓋試管內(nèi)，用不同的方式浸泡(不浸泡、黃豆油、生化柴油、異丙醇、2-丁醇、叔丁醇、正己烷等溶劑浸泡)，使酵素顆粒膨潤，浸泡的時間詳見表一。預(yù)處理完的酵素加入5.7公克的黃豆油和0.26毫升的甲醇在震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng)，溫度30℃、震蕩速率200rpm、反應(yīng)時間30分鐘。反應(yīng)結(jié)束取樣0.1公克，加入10毫升的正己烷稀釋，用HPLC分析脂肪酸甲酯和未反應(yīng)油所占的比例，結(jié)果列于表一。從表一的結(jié)果來看酵素的預(yù)處理是非常重要的。經(jīng)過對酵素?zé)o毒害的醇類(異丙醇、2-丁醇、叔丁醇)的浸泡，脂肪酸甲酯的產(chǎn)率比完全未處理高約7倍，也比用生化柴油浸泡的效果更好，活性比生化柴油浸泡的方式提高了40％。在正己烷(n-Hexane)浸泡預(yù)處理的組別中，活性大幅度的下降，活性下降到和完全未處理的酵素活性差不多，證實了正己烷對Novozyme435有很高的毒性。經(jīng)過我們所提出的預(yù)處理方式處理的固定化脂肪分解酵素酵素不只在初期的活性明顯提高，在下實施例中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素對甲醇的毒害有較強(qiáng)的忍耐力。表一、預(yù)處理方式對反應(yīng)活性的影響實施例2不同濃度的甲醇對經(jīng)過預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素的毒害情形將表一中分別經(jīng)過三種不同無毒害醇類和植物油浸泡預(yù)處理的Novozyme435(占油重量5％)加入一定量的植物油(臺糖黃豆油)5.7克，再加上不同摩爾數(shù)比的甲醇(油∶甲醇＝8∶1，5∶1，3∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶2，1∶3)，在震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng)，溫度30℃、震蕩速率200rpm、反應(yīng)時間5分鐘。反應(yīng)結(jié)束取樣0.1公克，加入10毫升的正己烷稀釋，用HPLC分析脂肪酸甲酯和未反應(yīng)油所占的比例，計算出酵素在不同條件下的初反應(yīng)速率，作為酵素活性的指針。結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過無毒害的醇類浸泡后，在高濃度甲醇存在時，初反應(yīng)速率明顯比只用植物油浸泡者要高出很多，醇類浸泡確實對提高固定化脂肪分解酵素對甲醇的忍受力有幫助，其中以異丙醇和2-丁純的效果較好，叔丁醇略差。實施例3被不同濃度甲醇毒害后的固定化脂肪分解酵素的活性再生將經(jīng)過預(yù)處理(生化柴油1小時，用黃豆油清洗后浸泡黃豆油隔夜)的酵素分別加入固定量的油(臺糖黃豆油)，再加入不同濃度的甲醇(油對甲醇的摩爾比＝8∶1，5∶1，3∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶2，1∶3)，甲醇添加量的濃度由少到多分別編號為實驗1到實驗8，于有蓋試管中震蕩混合后室溫靜置24小時，使酵素部份或完全失活，失活后的酵素進(jìn)行下列清洗的操作，看是否能提高活性。清洗操作1黃豆油清洗3次，在30℃培養(yǎng)箱靜置過夜。清洗操作2先用異丙醇(iso-Propanol)沖洗三次，再用黃豆油洗去異丙醇，在30℃培養(yǎng)箱黃豆油中浸泡過夜。清洗操作3經(jīng)過清洗操作2處理，再進(jìn)行最適甲醇濃度反應(yīng)后，再用清洗操作2清洗一次。然后加入最適濃度(出圖1，知道當(dāng)甲醇添加量為黃豆油摩爾數(shù)的三分之一，有最高的轉(zhuǎn)化率)的甲醇，在震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng)，溫度30℃、震蕩速率200rpm、反應(yīng)時間5分鐘。反應(yīng)結(jié)束取樣0.1公克，加入10毫升的正己烷(Hexane)稀釋，用HPLC分析脂肪酸甲酯和未反應(yīng)油所占的比例，計算出酵素在不同條件下的初反應(yīng)速率。結(jié)果如圖4所示，在所添加的甲醇的摩爾數(shù)超過黃豆油的摩爾數(shù)的反應(yīng)中失活的固定化脂肪分解酵素，明顯可以看出只用黃豆油清洗無法使受毒害的酵素回復(fù)活性、酵素活性幾乎完全消失(黑方點(diǎn)的第6、7、8號)。而經(jīng)過異丙醇的清洗之后，在第6和第7號的再生固定化脂肪分解酵素的活性有明顯提高，幾乎回復(fù)到未毒害之前的活性水平。證實了用對酵素?zé)o毒害的醇類沖洗可以讓失活酵素的再生。雖然在第8號的再生酵素的活性恢復(fù)情況不甚理想，但在圖中可以看出用異丙醇清洗第二次會讓酵素活性再次提高，表示增加異丙醇清洗的程度度活性恢復(fù)有正面的影響，清洗時間和清洗溫度的最適化，應(yīng)該可以進(jìn)一步提高酵素的活性。除了異丙醇之外，在我們其它的實驗中也證實了2-丁醇和叔丁醇也有同樣有再生失活的固定化脂肪分解酵素的效果。權(quán)利要求1.一種由脂肪酸甘油酯或游離脂肪酸與一C1-C3醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)或酯化反應(yīng)而制備脂肪酸C1-C3烷基酯的方法，其特征在于包含使用一預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素催化該轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及該酯化反應(yīng)，其中該預(yù)處理的固定化脂肪分解酵素是將一固定化脂肪分解酵素浸于一碳原子數(shù)不小于3的醇一段時間而制備。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該碳原子數(shù)不小于3的醇具有3-8個碳原子數(shù)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該碳原子數(shù)不小于3的醇具有3或4個碳原子數(shù)。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中該碳原子數(shù)不小于3的醇為1-丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇或叔丁醇。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該段時間介于0.5-48小時。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該段時間0.5-1.5小時。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該預(yù)處理進(jìn)一步包含將浸于該碳原子數(shù)不小于3的醇的固定化脂肪分解酵素取出，再浸于一植物油0.5-48小時。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該固定化脂肪分解酵素被固定于一多孔性載體。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該固定化脂肪分解酵素來自Pseudomanas或Candida。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該固定化脂肪分解酵素是新鮮或失活的固定化脂肪分解酵素。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中該固定化脂肪分解酵素是失活的固定化脂肪分解酵素，并且該預(yù)處理固定化脂肪分解酵素是將該失活的固定化脂肪分解酵素以該碳原子數(shù)不小于3的醇加予清洗而制備。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該預(yù)處理進(jìn)一步包含將清洗過的固定化脂肪分解酵素浸于一植物油0.5-48小時。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該脂肪酸C1-C3烷基酯是通過該脂肪酸甘油酯與C1-C3醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)而制備。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中該脂肪酸C1-C3烷基酯為脂肪酸甲酯，且該脂肪酸甲酯通過一包含三酸甘油酯的油或脂與甲醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)而被制備。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該油或脂為植物油。16.如如權(quán)利要求1所述的方法，其中該脂肪酸C1-C3烷基酯是通過該脂肪酸甘油酯與C1-C3醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及該游離脂肪酸與C1-C3醇進(jìn)行酯化反應(yīng)而制備。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該脂肪酸C1-C3烷基酯為脂肪酸甲酯，且該脂肪酸甲酯通過一包含三酸甘油酯及游離脂肪酸的油或脂與甲醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及酯化反應(yīng)而被制備。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該油或脂為植物油、動物油脂、回收廢食用油，或食用油精練過程中產(chǎn)生的廢油或廢脂。全文摘要一種提升固定化脂肪分解酵素(Immobilizedlipase)的活性的技術(shù),以及有關(guān)一種將失活的固定化脂肪分解酵素加以再生的技術(shù),包括使用一碳原子數(shù)不小于3的醇來膨潤(swelling)及/或清洗該固定化脂肪分解酵素。該固定化脂肪分解酵素特別有用于一種通過三酸甘油酯.(triglycerides)與一低碳數(shù)醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)(transesterification)來生產(chǎn)生化柴油的方法。文檔編號C11C3/02GK1381553SQ0111540公開日2002年11月27日申請日期2001年4月24日優(yōu)先權(quán)日2001年4月24日發(fā)明者吳文騰,陳志威申請人:吳文騰