一株酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了酵母菌株及其應(yīng)用，該菌株于2012年11月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC?No.6840。利用該酵母菌發(fā)酵液處理種子，不僅安全環(huán)保、效果明顯、病原細(xì)菌不易產(chǎn)生抗藥性，而且不會因處理不當(dāng)影響種子萌發(fā)。另外，施用PA0732-1與田間，易定殖于哈密瓜植株表面，對哈密瓜病害具有很好的預(yù)防效果。
【專利說明】一株酵母菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株酵母菌株及其應(yīng)用，具體地說，涉及一株酵母菌株P(guān)A0732-1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]瓜類細(xì)菌性果斑病是近年來新發(fā)生并流行開來的一種毀滅性病害。也是世界檢疫性病害。2007年5月，我國農(nóng)業(yè)部重新將該病列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，作為重大檢疫性植物病害。該病主要引起西瓜、甜瓜、籽瓜果實(shí)的腐爛，導(dǎo)致減產(chǎn)。同時(shí)也能危害瓜類子葉、真葉，污染瓜種。具有發(fā)病快、防治難、為害重等特點(diǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球已有16個(gè)國家相繼報(bào)道了該病的發(fā)生，我國已達(dá)17個(gè)省市發(fā)現(xiàn)或報(bào)道了該病。其中新疆、內(nèi)蒙古、甘肅瓜產(chǎn)區(qū)危害重大，常年造成10%_30%的減產(chǎn)，發(fā)病重的年份，個(gè)別地塊絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響了瓜農(nóng)種植的積極性，使特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)失去了市場競爭活力。另外瓜類細(xì)菌性果斑病對合法種子經(jīng)銷商的利益也不斷受到損害，禁售和索賠事件頻繁發(fā)生，弓丨發(fā)一系列社會性問題。有效防治該病成為目前哈密瓜生產(chǎn)中面臨的亟待解決的問題。
[0003]哈密瓜細(xì)菌性果斑病由燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems) (Aac)引起,屬革蘭氏陰性菌,菌體短桿狀,屬rRNA組I。主要危害厚皮甜瓜、西瓜、籽瓜、南瓜、黃瓜、絲瓜、蜜露洋香瓜和網(wǎng)紋洋香瓜等，也可以感染番茄、胡椒、茄子等，不能侵染玉米、大豆。病菌主要通過傷口和氣孔侵染哈密瓜。遠(yuǎn)距離傳播通過調(diào)運(yùn)帶菌種子人為傳播，病種萌發(fā)后病菌先侵染子葉，引起幼苗染病，濕度大時(shí)，病斑上形成的菌膿，借助雨水、風(fēng)、昆蟲及農(nóng)事操作等途徑近距離的傳播，從而使病菌在田間得以定殖和流行。
[0004]對于瓜類細(xì)菌性果斑病的防治，國內(nèi)外學(xué)者也做了大量的研究，雖在一定程度上控制了該病害的發(fā)生和蔓延，但成效令人不滿意。因此，加強(qiáng)進(jìn)、出口種子的檢疫是預(yù)防該病發(fā)生的首要措施。對于種子檢測，國內(nèi)外成功建立了多種檢測技術(shù)體系，如RFLP、PCR產(chǎn)物雜交、PCR產(chǎn)物測序及同源性分析、免疫磁性分離PCR技術(shù)等，這些技術(shù)能有效地檢測和鑒定出病原的種類，而且成效顯 著。，但檢測后的帶菌種子的處理及田間防治研究報(bào)道較少。目前國內(nèi)外防治該病仍依賴稀酸浸種技術(shù)，銅制劑和抗生素類化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。用物理方法處理種子，操作簡單，能減輕病害的發(fā)生，但不能根除。施用可殺得等銅制劑濃度掌握不當(dāng)，易造成西瓜和甜瓜藥害。運(yùn)用過量抗生素類化學(xué)藥劑易造成的果實(shí)殘留，對部分人群健康有害。應(yīng)用抗病品種防治該病是最簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有免疫的哈密瓜品種。
[0005]本項(xiàng)目選用了酵母菌作為該病的生防材料，其具有抗逆性強(qiáng)，對環(huán)境要求不高，能利用低水平的營養(yǎng)物質(zhì)迅速繁殖成為主導(dǎo)菌，分泌所產(chǎn)生的胞外多糖具有加強(qiáng)其生存能力和抵制病原菌的侵染作用；受殺蟲劑的影響較?。唤湍妇倪z傳學(xué)基礎(chǔ)研究的比較清楚，遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)比較完善，具有通過基因工程技術(shù)改造提高防效的潛力；大多數(shù)拮抗酵母菌不產(chǎn)生對人體有害的抗菌素，同時(shí)可以避免病菌對抗菌素產(chǎn)生抗性而降低生物防治的效果。因此，這些獨(dú)具優(yōu)勢的特性使酵母菌成為植物病害生物防治的一類極具應(yīng)用潛能的新資源菌，在今后植物病害防治中起著舉足輕重的生防作用，越來越受到人們的重視。
[0006] 20世紀(jì)50年代以來，酵母菌在植物病害防治領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速，利用酵母菌防治植物真菌病害的研究已取得了不少的突破性進(jìn)展，尤其在果蔬采后病害的防治上相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很多，但對于植物細(xì)菌病害防治目前國內(nèi)外研究少見報(bào)道。迄今為止，已報(bào)道有20多種酵母菌用于蘋果、梨、草莓、柑橘、葡萄、桃、櫻桃、油桃、獼猴桃等果實(shí)真菌病害的生物防治。一些國家還成功利用酵母菌研制開發(fā)了安全有效的生物制劑等，在控制柑橘類和仁果類果實(shí)采后腐爛具有很好的防效。利用酵母菌防治病害已逐步發(fā)展成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，而提供一株酵母菌株P(guān)A0732-1及其應(yīng)用。通過從外界環(huán)境中經(jīng)大量的分離、篩選酵母菌，成功獲得一株拮抗Aac效果顯著的酵母菌株P(guān)A0732-1，證明了利用酵母菌可以防治細(xì)菌性病害。同時(shí)發(fā)現(xiàn)酵母菌株0732-1發(fā)酵液中存在酸性抑細(xì)菌菌物質(zhì)。利用酵母菌發(fā)酵液處理種子，不僅安全環(huán)保、效果明顯、病原細(xì)菌不易產(chǎn)生抗藥性，而且不會因處理不當(dāng)影響種子萌發(fā)。另外，施用PA0732-1于田間，易定殖于哈密瓜植株表面，對哈密瓜病害具有很好的預(yù)防效果。
[0008]其技術(shù)方案為:
[0009]本發(fā)明所述酵母菌株分離于石河子西瓜葉片表面，菌株代號為PA0732-1，該菌株于2012年11月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為 CGMCC N0.6840。
[0010]一種酵母菌株P(guān)A0732-1發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟:
[0011]I)酵母菌株P(guān)A0732-1通過PDA培養(yǎng)基或PSA培養(yǎng)基，進(jìn)行菌種培養(yǎng)或活化，PSA培養(yǎng)基配方為:土豆200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000ml, ρΗ6.8~7.0 ;
[0012]2)將PSB培養(yǎng)液加入容器中，PSB培養(yǎng)液配方為土豆200g，蔗糖20g，水1000ml，pH7.0，加入量為容器空間體積與培養(yǎng)液體積4: 1，按2%的接種量接入^ I X 108cfu/ml菌種懸浮液，置于26°C, 150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)4天。
[0013]本發(fā)明所述酵母菌株發(fā)酵液在防治哈密瓜細(xì)菌性果斑病中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
[0015]本發(fā)明獲得的酵母菌株P(guān)A0732-1，施用于田間，易定殖于哈密瓜植株表面，帶菌種子經(jīng)酵母菌PA0732-1處理時(shí)間大于30min以上可以取得很好的防治效果，利用濃度高于lX107cfu/ml的酵母菌PA0732-1菌懸液處理瓜葉，防治效果將優(yōu)于利用殺菌劑可殺得2000 (Kocide)0
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為酵母菌PA0732-1形態(tài)特征，其中A，菌落形態(tài)(PDA/28°C /2d) ;B，假菌絲形態(tài)；C，菌體及其芽殖；D，子囊孢子形態(tài)；
[0017]圖2為哈密瓜苗期細(xì)菌性果斑病葉部發(fā)病病情分級標(biāo)準(zhǔn)癥狀；
[0018]圖3為酵母菌PA0732-1發(fā)酵產(chǎn)物對哈密瓜種子處理后防病效果；[0019]圖4為發(fā)酵液處理不同時(shí)間對哈密瓜果斑病發(fā)病的影響；
[0020]圖5為哈密瓜田間葉片發(fā)病病情分級標(biāo)準(zhǔn)癥狀；
[0021]圖6為田間接種濃度對哈密瓜葉片防病效果的影響，A，發(fā)病率；B，病情指數(shù)。
[0022]微生物信息
[0023]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式以及【具體實(shí)施方式】中所使用的異常畢赤酵母菌(Pichia anomala)已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號CGMCC N0.6840，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2012年11月19日。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0025]1、菌株特征:
[0026]酵母菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落乳白色、圓形或橢圓形，表面隆起，中央無光澤，邊緣光滑整齊，質(zhì)地粘稠，有芳香味。易形成發(fā)達(dá)的的假菌絲。菌體細(xì)胞呈卵圓形，5~7μπιΧ3~5μπι (長X寬)，菌體多芽殖。不形成擲孢子產(chǎn)生。產(chǎn)生圓形子囊，內(nèi)含多個(gè)禮帽形子囊孢子，大小為3.5~4.2 μ mX 1.2~1.8 μ m (見圖1)。在半?yún)捬鯒l件下,酵母菌PA0732-1可發(fā)酵D-葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖和蔗糖，但不能發(fā)酵乳糖。在有氧環(huán)境下，可以同化D-葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-木糖、淀粉、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、甘油、乙醇和山梨醇，不能同化甲醇、乳糖和肌醇。對氮源同化測定，酵母菌PA0732-1可以同化L-賴氨酸鹽酸鹽、硝酸鉀和硫酸銨，但不能同化肌酸。另外，該菌能在42°C生長。耐高滲透壓。利用引物ITSl和引物ITS4的序列分別為5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ PCR擴(kuò)增后，可獲得酵母菌株的ITS-5.8SrDNA片段大小為617bp。所獲序列已提交GenBank，登錄號為EU380207。
[0027]2、菌株培養(yǎng)方法:
[0028](I)PSB培養(yǎng)液的制備:將洗凈后去皮的馬鈴薯切塊，放入1000ml水中，煮沸20~30min,用紗布濾去馬鈴薯,濾液中加入鹿糖20g,攪拌,使糖溶解后補(bǔ)水至1000ml,然后用40%Na0H調(diào)節(jié)溶液pH為7.0。制好的培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，封口后，放入濕熱滅菌器中，121。。(壓力~0.105MPa)滅菌25min，取出冷卻后待用。
[0029](2)菌株活化:將4°C保藏的PA0732-1試管菌株取出，在無菌環(huán)境中(或超凈工作臺內(nèi))用接種環(huán)刮取試管斜面上的菌體少許放入100mlPBS培養(yǎng)液中，封口后，置于28°C，160r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)48小時(shí)后待用。
[0030](4)菌株菌懸液的配制:將活化好的菌株取出后，用無菌水進(jìn)行稀釋，利用紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，使稀釋液中菌株菌體控制在約lX108cfu/ml即可。
[0031](3)發(fā)酵液的制備:在無菌環(huán)境中，將滅菌后的PSB培養(yǎng)液加入容器中，加入量為容器剩余空間體積比與培養(yǎng)液3: 1，按2%的接種量接入~lX108cfu/ml菌種懸浮液，置于26°C，150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)4天。
[0032]3、生產(chǎn)方法
[0033]菌株置于PSB發(fā)酵后所得發(fā)酵液即可使用。
[0034]4、具體實(shí)施案例-------對哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防治應(yīng)用
[0035]實(shí)驗(yàn)材料:[0036](I)病原菌的準(zhǔn)備:將-70°C保存的哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌XJ05-1 (Aac)經(jīng)KBA培養(yǎng)基(配方:蛋白胨20g，甘油10g，磷酸氫二鉀1.5g，七水硫酸鎂1.5g，瓊脂20g，水1000ml, pH7.2)平板上活化(28°C，48h)后，蘸取少量菌體接種于KB培養(yǎng)液(KBA中不加瓊脂即可)中，搖培(28°C，160r/min)48h。利用紫外-可見分光光度計(jì)將菌懸液的濃度調(diào)整到 OD600 ~0.3，即 I X 108cfu/ml 待用。
[0037](2)酵母菌PA0732-1種子處理液的制備:將新培養(yǎng)的酵母菌接種于裝有150mlPSB培養(yǎng)液的三角瓶(V500ml)中，置于26°C，150r/min恒溫振蕩搖培，96h后，取發(fā)酵液備用。
[0038](3)供試種子:哈密瓜品種86-1購自新疆石河子市蔬菜所。
[0039](4)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析:所獲數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute,Cary,NC,USA,Version8.0,1999)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。發(fā)病率和防治效果方差分析前先進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)化。采用Duncan氏新復(fù)極差法比較處理之間的差異顯著性(P=0.05)。
[0040]試驗(yàn)一:帶菌種子處理試驗(yàn)
[0041]將哈密瓜種子浸于I X 108cfu/mlAac菌懸液中，20min后，濾出種子，28°C過夜晾干備用。試驗(yàn)設(shè)置3種處理帶菌哈密瓜種子:A、酵母菌PA0732-1發(fā)酵液出、2%鹽酸&八)；C、0.1%農(nóng)用鏈霉素溶液(g/g)。處理時(shí)間為20min。處理后，除了 A處理不需要清洗外，其他處理需在流水下沖洗3遍，晾干備用。處理后的種子播種于裝有無菌土的營養(yǎng)缽中，底部灌水濕潤土壤后，放于溫室內(nèi)(室溫30~32°C，濕度>85%)，待幼苗長出IOd后，觀察并記錄發(fā)病情況。每處理重復(fù)3次。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。以浸泡過Aac的種子作對照。病情指數(shù)(Disease Index, DI)計(jì)算公式:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一株酵母菌株,菌株代號為PA0732-1,該菌株于2012年11月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.6840。
2.—種權(quán)利要求1所述的酵母菌株P(guān)A0732-1發(fā)酵液的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)酵母菌株P(guān)A0732-1通過PDA培養(yǎng)基或PSA培養(yǎng)基，進(jìn)行菌種培養(yǎng)或活化，PSA培養(yǎng)基配方為:土豆200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000ml, ρΗ6.8~7.0 ; 2)將PSB培養(yǎng)液加入容器中，PSB培養(yǎng)液配方為土豆200g，蔗糖20g，水1000ml，pH7.0，加入量為容器空間體積與培養(yǎng)液體積4: 1，按2%的接種量接入~I X 108cfu/ml菌種懸浮液，置于26°C，150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)4天。
3.權(quán)利要求1所述酵母菌株發(fā)酵液在`防治哈密瓜細(xì)菌性果斑病中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P1/00GK103614306SQ201310389072
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】王曉東, 李國慶, 王春娟, 陳好娟 申請人:石河子大學(xué)