一種稻瘟病抗性基因Pita的分子標記和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種稻瘟病抗性基因的分子標記和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]稻瘟病是造成水稻嚴重減產(chǎn)的主要病害之一，每年因稻瘟病導(dǎo)致的生產(chǎn)損失約占總產(chǎn)量的10?15%。目前，發(fā)掘廣譜稻瘟病抗性基因或主效QTL，通過聚合育種，培育廣譜持久抗病的水稻品種是控制稻瘟病的主要措施。因此，稻瘟病抗性基因的檢測以及稻瘟病抗性水稻種質(zhì)篩選就顯得尤為重要。
[0003]基因是目前已克隆的具廣譜抗性的水稻稻瘟病抗性基因，位于水稻第12染色體近著絲點區(qū)，包含2個外顯子和I個1463 bp的內(nèi)含子，編碼I個長度為928個氨基酸的胞質(zhì)受體蛋白。位點上的抗、感兩種等位基因的編碼產(chǎn)物僅有一個氨基酸的差異，即第918氨基酸由抗病產(chǎn)物的丙氨酸變異為感病產(chǎn)物的絲氨酸，是由單個SNP (G/T)的變異造成的。
[0004]目前對于SNP的檢測技術(shù)主要有限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、裂解擴增多態(tài)性序列分析(cLeaved ampLified poLymorphic sequence anaLysis，CAPS)、寡核苷酸連接分析(OLA)或者擴增產(chǎn)物測序等方法。但由于這些標記穩(wěn)定性、檢測效率、成本上具有較大的局限性，例如CAPS需進行PCR擴增、酶切、電泳分離酶切片段，造成檢測費時且成本較尚O
[0005]四引物擴增受阻突變體系PCR (ARMS-PCR)能夠針對SNP位點進行特異等位擴增；針對已知的變異位點，于兩側(cè)分別設(shè)計I對外引物和I對特異性內(nèi)引物，特異性內(nèi)引物3’末端堿基必須落在突變點的位置上，從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。在同一次擴增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴增片段長度不同，通過產(chǎn)物片段分離的特定條帶的有無判別個體的基因型，ARMS-PCR是一種共顯性分型技術(shù)，具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺陷，提供一種稻瘟病抗性基因的分子標記。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子標記在鑒定稻瘟病抗性基因基因型或/和水稻能否抗稻瘟病中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供上述分子標記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供利用上述分子標記鑒定稻瘟病抗性基因基因型的方法。
[0010]本發(fā)明的第五個目的是提供利用上述分子標記鑒定水稻能否抗稻瘟病或同時鑒定稻瘟病抗性基因Pitam因型和水稻能否抗稻瘟病的方法。
[0011]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的:
一種水稻稻瘟病抗性基因/7Zia的分子標記Pita-G/T，所述分子標記由一對外引物Pita-O-F、Pita-O-R 和一對內(nèi)引物 Pita-T-F、Pita-C-R 組成，引物序列如 SEQ ID NO:1 ?4所示。
[0012]本發(fā)明上述分子標記是針對基因編碼區(qū)第918氨基酸的存在一個G/T的SNP變異設(shè)計、篩選后獲得，其中，Pita-T-F、Pita-G-R的3’端第3個堿基引入錯配堿基。
[0013]本發(fā)明還提供了上述分子標記在鑒定稻瘟病抗性基因基因型或/和水稻能否抗稻瘟病中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還提供了上述分子標記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明還提供了利用上述分子標記鑒定稻瘟病抗性基因基因型的方法，具體地，包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提??；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標記進行PCR擴增；
S3分析PCR擴增后的產(chǎn)物，進行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)202bp和309bp條帶，則表明待測樣品的Z7Zia為抗病基因型；若出現(xiàn)156bp和309bp條帶，則表明待測樣品的Pi ia為感病基因型；若出現(xiàn)156bp、202bp和309bp條帶，則表明待測樣品的Pi ia為雜合型。
[0016]本發(fā)明還提供了利用上述分子標記鑒定水稻能否抗稻瘟病或同時鑒定稻瘟病抗性基因基因型和水稻能否抗稻瘟病的方法，具體地，包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提??；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標記進行PCR擴增；
S3分析PCR擴增后的產(chǎn)物，進行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)202bp和309bp條帶，則表明待測樣品的為抗病基因型，待測樣品為抗稻瘟病品種；若出現(xiàn)156bp和309bp條帶，則表明待測樣品的為感病基因型，待測樣品為感稻瘟病品種；若出現(xiàn)156bp、202bp和309bp條帶，則表明待測樣品的Z7Zia為雜合型，待測樣品為感稻瘟病菌品種。
[0017]優(yōu)選地，所述PCR 反應(yīng)體系為:DNA 模板 1.0 uL、Pita_T_F 0.3 uL、Pita_G_R 0.3uL、Pita-0_F 0.3 uL、Pita-0_R 0.3 uL、2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL，其余由雙蒸滅菌水補足15uL。
[0018]優(yōu)選地，所述反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min，94°C 30sec，57°C 30sec，72°C35sec共運行33個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明基于ARMS-PCR原理，設(shè)計開發(fā)了一種擴增片段適中、特異性強的水稻稻瘟病抗性基因的分子標記，利用該標記鑒定水稻稻瘟病抗性基因基因型，不需要經(jīng)過測序，僅僅通過簡單的PCR即可對水稻稻瘟病抗性基因進行基因分型，區(qū)分抗稻瘟病菌水稻品種和感病品種，實現(xiàn)了對水稻稻瘟病的分子標記輔助選擇，本發(fā)明所述分子標記可提高基因的檢測效率，適合用于水稻改良分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說明】
[0020]圖1為功能性標記Pita-G/T引物設(shè)計示意圖；其中等位變異位點分別以紅色背景標識，弓I物錯配堿基以下劃線標識。
[0021]圖2為功能性標記Pita-G/T擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分型；其中，1:明恢63 ；2:勝巴絲苗；3:航恢七號；4:勝巴絲苗/航恢七號；5:廣恢998 ;6:日本晴；7:華占。
[0022]圖3為功能標記Pita-G/T聯(lián)合全自動毛細管電泳檢測結(jié)果，其中M:DNA Ladder ；
I?47 為檢測水稻材料，3、6、9、14、16 ?18、21_22、24 ?25,28 ?30、34、40、42 ?43,45 ?
46:G/G 型；I ?2，4 ?5、7 ?8、10、12 ?13、15、19 ?20、23、26 ?27、31 ?33、35 ?39、41、44、47:T/T 型；11:G/T 型。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024]實施例1水稻基因功能性標記Pita-G/T的引物設(shè)計及擴增片段分析 1、引物設(shè)計
通過對水稻稻瘟病抗性基因/7Zia在不同水稻品種中，抗病、感病兩種等位基因的序列比較，分析得到抗病和感病兩種等位基因在編碼區(qū)第918氨基酸的位置存在一個G/T的SNP變異，設(shè)計涵蓋差異位點的功能標記Pita-G/T (圖1)。所述的Pita-G/T由4個引物Pita-T-F、Pita-G-R、Pita-O-F 和 Pita-O-R 構(gòu)成，引物序列(5，_3，)如下:
Pita-T-F:TCTGCCGTGGCTTCTATCTTTACTTTPita-G-R:AAGTCAGGTTGAAGATGCATGGCPita-O-F:CTCTTATGGTTGATATACAATGGGTGGAPita-O-R:ACCTCTACTCTGAAGACGTGAAGAGGA
引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯配堿基，加框的堿基為要檢測的變異堿基。
[0025]2、擴增片段分析
用這四個引物對水稻基因進行擴增，抗病等位基因(G/G純合型)、感病等位基因(T/T純合型)和雜合型(G/T雜合型)，都能利用Pita-O-F和Pita-O-R擴增出大小約為309bp的條帶，此帶可以用于PCR擴增與否的監(jiān)測。此外，抗病等位基因(G/G純合型)還能利用Pita-G-R和Pita-O-F擴增出一條202 bp的條帶；感病等位基因(T/T純合型)能利用Pita-T-F和Pita-O-R擴增出一條156 bp的條帶；雜合型(G/T雜合型)既能擴增出202 bp的條帶又能擴增出156 bp的條帶。
[0026]實施例2水稻基因功能性標記Pita-G/T鑒定7個水稻的抗病基因型 1、水稻基因組DNA的提取
以7個水稻品種為材料:明恢63、勝巴絲苗、航恢七號、廣恢998、日本晴、華占和勝巴絲苗/航恢七號。選取水稻單株嫩葉，采用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下:(1)取適量新鮮葉片放在2 mL離心管中加液氮搗碎，向離心管中加入I mL CTAB抽提液，搖勻；(2)置于65°C的水浴鍋或恒溫箱，每隔1min輕輕搖動一次，30?45min后取出；(3)冷卻
2min后，加入氯仿-異戊醇(24:1)至滿管，上下劇烈搖動，使兩者混合均勻；(4)離心管放入離心機中15,000 r/min離心10 min后取出；(5)小心吸取上清液至新的滅菌離心管中，然后加入600 μ L預(yù)冷的異丙醇，上下輕輕搖動，使異丙醇與水層充分混合；(6)_20°C放置20 min，使DNA充分沉淀；(7)10，000 r/min瞬間離心，立即倒掉液體，再將離心管倒立于鋪開的紙巾上；(8) Imin后直立離心管，加入720 μ L 70%的乙醇及80 μ L 3Μ NaAc溶液，輕輕搖動，用手指輕彈管尖，使DNA沉淀浮游于液體中；(9)至少放置30min，使雜質(zhì)充分溶解；(10)10，000 r/min瞬間離心，立即倒掉液體，加入800 μ L 70%的乙醇將DNA再次漂洗20?30min ； (11) 15, 000 r/min離心3?5m