一種透明質(zhì)酸酶編碼基因及其發(fā)酵生產(chǎn)和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了透明質(zhì)酸酶基因，其核苷酸序列如（a）或（b）或（c）所示：（a）核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；（b）在（a）中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)核苷酸或幾個(gè)核苷酸且具有透明質(zhì)酸酶活性的基因；（c）與（a）中氨基酸序列整體相似度在85%以上，具有透明質(zhì)酸酶活性的基因。本發(fā)明通過(guò)采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)所獲得的水蛭透明質(zhì)酸酶的高效異源表達(dá)及其純化。本發(fā)明重組制備的水蛭透明質(zhì)酸酶產(chǎn)物屬于藥理活性化合物，可以用于治療腦、心血管疾病、眼科疾病、抗腫瘤和藥物擴(kuò)散劑等醫(yī)療領(lǐng)域。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶的工業(yè)化制備生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種透明質(zhì)酸酶編碼基因及其發(fā)酵生產(chǎn)和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸酶基因及其發(fā)酵生產(chǎn)和純化方法，特別是一種來(lái)源于水蛭的透明質(zhì)酸酶基因，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸酶于1928年被Duran Reynals發(fā)現(xiàn)并稱為擴(kuò)散因子，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase, HAase)。透明質(zhì)酸酶廣泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明質(zhì)酸，是一種重要的生理活性物質(zhì)。根據(jù)透明質(zhì)酸酶作用的底物特異性和催化機(jī)制，將其分為三類。第一類是來(lái)源于哺乳動(dòng)物的透明質(zhì)酸4-糖基水解酶家族，這類透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.35)是具有水解和轉(zhuǎn)糖苷活性的糖苷酶，通過(guò)水解透明質(zhì)酸(HA)的β-1、4-糖苷鍵，產(chǎn)物以四糖透明質(zhì)酸分子為主。也可作用于硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素產(chǎn)生硫酸皮膚素產(chǎn)物。第一類中比較常見的有來(lái)自于哺乳動(dòng)物的睪丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌體的透明質(zhì)酸酶。第二類為微生物透明質(zhì)酸酶，這類透明質(zhì)酸酶(EC4.2.2.1)通過(guò)β -消除反應(yīng)裂解HA的β -糖苷鍵，產(chǎn)生以不飽和的雙糖分子2_acetamido-2-deoxy-3-0- ( β -D-gluco-4-enepyranosyluronic acid) -D-glucose 為主要產(chǎn)物。這類透明質(zhì)酸裂解酶來(lái)源于包括 Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, andStrePtomyces等菌株，并且它們的底物特異性也不同。第三類代表性的透明質(zhì)酸酶主要來(lái)源于水蛭，這類水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.36)屬于透明質(zhì)酸3-糖基水解酶家族，通過(guò)水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產(chǎn)以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產(chǎn)物。水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶對(duì)底物的專一性強(qiáng)，對(duì)硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉(zhuǎn)糖苷活性。
[0003]透明質(zhì)酸酶主要水解透明質(zhì)酸，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞間的連接、生殖細(xì)胞的活動(dòng)、DNA的轉(zhuǎn)染、胚胎發(fā)育、受傷組織的修復(fù)，以及正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增生。許多病理變化過(guò)程往往伴隨著透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸的變化，暗示它們可能起著重要的作用。同時(shí)透明質(zhì)酸酶也可以改變機(jī)體內(nèi)一些藥物和生理活性物質(zhì)的分布狀況。
[0004]透明質(zhì)酸水解酶作為一種藥理活性物質(zhì)在臨床上具有比較廣泛的用途。透明質(zhì)酸酶能夠降解心肌透明質(zhì)酸，顯著減少間隙體積，阻止由缺血引起的動(dòng)脈阻力增大，增加血流量。WaidenstrSin A等人對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗塞區(qū)的含水量顯著增高與HA的積累強(qiáng)烈相關(guān)。相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)也證實(shí)透明質(zhì)酸酶對(duì)治療心肌梗塞效果顯著。另外，透明質(zhì)酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作用，惡性組織經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細(xì)胞結(jié)合更多的抗癌藥物。如它可以加強(qiáng)阿霉素對(duì)乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的復(fù)發(fā)率等。此外，透明質(zhì)酸酶在臨床上也作為藥物擴(kuò)散助劑，眼科手術(shù)后用于降低眼內(nèi)壓，與麻醉劑利多卡因鹽酸鹽配合使用，可加快進(jìn)入麻醉狀態(tài)和延長(zhǎng)麻醉時(shí)間。
[0005]水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶由于其底物專一性強(qiáng)，與其它來(lái)源的透明質(zhì)酸酶相比，它不能降解軟骨素或硫酸軟骨素，活性不受肝素影響。因此，理論上來(lái)講，水蛭透明質(zhì)酸酶用于臨床藥用更具醫(yī)療價(jià)值意義。1941年Hirst首次證實(shí)水蛭透明質(zhì)酸酶強(qiáng)有力的抗菌性。水蛭透明質(zhì)酸酶能溶解體內(nèi)和體外細(xì)菌被膜并形成抗體，從而使宿主獲得很好的藥物治療效果。雖然哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶作為“擴(kuò)散因子”被廣泛應(yīng)用于藥物擴(kuò)散助劑，然而這類透明質(zhì)酸酶活性易受肝素抑制。相比水蛭透明質(zhì)酸酶活性不受肝素影響，在臨床上作為“藥物擴(kuò)散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更大的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]目前，尚無(wú)水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶基因的相關(guān)報(bào)道。水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶是以活體水蛭組織進(jìn)行提取為主獲得，且每個(gè)水蛭提取所獲得透明質(zhì)酸酶僅約為230U。水蛭原料的來(lái)源和提取分離步驟的繁瑣等因素都極大的限制了水蛭透明質(zhì)酸酶在醫(yī)療和科研上的廣泛應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組微生物工程菌株高效生產(chǎn)制備純化水蛭透明質(zhì)酸酶的方法，打破了水蛭透明質(zhì)酸酶的活體水蛭提取純化的瓶頸。對(duì)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和醫(yī)療科研應(yīng)用水蛭透明質(zhì)酸酶奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提 供了一種透明質(zhì)酸酶基因，核苷酸序列如如(a)或(b)或(C)所示: [0008]Ca)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0009](b)在(a)中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)核苷酸或幾個(gè)核苷酸且具有透明質(zhì)酸酶活性的基因；
[0010](C)與(a)中氨基酸序列整體相似度在85%以上，具有透明質(zhì)酸酶活性的基因。
[0011]所述透明質(zhì)酸酶基因編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或其保守性變異多肽。
[0012]含有權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0013]本發(fā)明要還提供了一種表達(dá)上述透明質(zhì)酸酶基因的方法，具體步驟如下:以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母為生產(chǎn)菌株，使用BMGY培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶。
[0014]所述畢赤酵母為GS115，具體為以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-HaseA3887為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵條件為:將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到25ml (搖瓶容量250ml )BMGY培養(yǎng)基中，溫度為30°C、pH為6.0培養(yǎng)至0D600為4，更換誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，添加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔24h補(bǔ)加一次甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)96h。
7、權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所示透明質(zhì)酸酶的純化條件為:采用二乙氨乙基纖維素柱(DEAE-ellulose)進(jìn)行離子交換，分別用pH6.5,6.0的雙甘氨肽緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以pH5.6、50mM的乙酸鹽緩沖液特異性洗脫目標(biāo)蛋白。
[0015]透明質(zhì)酸酶活性分別采用平板檢測(cè)法和CTAB濁度檢測(cè)法進(jìn)行鑒定，發(fā)酵液比活采用DNS還原糖測(cè)定法。
[0016]本發(fā)明成功從野生水蛭中克隆獲得透明質(zhì)酸酶全長(zhǎng)基因，并實(shí)現(xiàn)利用重組畢赤酵母，異源高效表達(dá)透明質(zhì)酸酶及其純化制備的方法。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶的工業(yè)化制備生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:[0017]圖1為重組透明質(zhì)酸酶的蛋白純化SDS-PAGE電泳結(jié)果(M，蛋白marker ;1，pPIC9k-GS115對(duì)照發(fā)酵液上清；2，重組HaseA3887-pPIC9K發(fā)酵液上清；3，純化的重組透明質(zhì)酸酶蛋白)。
[0018]圖2為平板法鑒定發(fā)酵液產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的活性(A3887-1和A3887-2為兩個(gè)重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液，pPIC9k-GS115為不含重組基因的空白對(duì)照發(fā)酵液)。
[0019]圖3為濁度法快速簡(jiǎn)便的鑒定透明質(zhì)酸酶的活性。(A3887-1和A3887-2為兩個(gè)重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液，pPIC9k-GS115為不含重組基因的空白對(duì)照發(fā)酵液)
[0020]圖4為兩個(gè)重組HaseA3887-pPIC9K_GS115克隆搖瓶發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的粗酶液比活。
【具體實(shí)施方式】
[0021]材料與方法
[0022]透明質(zhì)酸酶活力單位定義:在ρΗ5.5和38°C下，每小時(shí)從透明質(zhì)酸中釋放Iug葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0023]平板透明圈法和CTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)池度法檢測(cè)透明質(zhì)酸酶活性:透明質(zhì)酸為大分子聚多糖，在一定濃度的表面活性劑水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不會(huì)被沉淀析出。利用這一原理可以快速簡(jiǎn)便的鑒定透明質(zhì)酸酶活性。
[0024]DNS還原糖測(cè)定方法:水蛭透明質(zhì)酸酶水解HA，通過(guò)降解β -1,3-糖苷鍵，產(chǎn)生帶有還原端羥基的還原糖產(chǎn)物。通`過(guò)DNS還原糖法測(cè)定水解HA產(chǎn)生的相對(duì)于葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖產(chǎn)物的產(chǎn)生量，來(lái)計(jì)算酶比活力。
[0025]實(shí)施例1:野生水蛭RNA提取
[0026]取活體水蛭一條，剪取頭部組織約lOOmg，迅速液氮冷凍。用液氮研磨的方法將組織充分磨碎，采用組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒(杭州寶賽生物科技有限公司)進(jìn)行提取。加入Iml的裂解液,迅速渦旋混勻使細(xì)胞裂解充分及RNA酶滅活,室溫孵育放置2min。加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻使樣品變?yōu)槿榘咨胖?-3min。以12000rpm在4°C離心lOmin，樣品分三層，將上層含RNA的水相轉(zhuǎn)移置一新管中。加入1/2體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻后全部轉(zhuǎn)入吸附柱，以12000rpm在4°C離心lmin。棄掉濾液,再加入500 μ I去蛋白液，以12000rpm在4°C離心lmin,棄掉濾液。加入600 μ I的漂洗液，以12000rpm在4V離心lmin,棄掉濾液,該步驟重復(fù)一次。棄掉濾液后,再以12000rpm在4°C離心2min,室溫靜置幾分鐘以去除干凈乙醇，將吸附管套至一新管，加入50 μ I預(yù)熱的RNA-Free的ddH20，室溫靜置2min，以12000rpm在4°C離心lmin，收集RNA，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]實(shí)施例2:反轉(zhuǎn)錄制備cDNA
[0028]反轉(zhuǎn)錄cDNA制備采用的是M-MLV First Strand RT kit (杭州寶賽生物科技有限公司)。以提取的水蛭RNA為模板，按下述(20 μ I)體系配置反應(yīng)混合物:5 XFirst-Strandbuffer,4 μ I ；01igo(dT) 18Primer(50 μ Μ)，I μ I; IOmM dNTP, I μ I;RNase Inhibitor(40U/μ I), Iu l；M-MLV(200U/y 1),1μ 1;RNA, 12 μ I。將該反應(yīng)體系置于 PCR 儀 50°C 反應(yīng) lh。再70°C加熱IOmin終止反應(yīng)。置于冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-80°C保存。
[0029]實(shí)施例3:水蛭透明質(zhì)酶基因的獲取[0030]通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Expressed sequence tags (EST)中的水蛭EST搜索分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不完整的mRNA基因(GenBank: JZ186329.1和GenBank:FP652258.1)類似肝素酶基因(同源性低于40%)，通過(guò)進(jìn)一步與其他透明質(zhì)酸酶進(jìn)行比較，初步確認(rèn)這兩條不完整的mRNA序列為水蛭透明質(zhì)酸酶序列。根據(jù)這兩條序列在靠近5端設(shè)計(jì)兩條簡(jiǎn)并引物(EST1:CTGGTGMYCACRTAACYGCTTTTAC ；EST2:TCAACATACCTTGAYGCYffCffTA)。簡(jiǎn)并引物分別作為上游引物，下游引物為Oligo(ClT)18，以實(shí)施例2中制備的cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段。經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得以引物ESTl Oligo (dT) 18擴(kuò)增的約900bp的目標(biāo)片段?；厥漳繕?biāo)片段，連接PMD19克隆載體并測(cè)序，經(jīng)比對(duì)與EST庫(kù)中的兩條序列同源性達(dá)到80%以上。再根據(jù)測(cè)序獲得的序列，從5端設(shè)計(jì)合成一條反向引物,采用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒，按操作說(shuō)明擴(kuò)增該片段的上游未知序列。擴(kuò)增獲得的片段進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，與之前的下游片段進(jìn)行拼接，分析比對(duì)找到一個(gè)1470bp的0RF，根據(jù)這個(gè)ORF序列，設(shè)計(jì)上下游引物，以cDNA為模板，進(jìn)行目標(biāo)序列全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)片段大小的序列進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確，獲取的透明質(zhì)酸酶基因命名為HaseA3887。 [0031]實(shí)施例4:含透明質(zhì)酸酶基因(HaseA3887)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
[0032]根據(jù)實(shí)施例3中獲取的本發(fā)明透明質(zhì)酸酶HaseA3887全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，(A3887BYF:CCGGAATTCATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTGAC ；A3887BYR:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC)。在上下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(本發(fā)明中所述表達(dá)載體為PPIC9K，根據(jù)此載體選取上游酶切位點(diǎn)為EcoR I，下游為Not I)。使用含本發(fā)明中所述的透明質(zhì)酸酶A3887基因序列的質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增獲得的透明質(zhì)酸酶核苷酸片段進(jìn)行雙酶切，連接至具有相對(duì)應(yīng)切口的表達(dá)載體上(載體PPIC9K經(jīng)EcoR1、Not I雙酶切)，轉(zhuǎn)化至E.coil DH5a中，在確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達(dá)質(zhì)粒HaseA3887-pPIC9K，經(jīng)DNA測(cè)序比對(duì)，重組序列正確。HaseA3887_pPIC9K重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化后電轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主P.pastoris GSl 15中，重組克隆子經(jīng)PCR驗(yàn)證正確。
[0033]實(shí)施例5:重組畢赤酵母異源表達(dá)透明質(zhì)酸酶
[0034]驗(yàn)證正確的重組A3887克隆子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)。單克隆接種于5ml的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30°C、200rpm培養(yǎng)16h。按10%的接種量轉(zhuǎn)接于100ml的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMGY (配1L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,加水至890mL, 121 °C滅菌20分鐘，然后待溫度降至60°C以后在超凈臺(tái)上加入 IO X YNBI OOmL (13.4g/L), 500 X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甘油 IOmL),30°C 200rpm培養(yǎng)至OD6tltl值為2_5之間，離心收集菌體，更換至100ml誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY(酵母提取物 10g/L，蛋白胨 20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,加水至 895mL，121°C滅菌20分鐘，然后待溫度降至60°C以后在超凈臺(tái)上加入100 X YNBlOOmL (13.4g/L)，500 X生物素lmL(4Xl(T4g/L)，甲醇5mL)。30°C 200rpm培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5~1.0%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)96h。重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液與對(duì)照菌發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖1所示，泳道I為對(duì)照發(fā)酵液，泳道2為重組酶發(fā)酵液，經(jīng)比較分析，確定在箭頭標(biāo)示的位置為重組酶的表達(dá)蛋白。
[0035]實(shí)施例6:重組生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的活性檢測(cè)搖瓶發(fā)酵液酶活測(cè)定
[0036]根據(jù)平板透明圈法檢測(cè)透明質(zhì)酸酶活性。配置緩沖液(50mM的檸檬酸/檸檬酸鈉ρΗ5.3，150mM 的 NaCl, 0.02%Na3N),量取 50ml 緩沖液，加入 1.5% 的瓊脂糖和 lmg/ml 的 HA,融化后配置平板。將發(fā)酵液滴入孔徑內(nèi)部，平板置于37°C培養(yǎng)10h，在平板上覆蓋適量的10% (w/v)的氯化十六燒吡唳(cetylpyridinium chloride)水溶液,約10_20min后出現(xiàn)透明圈，如本發(fā)明專利附圖2所示。CTAB濁度法檢測(cè)透明質(zhì)酸酶活性。在Iml反應(yīng)體系中，含HA (2mg/ml)100l.! 1，加入發(fā)酵液上清或者酶液適量，pH5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液補(bǔ)足至Iml0混勻后置于38°C水浴反應(yīng)30min，立即加入2ml的CTAB (2.5g/L),室溫反應(yīng)5min，在400nm下進(jìn)行濁度對(duì)比測(cè)定。濁度比色結(jié)果如附圖3所示，具有透明質(zhì)酸酶活性的A3887-1和-2發(fā)酵液作用透明質(zhì)酸后，反應(yīng)體系呈澄清狀，而對(duì)照呈渾濁狀。
[0037]透明質(zhì)酸酶專一作用于透明質(zhì)酸內(nèi)的葡萄糖苷酸鍵，產(chǎn)生具有還原端為葡萄糖醛酸小分子多糖。采用3，5—二硝基水楊酸比色法測(cè)量水解透明質(zhì)酸產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量，用分析純葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，求出酶的比活力。反應(yīng)體系為lml，用pH5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置2mg/ml的HA，反應(yīng)體系加入400 μ I的HA溶液、100 μ I的發(fā)酵上清液酶液，緩沖液補(bǔ)足至Iml ;對(duì)照組采用pPIC9K_GS115發(fā)酵上清液。在38°C反應(yīng)20min，立即沸水終止反應(yīng)，采用DNS法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量(相當(dāng)于等量葡萄糖的還原力)，計(jì)算發(fā)酵液產(chǎn)生的酶活單位數(shù)。兩個(gè)平行發(fā)酵組采用此方法測(cè)定的發(fā)酵液酶比活如圖4所示，分別為3963.22U/ml和4043.67U/ml。
[0038]實(shí)施例7:重組透明質(zhì)酸酶的純化制備
[0039]根據(jù)透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)特性，屬于高聚陰離子型糖胺聚糖，可采用二乙氨乙基纖維素柱(DEAE-ellulose)進(jìn)行離子交換純化。發(fā)酵液上清用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值至7.0，DEAE纖維素柱采用相同PH值的緩沖液平衡30min，將發(fā)酵液上清注入DEAE纖維素柱，混勻靜置Ih,每15min攪勻一次。隨 后分別用pH6.5,6.0的雙甘氨肽緩沖液洗脫雜質(zhì)，再采用pH5.6的乙酸鹽緩沖液特異性洗脫目標(biāo)蛋白。洗脫的目標(biāo)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，如附圖1中泳道3所示，采用此步驟純化方法獲得了單一條帶的透明質(zhì)酸酶蛋白。
【權(quán)利要求】
1.一種透明質(zhì)酸酶基因，其特征在于核苷酸序列如(a)或(b)或(C)所示: Ca)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； (b)在(a)中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)核苷酸或幾個(gè)核苷酸且具有透明質(zhì)酸酶活性的基因； (C)與(a)中氨基酸序列整體相似度在85%以上，具有透明質(zhì)酸酶活性的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQID N0.2所示，或其保守性變異多肽。
3.含有權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因的方法，其特征在于包括如下步驟:以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母為生產(chǎn)菌株，使用BMGY培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述畢赤酵母為GSl15。
6.權(quán)利要求4所述 的方法，其特征在于具體步驟如下:以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵條件為:將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到25ml (搖瓶容量250ml) BMGY培養(yǎng)基中，溫度為30°C、pH為6.0培養(yǎng)至0D600為4，更換誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，添加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔24h補(bǔ)加一次甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)96h。
7.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所示透明質(zhì)酸酶的純化條件為:采用二乙氨乙基纖維素柱(DEAE-ellulose)進(jìn)行離子交換，分別用pH6.5,6.0的雙甘氨肽緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以pH5.6、50mM的乙酸鹽緩沖液特異性洗脫目標(biāo)蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103695448SQ201410007408
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月29日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 康振, 金鵬 申請(qǐng)人:江南大學(xué)