本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種可循環(huán)使用的利用核酸適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換策略調(diào)控石墨烯量子點的聚集狀態(tài)，從而調(diào)控?zé)晒庑盘柕拇銣绾突謴?fù)來檢測微囊藻毒素的方法。

背景技術(shù)：

由水體富營養(yǎng)化引起的藍藻水華污染是當(dāng)前國內(nèi)外普遍關(guān)注的水環(huán)境問題之一。藍藻水華是水體富營養(yǎng)化的一種表現(xiàn)形式，它是指當(dāng)水體處于富營養(yǎng)化狀態(tài)時，藍藻在適宜的光照、溫度、氣候、水文等條件下快速、大量的繁殖或聚集的現(xiàn)象。

微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是藍藻水華過程中產(chǎn)生的一種毒性較強的藍藻毒素，其形成誘因是水體中過量的氮、磷含量。MCs由7種氨基酸組成，種類繁多，分子量為1000Da左右。在眾多的MCs異構(gòu)體中，微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，MC-LR)在藍藻水華時出現(xiàn)的頻率最高、產(chǎn)生量最大、危害最嚴重。MC-LR可通過飲水、直接接觸、血透析、食物鏈累積、誤食攜帶MC-LR的食品等多種途徑被攝入生物體內(nèi)。毒理學(xué)研究表明，MC-LR在生物體內(nèi)主要以肝臟為靶點，造成肝臟功能缺陷。不僅如此，MC-LR還能夠結(jié)合體內(nèi)的谷胱甘肽并形成MC-LR-GSH復(fù)合物，降低細胞內(nèi)GSH濃度，干擾細胞正常的代謝通路，引起細胞凋亡。世界衛(wèi)生組織(WHO)與我國均規(guī)定飲用水中MC-LR的濃度不得高于1.0μg/L。因此，建立一種自來水和湖水中MC-LR的檢測方法有著重要的意義。

適配體作為一種可以和目標(biāo)物進行高特異性結(jié)合的單鏈寡核普酸，和抗體相比，適配體更易于合成和標(biāo)記，穩(wěn)定性和選擇性更好，結(jié)合親和力更高，因此適配體的應(yīng)用越來越廣泛。

常用的檢測微囊藻毒素的方法包括高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、抗體抗原、電化學(xué)方法等。以上檢測方法需要一定的操作過程如復(fù)雜的檢測樣品前處理，同時需較長時間檢測分析微囊藻毒素樣品，而且存在所用檢測的實驗儀器設(shè)備比較復(fù)雜昂貴等問題。而基于核酸適配體構(gòu)建熒光傳感器的方法，受限于傳統(tǒng)熒光染料基團的光穩(wěn)定性差等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可循環(huán)使用的檢測微囊藻毒素尤其微囊藻毒素-LR的熒光傳感器及其制備方法，基于石墨烯量子點在聚集和解聚狀態(tài)下熒光信號的淬滅和恢復(fù)以及核酸適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換策略來快速、簡便的檢測微囊藻毒素如微囊藻毒素-LR。該方法對微囊藻毒素如微囊藻毒素-LR的檢測靈敏度高、特異性好。在一定的濃度范圍內(nèi)(如對微囊藻毒素-LR在0-2ng/mL的濃度范圍內(nèi)，)檢測呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)，以及較低的檢測限，例如微囊藻毒素-LR檢測限為28.33pg/mL，并且可以循環(huán)使用。

一種可循環(huán)使用的微囊藻毒素?zé)晒膺m配體傳感器:在一組石墨烯量子點表面修飾上與微囊藻毒素核酸適配體DNA互補的一種探針DNA1(如微囊藻毒素為微囊藻毒素-LR時，一種探針DNA1可選擇P₁DNA)，在另一組石墨烯量子點表面修飾上與微囊藻毒素核酸適配體DNA互補的另一種探針DNA2(如微囊藻毒素為微囊藻毒素-LR時，另一種探針DNA2可選擇P₂DNA)，然后將兩種石墨烯量子點溶液混合均勻后再加入微囊藻毒素核酸適配體DNA，通過DNA雜交使石墨烯量子點聚集，發(fā)生激子能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致石墨烯量子點熒光信號淬滅；隨后加入微囊藻毒素，微囊藻毒素與核酸適配體DNA特異性結(jié)合，結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，引起石墨烯量子點聚集體解組裝而重新分散，體系熒光強度恢復(fù)。

優(yōu)選兩組石墨烯量子點等量，探針DNA1和探針DNA2等摩爾量。

進一步上述加入微囊藻毒素?zé)晒鈴姸然謴?fù)后，再加入微囊藻毒素核酸適配體DNA，使得石墨烯量子點熒光信號淬滅，然后再加入微囊藻毒素?zé)晒鈴姸然謴?fù)，如此可循環(huán)使用。

上述的微囊藻毒素包括但不限于微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-YR、微囊藻毒素-LA和微囊藻毒素-RR等，只要符合上述條件的均能作為微囊藻毒素的熒光適配體傳感器。不同的微囊藻毒素采用各自對應(yīng)的核酸適配體DNA以及與核酸適配體DNA互補的兩種不同的探針DNA1和DNA2。

本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種可循環(huán)使用的檢測微囊藻毒素的熒光適配體傳感器的應(yīng)用方法，包括以下步驟：

(1)DNA雜交使石墨烯量子點聚集，熒光信號猝滅：首先利用TE緩沖液分別離心溶解粉末狀微囊藻毒素對應(yīng)的適配體DNA以及與適配體DNA互補的兩種不同的探針DNA1和DNA2(如微囊藻毒素為微囊藻毒素-LR時可選擇P₁DNA和P₂DNA)；然后通過水熱法合成出石墨烯量子點，并在兩組石墨烯量子點表面分別修飾與微囊藻毒素核酸適配體DNA互補的兩種不同探針DNA1和DNA2，然后將表面分別修飾有探針DNA1和DNA2的兩種石墨烯量子點溶液混合，再加入微囊藻毒素核酸適配體DNA，通過DNA雜交引起石墨烯量子點發(fā)生聚集，熒光信號猝滅；

(2)微囊藻毒素的熒光檢測：把不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的微囊藻毒素加入到步驟(1)熒光信號淬滅的溶液中，在室溫條件下孵育一段時間，設(shè)定熒光分光光度計激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出不同濃度的微囊藻毒素對應(yīng)的熒光強度，制備出曲線；

(3)熒光檢測微囊藻毒素的方法，步驟如下：把含微囊藻毒素的樣品加入到對應(yīng)的石墨烯量子點熒光信號淬滅溶液中，在室溫條件下孵育一段時間，設(shè)定與步驟(2)一樣的熒光分光光度計激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出微囊藻毒素的熒光強度，根據(jù)步驟(2)微囊藻毒素濃度和熒光強度的關(guān)系曲線，得出待測微囊藻毒素的濃度，進一步計算轉(zhuǎn)換成含微囊藻毒素的樣品中微囊藻毒素的含量。

所述步驟(1)中所述的TE緩沖液優(yōu)選組成為40mMTris,2mM EDTA,pH＝7.4。

所述步驟(1)中如微囊藻毒素為微囊藻毒素-LR時，微囊藻毒素-LR適配體DNA結(jié)構(gòu)優(yōu)選為5’-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3’；互補的探針DNA1結(jié)構(gòu)優(yōu)選為P₁DNA，P₁DNA結(jié)構(gòu)為5’-NH₂-C₆H₁₂-CTGTGACGGTAATT-3’,探針DNA2結(jié)構(gòu)優(yōu)選為P₂DNA，P₂DNA結(jié)構(gòu)為5’-TGGTATGGTCACAG-C₆H₁₂-NH₂-3’,(均可購自上海Sangon生物技術(shù)有限公司合成并分裝的)，使用前加入緩沖液離心溶解，離心速度優(yōu)選為10000rpm，時間10min。

優(yōu)選步驟(2)熒光分光光度計激發(fā)發(fā)射波長為315nm，入射發(fā)射狹縫為5.0nm，發(fā)射譜檢測范圍為375-600nm。微囊藻毒素-LR的標(biāo)準(zhǔn)濃度為0-80ng/mL。

所述步驟(1)中DNA雜交使石墨烯量子點聚集、熒光信號猝滅的方法，步驟如下：合成出的石墨烯量子點溶液，然后加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)一段時間后，分別加入兩種探針DNA1溶液和DNA2溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，再反應(yīng)一段時間；將修飾有兩種探針的石墨烯量子點溶液混合，然后再加入微囊藻毒素適配體DNA，在室溫下混合均勻，孵育一段時間,使石墨烯量子點發(fā)生聚集,體系熒光信號猝滅；

進一步優(yōu)選：合成出0.1mg/mL的石墨烯量子點溶液，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)30min后，均分裝在兩個容器中，分別加入與微囊藻毒素適配體DNA溶液互補的探針DNA1溶液和DNA2溶液(P₁DNA溶液和P₂DNA溶液)，然后將修飾有兩種探針的石墨烯量子點溶液混合，然后再加入微囊藻毒素適配體DNA溶液，在室溫下混合均勻，孵育一段時間,使石墨烯量子點發(fā)生聚集,體系熒光信號猝滅；

與微囊藻毒素適配體DNA溶液互補的兩種探針溶液以及適配體DNA溶液濃度均為100μM，石墨烯量子點溶液：N-羥基琥珀酰亞胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽：與適配體DNA互補的探針DNA1溶液：DNA2溶液為10mL：(20-25)mg：(18-20mg)：24μL：24μL。

本發(fā)明中，采用水熱法合成了分散性良好、粒徑均勻的石墨烯量子點，并在其表面分別修飾上與微囊藻毒素(如微囊藻毒素-LR)核酸適配體DNA互補的短鏈探針DNA(P₁DNA和P₂DNA)，將這兩種石墨烯量子點進行混合，再加入微囊藻毒素核酸適配體DNA，通過DNA雜交使石墨烯量子點聚集，發(fā)生激子能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致石墨烯量子點熒光信號淬滅；隨后加入目標(biāo)檢測物微囊藻毒素(如微囊藻毒素-LR)，其與核酸適配體DNA特異性結(jié)合，結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，與短鏈探針DNA脫離，引起石墨烯量子點聚集體解組裝而重新分散，體系熒光強度恢復(fù)。

本發(fā)明所述的可循環(huán)使用的用于檢測微囊藻毒素(如微囊藻毒素-LR)的熒光傳感器的制備方法，過程簡單易行、綠色環(huán)保、成本低、靈敏度高、特異性好，循環(huán)效果好，并成功用于實際自來水和奧林匹克公園湖水樣品中微囊藻毒素-LR的加標(biāo)回收。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的基于適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)石墨烯量子點由聚集到分散的熒光化學(xué)傳感器對微囊藻毒素檢測的示意圖；

圖2為實施例1加入不同濃度微囊藻毒素-LR后體系熒光強度發(fā)射曲線；

圖3根據(jù)實施例1不同微囊藻毒素-LR濃度和熒光強度對應(yīng)關(guān)系繪制的擬合曲線；

圖4為本發(fā)明所述的熒光化學(xué)傳感器檢測微囊藻毒素循環(huán)五次后的效果圖；

圖5為實施例1同一濃度不同底物下的特異性柱狀圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明書，但本發(fā)明并不限于以下實施例。

實施例1

一種可循環(huán)使用的檢測微囊藻毒素-LR的熒光適體傳感器：

(1)DNA雜交使石墨烯量子點聚集，熒光信號猝滅：首先利用TE緩沖液分別離心溶解粉末狀微囊藻毒素-LR對應(yīng)的適配體DNA以及與適配體DNA互補的探針DNA(P₁DNA和P₂DNA)；然后通過水熱法合成出石墨烯量子點，并在石墨烯量子點表面分別修飾P₁DNA和P₂DNA，然后將兩種石墨烯量子點溶液混合，加入微囊藻毒素-LR對應(yīng)的適配體DNA，通過DNA雜交引起石墨烯量子點發(fā)生聚集，熒光信號猝滅；

(2)微囊藻毒素-LR熒光檢測：把不同濃度的微囊藻毒素-LR加入到淬滅溶液中，在室溫條件下孵育1h，設(shè)定熒光分光光度計激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出不同濃度的微囊藻毒素-LR的熒光強度，根據(jù)不同濃度的微囊藻毒素-LR的熒光強度，擬合出公式y(tǒng)＝1.023+0.72x，其中y為最終體系熒光強度與最初體系熒光強度的比值，x為微囊藻毒素-LR的濃度。

TE緩沖液pH 7.4、緩沖液組成為40mMTris,2mM EDTA；微囊藻毒素-LR適配體DNA結(jié)構(gòu)為5’-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3’；P₁DNA結(jié)構(gòu)為5’-NH₂-C₆H₁₂-CTGTGACGGTAATT-3’,P₂DNA結(jié)構(gòu)為5’-TGGTATGGTCACAG-C₆H₁₂-NH₂-3’,由上海Sangon生物技術(shù)有限公司合成并分裝。使用前加入緩沖液離心溶解，離心速度為10000rpm，時間10min。熒光分光光度計激發(fā)發(fā)射波長為315nm，入射發(fā)射狹縫為5.0nm，發(fā)射譜檢測范圍為375-600nm，微囊藻毒素-LR的濃度為0-80ng/mL。

所述的石墨烯量子點修飾探針DNA的方法，具體步驟如下：10mL合成出的石墨烯量子點溶液(0.1mg/mL)，加入N-羥基琥珀酰亞胺22mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽19mg，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)30min后，分裝在兩個燒瓶中，均為5mL，分別加入探針P₁DNA和P₂DNA溶液(兩種探針溶液濃度均為100μM)，體積均為24μL，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，反應(yīng)2h。將修飾有兩種探針的石墨烯量子點溶液混合，然后再加入微囊藻毒素-LR適配體DNA，在室溫下混合均勻，孵育一段時間,使石墨烯量子點發(fā)生聚集,體系熒光信號猝滅；

所述的檢測微囊藻毒素-LR的方法，它的步驟如下：把含微囊藻毒素-LR樣品加入到淬滅溶液中，在室溫條件下孵育1h，設(shè)定熒光分光光度計激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取400uL孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出微囊藻毒素-LR的熒光強度，擬合出公式y(tǒng)＝1.023+0.72x，其中y為最終體系熒光強度與最初體系熒光強度的比值，x為微囊藻毒素-LR的濃度，最終得出微囊藻毒素-LR的濃度。

1.原理驗證及相關(guān)性實驗

實驗原理如圖1所示，當(dāng)將短鏈探針P₁DNA和P₂DNA修飾的石墨烯量子點P₁DNA-GQDs和P₁DNA-GQDs混合之后，加入微囊藻毒素-LR對應(yīng)的適配體DNA，通過DNA的雜交使得石墨烯量子點聚集，發(fā)生激子能量轉(zhuǎn)移，從而使石墨烯量子點的熒光信號猝滅。而后加入目標(biāo)檢測物微囊藻毒素，其與核酸適配體DNA特異性結(jié)合，適配體DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，與短鏈探針DNA脫離，引起石墨烯量子點聚集體解組裝而重新分散，體系熒光強度恢復(fù)。當(dāng)向體系中再次加入微囊藻毒素-LR適配體DNA，石墨烯量子點有能夠重新聚集，熒光信號猝滅，而后加入目標(biāo)檢測物微囊藻毒素，體系熒光強度又發(fā)生恢復(fù)，如此循環(huán)檢測微囊藻毒素。

2.石墨烯量子點修飾與微囊藻毒素-LR適配體DNA互補的探針P₁DNA和P₂DNA，具體步驟如下：10mL合成出的石墨烯量子點溶液(0.1mg/mL)，加入N-羥基琥珀酰亞胺22mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽19mg，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)30min后，分裝在兩個燒瓶中，均為5mL，分別加入與微囊藻毒素-LR適配體DNA互補的探針P₁DNA和P₂DNA，體積均為24μL，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，反應(yīng)2h。

3.微囊藻毒素-LR檢測實驗，具體實驗步驟如下:

A:取0.25ml的P₁DNA-GQDs溶液和等體積的P₂DNA-GQDs溶液混合，再加入微囊藻毒素-LR適配體DNA，在室溫下混合均勻，孵育1h,使石墨烯量子點發(fā)生聚集,體系熒光信號猝滅；

B:取0.5mL完全猝滅的石墨烯量子點,加入不同濃度微囊藻毒素-LR，濃度分別為0ng/mL,0.05ng/mL,0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,40ng/mL,60ng/mL,80ng/mL,室溫下混合均勻，孵育1h后檢測體系的熒光強度。

設(shè)定光熒光分光光度計激發(fā)波長315nm，入射發(fā)射狹縫均為5nm，發(fā)射波長檢測范圍為375-600nm，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出不同濃度的微囊藻毒素-LR的熒光強度，結(jié)果見附圖2。根據(jù)不同濃度的微囊藻毒素-LR的熒光強度，在發(fā)射波長433nm處，根據(jù)不同微囊藻毒素-LR濃度和相對熒光強度對應(yīng)關(guān)系繪制曲線，結(jié)果見附圖3。

4.傳感器循環(huán)性能

本發(fā)明對所述的熒光傳感器檢測微囊藻毒素的循環(huán)性能進行了表征，在完全猝滅的體系中加入80ng/mL的微囊藻毒素，熒光恢復(fù)；再加入80nM的微囊藻毒素適配體DNA，熒光猝滅；如此循環(huán)5次后，傳感器任表現(xiàn)出優(yōu)良的檢測和循環(huán)性能。表明本發(fā)明所設(shè)計的熒光傳感器是可以循環(huán)重復(fù)使用的。

5.實驗條件優(yōu)化

本發(fā)明分別對實驗中石墨烯量子點熒光猝滅和恢復(fù)時間進行了優(yōu)化，在等體積的P₁DNA-GQDs溶液和P₂DNA-GQDs溶液混合均勻后，加入微囊藻毒素-LR核酸適配體DNA后，設(shè)計了孵育時間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min后檢測反應(yīng)液熒光強度；通過實驗結(jié)果分析本發(fā)明選擇最優(yōu)實驗條件：熒光猝滅時間為30min，熒光恢復(fù)時間為20min。

6.特異性實驗

在淬滅溶液中，加入80ng/mL的微囊藻毒素-LR以及相同濃度的微囊藻毒素-LA，微囊藻毒素-YR,赭曲霉素A，赭曲霉素B和黃曲霉毒素B1，在設(shè)定條件下檢測反應(yīng)溶液中熒光強度。其結(jié)果如圖4,可以看出本發(fā)明特異性很好。

7.實際自來水和奧林匹克公園湖水樣品中微囊藻毒素-LR的加標(biāo)回收

將微囊藻毒素-LR樣品加入到稀釋為5％的自來水和奧林匹克公園湖水樣品中，濃度分別為0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL。測定微囊藻毒素-LR的熒光強度，根據(jù)公式y(tǒng)＝1.023+0.72x，其中y為最終體系熒光強度與最初體系熒光強度的比值，x為微囊藻毒素-LR的濃度，計算得出微囊藻毒素-LR的濃度并與實際加入濃度進行對比分析，結(jié)果如表1所示，從表中可以看出，該傳感器的回收率處于97％-104.2％的合理范圍內(nèi)，表明該方法在實際樣品操作中具有很好的準(zhǔn)確度和可操作性。

表1為本發(fā)明所述的熒光傳感器在實際自來水和奧林匹克公園湖水樣品中的加標(biāo)回收應(yīng)用；

表1