專利名稱：用于治療骨性關(guān)節(jié)炎及軟骨修復(fù)的亞精胺合酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與亞精胺合酶(spermidine synthase)在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展及軟骨修復(fù)中的作用有關(guān)。更具體地，本發(fā)明涉及治療方法、亞精胺合酶抑制劑的組合物及其在骨性關(guān)節(jié)炎及其相關(guān)的軟骨破壞的治療中的用途。
背景技術(shù)：
骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見病，它能使人日趨衰弱，并且花費(fèi)巨大，在目前階段尚無法治愈。對(duì)于新治療方法的需要十分迫切。該疾病的特點(diǎn)是軟骨細(xì)胞的功能異常，以及因而導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)終末分化和啟動(dòng)骨發(fā)生，并且破壞軟骨基質(zhì)。因此，起源于共同祖細(xì)胞且其產(chǎn)物與軟骨發(fā)生和骨發(fā)生相關(guān)的基因、決定軟骨細(xì)胞終末分化的基因、以及其產(chǎn)物啟動(dòng)軟骨基質(zhì)破壞的基因，顯然都是可選用的治療切入點(diǎn)。
OA的流行病學(xué)
OA又被錯(cuò)誤地稱為退行性關(guān)節(jié)病，是指以動(dòng)關(guān)節(jié)(即可活動(dòng)的、由滑膜包裹的關(guān)節(jié))功能障礙為特點(diǎn)的疾病。其中以特發(fā)性(原發(fā)性)OA最為常見，其易感因素不明。
繼發(fā)性O(shè)A與特發(fā)性O(shè)A在病理上無法區(qū)分，但其病因?yàn)榱硪换A(chǔ)疾病的存在。OA是人關(guān)節(jié)病變中最常見的形式，也是美國乃至全世界最普遍的關(guān)節(jié)狀態(tài)。根據(jù)不同臨床研究結(jié)果估計(jì)，在70歲以上的人群中，90％以上患有OA。本發(fā)明的目的在于用新的方法對(duì)該疾病進(jìn)行治療和預(yù)防。
OA的發(fā)病機(jī)理OA包括一組異質(zhì)性病理的改變，其共同結(jié)果是對(duì)關(guān)節(jié)軟骨完整性的破壞，以及關(guān)節(jié)緣軟骨下骨板的骨質(zhì)改變，從而引起關(guān)節(jié)癥狀及體征。OA可以是特發(fā)性的(即原發(fā)性)，也可以繼發(fā)于其他原因(如炎癥、生化因素、內(nèi)分泌因素、代謝因素、解剖或發(fā)育異常)。年齡是OA最大的危險(xiǎn)因素，其他諸如大的創(chuàng)傷以及長期反復(fù)使用關(guān)節(jié)亦是OA的重要危險(xiǎn)因素。OA累及的關(guān)節(jié)形式還受發(fā)病前職業(yè)性或非職業(yè)性關(guān)節(jié)超負(fù)荷的影響。
該疾病一般分為兩個(gè)階段(1)代償期；(2)失代償期。目前，大多數(shù)研究人員認(rèn)為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的最初變化是由外源性因素導(dǎo)致的(如負(fù)荷、損傷等)。軟骨膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)隨之受到破壞，溶酶體酶和分泌蛋白酶(MMP，纖維蛋白酶，組織蛋白酶)可能是軟骨基質(zhì)能觀察到的最初變化所產(chǎn)生的原因。這些酶的合成和分泌是由IL-1或其他因素(如機(jī)械刺激)所刺激發(fā)生的。在疾病的最初階段，細(xì)胞代償反應(yīng)亦被激活。軟骨細(xì)胞分泌的蛋白酶抑制因子如TIMP和PAI-1等通過拮抗蛋白酶活性以穩(wěn)定軟骨系統(tǒng)。生長因子如IGF-1和TGF-β等在損傷的修復(fù)中起到一定作用，該修復(fù)過程可能能使病變?nèi)蛘咴谧畹拖薅壬夏芡ㄟ^活化成軟骨細(xì)胞系細(xì)胞使修復(fù)過程穩(wěn)定。最后，則導(dǎo)致過度增殖的軟骨細(xì)胞堆積。這種細(xì)胞具有顯著的生物合成活性，其表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蛋白多糖(PG)濃度的增加，從而使軟骨增厚(OA代償期)。這種代償機(jī)制可以使關(guān)節(jié)在多年內(nèi)維持一定的功能。
但是，修復(fù)組織并不能完全承重，而且PG合成的速度會(huì)隨著軟骨的全層丟失而下降，這標(biāo)志著OA失代償期的開始。隨著關(guān)節(jié)軟骨的破壞，祖細(xì)胞向組織損傷處進(jìn)行遷移。祖細(xì)胞會(huì)進(jìn)行增殖并分化成四種細(xì)胞成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，破軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，這四種細(xì)胞一起形成被稱之為骨贅(osteophyte)的骨組織，骨贅突入關(guān)節(jié)腔，從而抑制關(guān)節(jié)的活動(dòng)。最后，軟骨逐漸會(huì)被骨所代替。
上述現(xiàn)象的原因目前尚不清楚。一種可能性是在OA中，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或滑膜成纖維細(xì)胞生長的正常抑制性控制被替代了。這使得在正常關(guān)節(jié)軟骨中不存在的兩種細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)堆積，即(1)具有改良特性的不成熟間質(zhì)細(xì)胞和骨髓細(xì)胞及(2)肥大的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示肥大軟骨細(xì)胞可能通過分泌成血管因子及成骨因子啟動(dòng)骨發(fā)生。(Horner，A.，Bishop，N.J.，Bord S.，Beeton，C.，Kelsall，A.W.，Coleman，N.and Compston，J.E.(1999).血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在人新生生長板軟骨中的免疫定位J.Anat.194519-524)。
對(duì)OA的治療手段可定位于三個(gè)主要的步驟—抑制最初的軟骨破壞，這是一種已經(jīng)被接受的治療方法，即通過減少關(guān)節(jié)物理壓力及使用金屬蛋白酶抑制劑進(jìn)行治療；—在疾病進(jìn)程的稍后階段抑制或減緩軟骨的全部破壞，即用治療手段活化軟骨修復(fù)相關(guān)步驟，也就是說促進(jìn)不成熟基質(zhì)祖細(xì)胞向成熟軟骨細(xì)胞進(jìn)行分化，從而產(chǎn)生具有正常功能的關(guān)節(jié)軟骨；
—在疾病進(jìn)程的終末階段抑制或減緩骨贅形成，即使用治療手段抑制在關(guān)節(jié)軟骨部位的異位骨發(fā)生。
因此，發(fā)明人開始著手確定編碼刺激或抑制祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞分化的特異因子的靶基因。
由被稱為成骨因子的IL-1、FGF-2和機(jī)械刺激引起的基因表達(dá)的變異，可能與OA的發(fā)病有關(guān)，因此對(duì)其進(jìn)行干預(yù)會(huì)起到治療OA的作用。令人驚訝的是，目前本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)亞精胺合酶基因是FGF-2上調(diào)的基因之一。這就意味著亞精胺合酶基因在OA發(fā)病過程中可能起到了一定的作用。
亞精胺合酶亞精胺是三種生物活性多胺(polyamine)中的其中之一，另兩者分別為腐胺(putrescine)和精胺(spermine)。多胺是一組對(duì)于細(xì)胞增殖和分化極為重要的細(xì)胞成分。盡管多胺的確切功能尚不清楚，但有假說認(rèn)為它在一些細(xì)胞進(jìn)程如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯中起非常重要的作用。
多胺的生物合成途徑包含兩種被精確調(diào)控的酶，即鳥氨酸脫梭酶和S-腺苷甲硫氨酸脫梭酶，以及兩種結(jié)構(gòu)表達(dá)酶，及亞精胺合酶和精胺合成酶。亞精胺合酶分子量大小為74kDa，它催化腐胺(1，4-二氨基丁烷(1，4-diaminobutane))發(fā)生3-氨丙基化以生成亞精胺。亞精胺的生物合成包含兩個(gè)步驟，即S-腺苷甲硫氨酸(SAM)脫梭酶催化的SAM脫梭，生成S-腺苷-3-甲硫基丙胺(S-adenosyl-3-methylthiopropanamine，脫梭化SAM)，以及鳥氨酸脫梭酶催化的鳥氨酸脫梭生成腐胺。脫梭化SAM再與亞精胺合酶反應(yīng)生成氨丙基酶，該酶將氨丙基轉(zhuǎn)移至腐胺生成亞精胺和5′-甲基硫腺苷(5′methylthioadenosine，MTA)。該活性酶是兩個(gè)相同亞基的二聚體，不需要協(xié)同因子，將氨丙基由dcAdoMet轉(zhuǎn)移至腐胺。
在包括軟骨在內(nèi)的許多活體組織中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腐胺、亞精胺和精胺。在骨骼內(nèi)的軟骨轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)過程中，也發(fā)現(xiàn)了它們的生成，其過程是由ODC催化的。刺激粘多糖合成的甲狀旁腺激素能夠誘導(dǎo)培養(yǎng)的兔分化肋軟骨細(xì)胞中的ODC活性，并提高多胺水平。靜止期軟骨缺乏腐胺。根據(jù)組織重量和DNA含量，骨化軟骨與靜止期軟骨相比，含有更多的多胺。骨化軟骨中的亞精胺含量比靜止期軟骨高5倍，精胺含量則高2倍左右。骨化軟骨內(nèi)的亞精胺/精胺比值為1.7，而靜止期軟骨中該比值為0.69。只有亞精胺具有將蛋白多糖亞基從瓊脂糖4B II型膠原柱上洗脫下來的能力(Franco Vittur等(1986).軟骨內(nèi)多胺在鈣化機(jī)制中的可能作用Biochimica et Biophysica Acta 88138-45)通過分析由蛋白多糖亞基充填的瓊脂糖4B膠原柱的蛋白多糖洗脫物可得知多胺在蛋白多糖基團(tuán)與膠原相互作用過程中所起的作用。腐胺和精胺沒有表現(xiàn)出任何作用，而亞精胺具有很強(qiáng)的取代蛋白多糖亞基的作用，約有90％的蛋白多糖亞基被從柱上洗脫。精胺和亞精胺提高了軟骨產(chǎn)生的堿性磷酸酶的活性。在骨化前軟骨的靜止帶發(fā)現(xiàn)了亞精胺。在接近增殖帶和柱狀細(xì)胞的地方，細(xì)胞染色消失了。僅僅在軟骨細(xì)胞開始過度增殖的柱狀細(xì)胞基質(zhì)中，亞精胺染色才特別明顯。在三種多胺中，亞精胺含量是最豐富的，亞精胺/精胺的高摩爾比值被認(rèn)為是快速生長的一個(gè)指標(biāo)。在骨化區(qū)內(nèi)亞精胺含量是最高的。
多胺的代謝亞精胺的前體，即腐胺和脫梭化S-腺苷甲硫氨酸(dcAdoMet)的合成是由兩種脫梭酶，即鳥氨酸脫梭酶(ODC，EC4.1.1.17)和S-腺苷甲硫氨酸脫梭酶(AdoMetDC，SamDC，EC4.1.1.51)催化的。這些酶的活性是受到精確調(diào)控的生長因子和其他刺激因素使其水平上升，而多胺本身則使其活性下降。這些因素共同作用，將多胺調(diào)整至細(xì)胞生長和發(fā)育所需要水平。在控制多胺水平的諸多因素中，ODC和AdoMetDC活性的變化是最主要的兩個(gè)因素。包括腐胺氨丙基轉(zhuǎn)移酶(PAPT，亞精胺合酶，EC2.5.1.6)和亞精胺氨丙基轉(zhuǎn)移酶(SAPT，精胺合成酶，EC2.5.1.22)的氨丙基轉(zhuǎn)移酶活性主要是通過其底物利用度進(jìn)行調(diào)節(jié)的。除了在細(xì)胞內(nèi)從頭進(jìn)行合成外，多胺還可通過被特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)所攝取而獲得。細(xì)胞內(nèi)多胺含量可對(duì)該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，而生長因子和致癌基因則可對(duì)其進(jìn)行正調(diào)節(jié)。多胺缺失可使該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)出現(xiàn)及活性增加，這是一個(gè)改善多胺合成抑制作用的重要因素。外源性多胺的攝取可能是抗腫瘤因子等多胺合成抑制因子臨床試驗(yàn)失敗的決定性因素。最后，多胺水平還可通過互相轉(zhuǎn)化、氧化及外流等過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。多胺末端氮原子的氧化是由含Cu+2的氧化酶催化的，盡管該酶是否完全不存在于細(xì)胞內(nèi)尚不清楚，但它主要存在于細(xì)胞外。在亞精胺/精胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT，EC2.3.1.57)的作用下，多胺之間的相互轉(zhuǎn)化以及外流到胞外的過程得以完成，該酶將多胺的氨丙基末端乙酰化，生成N-乙酰精胺和N-乙酰亞精胺。上述這些乙酰衍生物與細(xì)胞多聚陰離子結(jié)合得不甚緊密，都會(huì)被排泌至胞外或被很快代謝。FAD依賴性多胺氧化酶(PAO)將N-乙酰精胺和N-乙酰亞精胺上的N-乙酰氨丙基去除，使其非末端氮原子得以氧化，分別生成亞精胺和腐胺。這條途徑的限定性因素是SSAT的活性，在通常情況下，該酶的活性非常低，但是在細(xì)胞內(nèi)多胺水平上升或毒素刺激的情況下，該酶活性被極大程度地誘導(dǎo)，使得多胺由細(xì)胞膜和細(xì)胞器釋放。在生理?xiàng)l件下，PAO對(duì)非乙?；喟坊钚詷O低或根本無活性。
因此確定不同的亞精胺合酶抑制劑及評(píng)估其作為抑制或延緩OA進(jìn)程藥物的可能性是本發(fā)明的研究方向之一。
本發(fā)明的另一個(gè)研究方向是為OA治療和軟骨修復(fù)提供治療手段。
上述及本發(fā)明的其他研究方向?qū)⒃谙挛闹羞M(jìn)行詳細(xì)論述。

發(fā)明內(nèi)容
首先，本發(fā)明涉及治療有OA治療需求的對(duì)象的方法，該方法是通過給予上述對(duì)象有效量的亞精胺生物合成抑制劑，對(duì)亞精胺的生物合成起到實(shí)質(zhì)性抑制作用，以達(dá)到治療對(duì)象的目的。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，給予上述對(duì)象的抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
根據(jù)一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案，亞精胺合酶抑制劑是指能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的抑制因子。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，給予對(duì)象的亞精胺合酶抑制劑可選自由腺苷亞精胺(adenosyl spermidine)、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺(trans-4-methylcyclohexylamine，4MCHA)、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巰基丙胺(2-mercaptopropylamine)、N-氯磺酰二環(huán)己胺(N-chlorosulfonyldicyclohexylamine)、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷(5′-((3-aminopropyl)amino)-5′deoxyadenosine)、1-氨基氧基(aminooxyl)-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷(5′-(isobutylthio)adenosine)、5′-(甲硫基)腺苷(5′-(methylthio)adenosine)及其功能同族物和類似物組成的組。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及作用于多胺生物合成途徑中的一個(gè)或多個(gè)步驟的抑制劑在治療哺乳動(dòng)物OA中的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抑制劑可以是亞精胺生物合成抑制劑。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，則可以是亞精胺合酶抑制劑，并能抑制亞精胺的聚積。
根據(jù)一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案，亞精胺合酶抑制劑是指能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的抑制因子。
該酶抑制劑可以從上文所列舉的已知亞精胺合酶抑制劑中進(jìn)行選擇。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了通過使用多胺生物合成途徑抑制劑治療哺乳動(dòng)物OA的方法。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，該抑制劑可以為亞精胺合酶抑制劑。具體而言，是指能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的亞精胺合酶抑制劑。
其次，本發(fā)明涉及多胺生物合成途徑抑制劑在制備用于治療哺乳動(dòng)物OA的藥物組合物中的用途。優(yōu)選抑制劑可為亞精胺生物合成抑制劑，更優(yōu)選的可為亞精胺合酶抑制劑，最優(yōu)選的可為能夠抑制亞精胺聚積以及導(dǎo)致對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明，在治療OA的藥物組合物的制備過程中所使用的抑制劑可從上文所列舉的亞精胺合酶抑制劑中進(jìn)行選擇。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種治療OA的治療組合物，所述的組合物包含多胺生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)步驟的抑制劑作為活性成分。優(yōu)選抑制劑為亞精胺生物合成抑制劑，最優(yōu)選的為亞精胺合酶抑制劑。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物可選擇性加入制藥用或獸藥用載體、賦形劑和/或稀釋劑。
第三，本發(fā)明涉及用于治療OA的治療組合物的制備方法，該制備方法包含的步驟為(a)識(shí)別一種能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的亞精胺合酶抑制劑；和(b)將上述抑制劑與藥用可接受載體、賦形劑和/或稀釋劑混合。
在本項(xiàng)內(nèi)容的優(yōu)選實(shí)施方案中，識(shí)別適用于制備治療OA的治療組合物的亞精胺合酶抑制劑的過程通過以下步驟進(jìn)行(a)獲得可供選用的亞精胺合酶抑制劑；以及(b)評(píng)估上述候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程的作用。
評(píng)估方法包含以下步驟i.準(zhǔn)備一個(gè)包含編碼亞精胺合酶的DNA的測試系統(tǒng)；ii.將上述系統(tǒng)與候選亞精胺合酶抑制劑在正常情況下能夠引起亞精胺表達(dá)的條件下進(jìn)行接觸；以及iii.比較檢測候選抑制劑與對(duì)照對(duì)終點(diǎn)指示的作用，上述作用是指對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程的抑制。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明評(píng)估法所選用的測試系統(tǒng)可為體外細(xì)胞培養(yǎng)、離體細(xì)胞培養(yǎng)、離體器官培養(yǎng)及動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的任何一種。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，上述測試系統(tǒng)所表達(dá)的亞精胺合酶可為內(nèi)源性或外源性表達(dá)。該測試系統(tǒng)還可選擇性加入內(nèi)源性和/或外源性物質(zhì)，使得實(shí)驗(yàn)條件適于亞精胺的表達(dá)，以及對(duì)為確定軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中的任一過程而設(shè)定的終點(diǎn)指示的檢測。
對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)的抑制作用可通過許多不同的方法進(jìn)行觀察，包括染色法(包括免疫組化)和參數(shù)法，舉例來說就是對(duì)一個(gè)生理性示值讀數(shù)如細(xì)胞周期的變化進(jìn)行觀察。具體方法的選擇取決于所選用的測試系統(tǒng)。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明為了評(píng)估上述候選抑制劑所選用的測試系統(tǒng)為體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)。該細(xì)胞攜帶外源性表達(dá)的亞精胺合酶。
在可供選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明所選用的評(píng)估用測試系統(tǒng)為離體骨培養(yǎng)，其包含內(nèi)源性表達(dá)的亞精胺合酶。優(yōu)選骨培養(yǎng)為胚胎骨培養(yǎng)。
另一種可供選擇的測試系統(tǒng)可為體內(nèi)系統(tǒng)，即動(dòng)物模型測試系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，所選用的評(píng)估用動(dòng)物模型可通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腳爪厚度的測量，將關(guān)節(jié)炎的發(fā)生作為終點(diǎn)指示。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腳爪大小的增加小于對(duì)照組動(dòng)物的，就意味著所檢測候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)或關(guān)節(jié)炎的發(fā)生起到了抑制作用。
優(yōu)選測試系統(tǒng)所選用的動(dòng)物模型可為轉(zhuǎn)基因小鼠。
另一個(gè)優(yōu)選體內(nèi)測試系統(tǒng)可選用表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶的關(guān)節(jié)炎哺乳動(dòng)物模型。該模型可將關(guān)節(jié)炎的發(fā)生作為終點(diǎn)指示。
根據(jù)特別優(yōu)選實(shí)施方案，該模型可選用患關(guān)節(jié)炎的大鼠或小鼠。
本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及治療OA的治療組合物的制備方法，該方法包含下列步驟(a)確定一種能導(dǎo)致對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的亞精胺合酶抑制劑；(b)將上述抑制劑與藥用可接受載體相混合。確定一種適合的抑制劑包括獲取一個(gè)候選抑制劑及對(duì)其作用的評(píng)估。根據(jù)該實(shí)施方案，可從腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物中選擇一種抑制劑，并對(duì)其作用進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。
一個(gè)替代方法為通過篩選可作為亞精胺合酶抑制劑的物質(zhì)來獲得候選抑制劑，并對(duì)其作用進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。
根據(jù)本發(fā)明，上述篩選方法包含下列步驟(a)準(zhǔn)備包含亞精胺合酶的混合物；(b)將上述混合物與被篩選物質(zhì)在正常情況下能引起亞精胺生物合成的條件下進(jìn)行接觸；以及(c)確定被篩選物質(zhì)對(duì)終點(diǎn)指示作用，對(duì)上述終點(diǎn)的抑制即意味著亞精胺合酶受到被篩選物質(zhì)的抑制。根據(jù)該替代方法的一個(gè)特異性實(shí)施方案，終點(diǎn)指示可為亞精胺合酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的生成。
本發(fā)明的上述所有及其他方面的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將在下文中加以進(jìn)一步解釋，并通過非限定性實(shí)施方案和附圖舉例說明。


圖1經(jīng)IGF-1處理6天后的融合HMSC細(xì)胞對(duì)不同分化標(biāo)記物的表達(dá)。對(duì)照為未經(jīng)處理的相同培養(yǎng)的細(xì)胞。標(biāo)記物表達(dá)的水平用相對(duì)單位表示。
縮寫Cont.＝對(duì)照；trea.＝經(jīng)處理的；Collagen t.II＝II型膠原；Alcian b1.＝阿爾新藍(lán)。
圖2經(jīng)IL-1β處理6天后的融合HMSC細(xì)胞對(duì)不同分化標(biāo)記物的表達(dá)。對(duì)照為未經(jīng)處理的相同培養(yǎng)的細(xì)胞。標(biāo)記物表達(dá)的水平用相對(duì)單位表示。
縮寫Cont.＝對(duì)照；trea.＝經(jīng)處理的；Collagen t.II＝II型膠原；Alcian b1.＝阿爾新藍(lán)。
圖3經(jīng)FGF-2處理6天后的融合HMSC細(xì)胞對(duì)不同分化標(biāo)記物的表達(dá)。對(duì)照為未經(jīng)處理的相同培養(yǎng)的細(xì)胞。標(biāo)記物表達(dá)的水平用相對(duì)單位表示。
縮寫Cont.＝對(duì)照；trea.＝經(jīng)處理的；Collagen t.II＝II型膠原；Alcian b1.＝阿爾新藍(lán)。
圖4A-4BNorthern印跡法分析亞精胺合酶。
4ANorthern印跡法分析組織亞精胺合酶第一道腦；第二道結(jié)腸；第三道心臟；第四道腎臟；第五道肝臟；第六道肌肉；第七道肺；第八道胎盤；第九道小腸；第十道脾；第十一道胃；第十二道睪丸。
4BNorthern印跡法分析U2OS成骨細(xì)胞亞精胺合酶。
圖5Western印跡法分析瞬時(shí)轉(zhuǎn)染亞精胺合酶的293細(xì)胞。其探針為抗組蛋白抗體。第三道轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物；第四道轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基；第五道對(duì)照293細(xì)胞裂解物；第六道對(duì)照293細(xì)胞的培養(yǎng)基；第七道陽性對(duì)照。
圖6PCR法分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞精胺合酶的RCJ3.1C5.18細(xì)胞。數(shù)字代表不同的克隆。
具體實(shí)施例方式
下文將利用非限制性實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步舉例說明。
OA是一種以軟骨退行性改變及異位骨發(fā)生為特征的破壞性關(guān)節(jié)病。發(fā)明人同時(shí)利用體外細(xì)胞系(HMSC細(xì)胞)和離體器官培養(yǎng)(在關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)生長的胚胎骨骺)兩種測試系統(tǒng)，以發(fā)現(xiàn)在該疾病發(fā)展過程中可能起重要作用的基因。實(shí)驗(yàn)采用人關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞(HMSC細(xì)胞)表達(dá)一系列基因。這些細(xì)胞經(jīng)各種處理以模擬軟骨修復(fù)(IGF-1)或OA起病及發(fā)展(IL1-β、bFGF-2、機(jī)械刺激)。復(fù)雜組織內(nèi)包含能相互作用的不同類型的細(xì)胞，而離體測試系統(tǒng)能更好地反映發(fā)生于其中的基因事件，因而發(fā)明人除了采用體外實(shí)驗(yàn)，還使用了離體實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明人采用微陣列雜交法研究不同處理方法產(chǎn)生的基因表達(dá)輪廓，并用生物信息工具對(duì)其進(jìn)行了分析。發(fā)明人在采取預(yù)期能引起OA的處理方法處理體外細(xì)胞系后，檢測到許多已知為OA標(biāo)記物的基因，因此所獲基因表達(dá)方式表明所選用的體外細(xì)胞系能準(zhǔn)確地反映體內(nèi)OA關(guān)節(jié)的進(jìn)程。
發(fā)明人已經(jīng)確認(rèn)，在亞精胺生物合成過程涉及到的亞精胺合酶受bFGF-2的上調(diào)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)意味著多胺的生物合成，具體而言即亞精胺的生物合成，更確切地說應(yīng)該是亞精胺合酶在OA發(fā)生發(fā)展中有所涉及，因而可被選擇作為治療哺乳動(dòng)物OA新藥的治療靶點(diǎn)。
因此首先，本發(fā)明涉及對(duì)需要OA治療的對(duì)象的治療方法，該方法是通過給予上述對(duì)象有效量的亞精胺生物合成抑制劑，對(duì)亞精胺的生物合成起到實(shí)質(zhì)性抑制作用，以達(dá)到治療對(duì)象的目的。
在這里，“治療”是指對(duì)疾病狀態(tài)的改善，以及對(duì)疾病進(jìn)程的延緩，包括部分或完全緩解特異性疾病相關(guān)癥狀?！爸委煛币部赡芸梢灶A(yù)防疾病發(fā)生或推遲其發(fā)作。
正如在發(fā)明背景中所描述的，多胺生物合成途徑涉及到兩種被精確調(diào)控的酶，即鳥氨酸脫梭酶和S-腺苷甲硫氨酸，以及兩種結(jié)構(gòu)表達(dá)酶，及亞精胺合酶和精胺合成酶。
亞精胺的生物合成包含兩個(gè)步驟，即S-腺苷甲硫氨酸(SAM)脫梭酶催化的SAM脫梭，生成S-腺苷-3-甲硫基丙胺(S-adenosyl-3-methylthiopropanamine，脫梭化SAM)，以及鳥氨酸脫梭酶催化的鳥氨酸脫梭生成腐胺。脫梭化SAM再與亞精胺合酶反應(yīng)生成氨丙基酶，該酶將氨丙基轉(zhuǎn)移至腐胺生成亞精胺和5′-甲基硫腺苷(MTA)。腐胺和脫梭化S-腺苷甲硫氨酸(dcAdoMet)這兩種前體的合成在兩種脫梭酶即鳥氨酸脫梭酶(ODC，EC4.1.1.17)和S-腺苷甲硫氨酸脫梭酶(AdoMetDC，SamDC，EC4.1.1.51)的作用下發(fā)生。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，給予對(duì)象的抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
在這里“抑制劑”所指的范疇包括同族物和類似物，它們都是原先已經(jīng)確認(rèn)的保留有抑制多胺生物合成活性的抑制性分子，確切地說是抑制亞精胺生物合成活性的，更確切地說是保留母代細(xì)胞對(duì)特異性亞精胺合酶活性的抑制。“抑制劑”既包括已知的各種多胺合成途徑抑制劑，確切地說是亞精胺生物合成抑制劑，更確切地說是亞精胺合酶抑制劑，也包括在即將描述的篩選系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的抑制劑，在下文的例4中將對(duì)其進(jìn)行舉例說明。
“實(shí)質(zhì)性抑制”是指對(duì)亞精胺生物合成的抑制程度在10-90％之間，優(yōu)選范圍為25-75％，更優(yōu)選范圍為40-60％。
根據(jù)特定的優(yōu)選實(shí)施方案，亞精胺合酶抑制劑是指能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中的任一過程產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的亞精胺合酶抑制劑可選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物組成的組。
在上面所列舉的抑制劑中，最令人感興趣的是AdoDATO、4MCHA和DCHA。文獻(xiàn)中所包含的研究關(guān)注于這些抑制劑在細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)的作用。例如AdoDATO是轉(zhuǎn)移酶的一種過渡型類似物，能降低亞精胺水平并顯著降低細(xì)胞增殖。將多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于AdoDATO能使細(xì)胞亞精胺含量大幅度降低，以及隨之而來的腐胺水平上升，這與藥物抑制亞精胺合酶活性的表現(xiàn)相一致。(Pegg AE，TangKC，Coward JK.(1982).S-腺苷-1，8-二氨基-3-硫辛烷對(duì)多胺代謝的作用Biochemistry 21(20)5082-5089)。
在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將大鼠遷延暴露于4MCHA達(dá)10天后，多種組織內(nèi)的亞精胺含量減少了70-80％，但精胺水平代償性上升，因而多胺總含量依然保持不變，對(duì)生長沒有明顯的作用。口服4MCHA10天或4個(gè)月都導(dǎo)致大鼠組織內(nèi)亞精胺水平顯著下降，以及精胺水平代償性上升(Shirahata A，Takahashi N，Beppu T，Hosoda H，Samejima K.(1993)亞精胺合酶抑制劑及精胺合成酶抑制劑對(duì)大鼠組織內(nèi)多胺合成的作用Biochem Pharmacol.45(9)1897-1903)。
每天給予新生大鼠DCHA將導(dǎo)致腦內(nèi)亞精胺水平劑量依賴性下降，以及腐胺和精胺水平的上升。盡管持續(xù)給予DCHA，所有三種多胺水平都在兩周內(nèi)恢復(fù)到正常水平。(Slotkin TA，Bartolome J，PersonsD，Whitmore WL.(1984).新生大鼠腦及心臟內(nèi)多胺水平鳥氨酸脫梭酶抑制劑和亞精胺合酶抑制劑的作用Life Sci.35(10)1125-1131)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法應(yīng)意欲治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，更優(yōu)選的是以人為對(duì)象，因此“患者”、“哺乳動(dòng)物對(duì)象”或“有需要的對(duì)象”指任何需要治療的哺乳動(dòng)物，包括人，牛，馬，狗和貓，優(yōu)選對(duì)象為人。
本發(fā)明的治療方法包含給有需要的對(duì)象施用一有效量的上述抑制劑?！坝行Я俊笔侵改軌蜻_(dá)到所選擇效果的劑量。例如本發(fā)明所用抑制劑或組合物的有效量指能對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎病理改變起治療作用的劑量。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及亞精胺生物合成途徑中的一個(gè)或多個(gè)步驟的抑制劑在治療哺乳動(dòng)物對(duì)象的OA中的用途。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本治療方法以及本實(shí)施方案中的抑制劑可以是亞精胺合酶抑制劑。優(yōu)選亞精胺合酶抑制劑為能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中的任一過程產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)。
具體而言，本發(fā)明所使用的亞精胺抑制劑可選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷(5′-((3-aminopropyl)amino)-5′deoxyadenosine)、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物組成的組。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種能在治療哺乳動(dòng)物對(duì)象OA中使用的多胺生物合成途徑抑制劑。根據(jù)本實(shí)施方案，優(yōu)選的抑制劑為亞精胺合酶抑制劑，確切地說是能夠?qū)е聦?duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中的任一過程產(chǎn)生抑制作用的亞精胺合酶抑制劑。明確地說，本發(fā)明提供的可用于治療OA的亞精胺合酶抑制劑可選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物組成的組。
此外，上述抑制劑能抑制多胺生物合成途徑中至少一個(gè)步驟，確切地說是抑制亞精胺的生物合成，更確切地說是抑制亞精胺合酶，因而可以用于制備治療哺乳動(dòng)物對(duì)象OA的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了一種可用于治療OA的治療組合物。本發(fā)明的所述組合物包含多胺生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)步驟的抑制劑作為活性成分。優(yōu)選抑制劑為亞精胺生物合成抑制劑，最優(yōu)選為亞精胺合酶抑制劑。上文所列舉是可包含于本發(fā)明的組合物中的抑制劑。
本發(fā)明的組合物及方法特別是為治療人OA而設(shè)計(jì)的，但其他哺乳動(dòng)物也包括在內(nèi)。這些成分可直接施用于對(duì)象以進(jìn)行治療，也可在施用前根據(jù)需要將其與載體蛋白如卵白蛋白或血清白蛋白結(jié)合。治療配方可為任何一種傳統(tǒng)劑量配方。典型配方包含上述至少一種活性成分及一種或多種載體。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物可選擇性加入制藥用或獸藥用載體、賦形劑和/或稀釋劑。
每種載體都必須滿足制藥和生理要求，必須能與其他成分相互兼容，并且不能對(duì)受者有傷害作用。盡管有適用于經(jīng)口、直腸和鼻腔給藥的配方，優(yōu)選配方為經(jīng)胃腸外施用，包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、且特別是皮下施用。配方可用任何制藥業(yè)已知的方法方便地制成單位劑量的形式。
本發(fā)明的成分有多種不同的給藥方式。非限定性例子包括直接靜脈內(nèi)注射，或直接在受累關(guān)節(jié)內(nèi)或臨近部位注射。
適用于注射的藥物形式包括滅菌水劑，或是懸液和滅菌粉劑的形式在使用前制備成供注射用的滅菌溶液或懸液。任何藥物形式都必須是無菌的，且必須為易用于注射器內(nèi)的液體。在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏條件下必須保持穩(wěn)定，且必須在避免微生物如細(xì)菌和真菌污染的條件下保存。載體可為溶劑或懸液，其成分可為水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，液態(tài)聚乙二醇及其類似物)、及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锖椭参镉偷?。可使用多種方法以保持其適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，如使用卵磷脂等包被，保持所需懸液微粒大小，以及使用表面活性劑等。
可通過使用多種抗菌劑和抗真菌劑以防止微生物的污染，如氯代丁醇，石炭酸，山梨酸，硫柳汞及其類似物等。在許多情況下，最好還包括等張液，如葡萄糖液或氯化鈉溶液。為延長注射成分的吸收時(shí)間，還可加入能延緩吸收的成分，如單硬脂硫酸鋁和凝膠。
注射用無菌溶液的制備方法為將所需劑量的活性成分與由上述成分組成的適當(dāng)溶劑混合，再根據(jù)需要過濾滅菌。一般而言，懸液的制備方法為將各種無菌活性成分加入至盛有基礎(chǔ)懸液和其他所需上述成分的無菌容器中，混合而成。
注射用無菌粉劑的優(yōu)選制備方式為采取真空干燥或凍干技術(shù)，將活性成分和其他所需附加成分由經(jīng)過濾滅菌的溶液形式制成粉劑。
“藥用可接受載體”包括各種及所有溶劑、懸液、包被劑、抗菌劑和抗真菌劑及其類似物。上述用于藥用活性成分的介質(zhì)和藥劑都是在制藥業(yè)中常用的。除非某種傳統(tǒng)介質(zhì)或藥劑與活性成分不相兼容，否則其在藥物組合物中的使用都是可預(yù)期的。
補(bǔ)充活性成分也可加入至本發(fā)明組合物中去。
本發(fā)明成分的優(yōu)選給藥途徑可為口服施用，例如與無活性稀釋劑或載體同服，或制成硬凝膠膠囊或軟膠囊，或是直接與餐同服。
組合物的劑量可為任何能改善患者OA癥狀的劑量。本領(lǐng)域人員都能夠理解，優(yōu)選劑量應(yīng)經(jīng)過一系列良好實(shí)驗(yàn)測定及標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐后根據(jù)每個(gè)患者個(gè)體化制定。
本發(fā)明還涉及制備用于治療OA的藥物組合物的方法。該方法包含下列步驟(a)確定一種能導(dǎo)致對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的亞精胺合酶抑制劑；以及(b)將上述抑制劑與藥用可接受載體相混合。
在本項(xiàng)內(nèi)容的優(yōu)選實(shí)施方案中，確定適用于制備OA藥物組合物的亞精胺合酶抑制劑的過程通過以下步驟進(jìn)行(a)獲得可供選用的亞精胺合酶抑制劑；以及(b)評(píng)估上述候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程的作用。
根據(jù)本發(fā)明，評(píng)估方法包含以下步驟i.準(zhǔn)備一個(gè)包含編碼亞精胺合酶的DNA的測試系統(tǒng)；ii.將上述系統(tǒng)與候選亞精胺合酶抑制劑在通常能夠引起亞精胺表達(dá)的條件下進(jìn)行接觸；以及iii.在到達(dá)終點(diǎn)指示時(shí)將實(shí)驗(yàn)候選抑制劑的作用與對(duì)照進(jìn)行比較，上述作用是指對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程的抑制。
根據(jù)所選擇的測試測試系統(tǒng)，對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)的抑制作用可通過許多不同的方法進(jìn)行觀察，包括細(xì)胞內(nèi)染色法(包括免疫組化)和參數(shù)法，舉例來說就是對(duì)一個(gè)生理性示值讀數(shù)如細(xì)胞周期的變化進(jìn)行觀察。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明評(píng)估法所選用的測試系統(tǒng)可為體外細(xì)胞培養(yǎng)、離體細(xì)胞培養(yǎng)、離體器官培養(yǎng)及動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的任何一種。
在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的測試系統(tǒng)所表達(dá)的亞精胺合酶可為內(nèi)源性或外源性表達(dá)。該測試系統(tǒng)還可選擇性加入內(nèi)源性和/或外源性物質(zhì)，使得實(shí)驗(yàn)條件適于亞精胺的表達(dá)，以及對(duì)為確定軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中的任一過程而設(shè)定的終點(diǎn)指示的檢測。
在不同測試系統(tǒng)中，被評(píng)估候選抑制劑在終點(diǎn)指示的作用既可為上述終點(diǎn)指示的增加，也可為其減少。
根據(jù)特定優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明采用實(shí)驗(yàn)方法的終點(diǎn)指示可以通過能產(chǎn)生視覺可觀察信號(hào)的分化標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行確定。這些視覺可觀察信號(hào)可以但不限定為阿爾新藍(lán)染色和茜素紅染色。阿爾新藍(lán)染色增加反映軟骨蛋白多糖的增加，即意味著軟骨形成，而茜素紅染色的增加則反映鈣化，即意味著軟骨細(xì)胞終末分化。因此，一種理想的候選亞精胺合酶抑制劑是一種會(huì)導(dǎo)致阿爾新藍(lán)染色增加及茜素紅染色減少的物質(zhì)。
在另一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中，終點(diǎn)指示可為能產(chǎn)生視覺可觀察信號(hào)的過度增殖標(biāo)記物的表達(dá)。一個(gè)非限定性例子為可通過X型膠原的免疫組化染色檢測過度增殖的存在。
可供選擇的終點(diǎn)指示還可為細(xì)胞增殖，用合適的方法也可對(duì)其進(jìn)行檢測。一種可能性為通過細(xì)胞周期FACS分析檢測細(xì)胞增殖。其他可供選擇的方法包括通過增殖標(biāo)記物免疫組化染色檢測細(xì)胞增殖。優(yōu)選增殖標(biāo)記物可為PCNA。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明采用的評(píng)估上述候選抑制劑作用的測試系統(tǒng)為體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)。這些細(xì)胞攜帶外源性表達(dá)亞精胺合酶。
在另一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明評(píng)估方法采用測試系統(tǒng)的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞既可以是原核也可以是真核細(xì)胞，確切地說是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。最優(yōu)選為RCJ3.IC5.18細(xì)胞，這是由胎鼠顱骨獲得的細(xì)胞克隆，僅限于軟骨分化途徑(Grigoriadis，A.E，Heersche，.IN.，Aubin，J.E(1996).成軟骨大鼠細(xì)胞系新家族中軟骨祖細(xì)胞頻率及軟骨分化的分析Differentiation 60299-307)。這些細(xì)胞用pCMVneo表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，因而包含編碼亞精胺合酶蛋白的核酸序列。
“表達(dá)載體”是指能將DNA片段整合至宿主基因組的載體，如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合DNA片段及其他運(yùn)載工具等。表達(dá)載體通常為包含所需基因或其片段，且具有自我復(fù)制能力的DNA或RNA構(gòu)建體，而且還包含可操縱地連接的基因控制元件，在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)能被識(shí)別，并影響所需基因的表達(dá)。這些控制因素能在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)影響基因的表達(dá)。一般而言，基因控制因素可包含一個(gè)原核細(xì)胞增強(qiáng)子系統(tǒng)或真核細(xì)胞增強(qiáng)子表達(dá)控制系統(tǒng)。這些系統(tǒng)通常包含一個(gè)可轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，一個(gè)控制轉(zhuǎn)錄開始的選擇性存在的操縱子，提高RNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，一段編碼合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，RNA剪切位點(diǎn)，終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列等等。表達(dá)載體通常包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，使得載體能獨(dú)立于宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。
“可操縱地連接的”是指若將第一個(gè)核酸序列與第二個(gè)核酸序列建立功能關(guān)系后，第一個(gè)核酸序列能與第二個(gè)相連接。舉例來說，如果一個(gè)增強(qiáng)子能影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則該增強(qiáng)子與該編碼序列可操縱地連接。一般而言，可操縱地連接的DNA序列處于相鄰位置，如果兩個(gè)序列都是蛋白質(zhì)編碼區(qū)，則都位于同一讀碼框內(nèi)。
一般而言，此類載體還另外含有能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的特異性基因?？晒┻x擇的各種標(biāo)記物可與任何構(gòu)建體結(jié)合。舉例來說，可以使用能賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞耐藥性、營養(yǎng)缺陷、耐細(xì)胞毒素性或表達(dá)表面蛋白等特性的供選擇標(biāo)記物。本發(fā)明測試系統(tǒng)所使用的表達(dá)載體還可包含一個(gè)標(biāo)簽序列。該序列使得重組蛋白能夠被檢測和分離，其非限定性例子可為HA、c-myc、GST、GFP及His-6中的任意一個(gè)，優(yōu)選序列為His-6。
根據(jù)本發(fā)明，還可使用原核及真核病毒載體表達(dá)人亞精胺合酶。
將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法早已為本領(lǐng)域人員所熟知。載體對(duì)宿主細(xì)胞的導(dǎo)入可通過任何能將該構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞的方法完成，例如磷酸鈣沉淀法，微注射法，電穿孔法或轉(zhuǎn)化法。詳請(qǐng)參閱《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(Ausubel，F(xiàn).M.ed.(1989)，John Wiley & Sons，NewYork)。
“細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)染細(xì)胞”是兩個(gè)在本申請(qǐng)書中常用的術(shù)語。其指代對(duì)象不僅是特定對(duì)象細(xì)胞，還包括其子代細(xì)胞或潛在子代細(xì)胞。盡管由于突變或環(huán)境影響，某些修飾在子代細(xì)胞中也可能出現(xiàn)，事實(shí)上子代細(xì)胞與母代細(xì)胞可能并不完全相同，但仍屬于該術(shù)語在此所指代的范疇。
“轉(zhuǎn)染細(xì)胞”是指通過重組DNA技術(shù)穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞。耐藥性或其他供選擇標(biāo)記物可部分用于轉(zhuǎn)化株的篩選。此外，供選擇標(biāo)記物的存在，如耐藥性在避免培養(yǎng)被微生物污染方面也可能起一定作用。上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的純培養(yǎng)可通過在所需誘導(dǎo)表型能夠存活的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而獲得。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指核酸的導(dǎo)入，如通過核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將病毒載體導(dǎo)入受體細(xì)胞。
本發(fā)明體外測試系統(tǒng)所使用的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞還可包含內(nèi)源性或外源性表達(dá)的核酸，其編碼的分子可能對(duì)亞精胺生物合成以及引起軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成和破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)的途徑有重要作用。
候選亞精胺合酶抑制劑對(duì)以轉(zhuǎn)染細(xì)胞為基礎(chǔ)的測試系統(tǒng)的作用可通過下列方法進(jìn)行評(píng)估，例如用細(xì)胞周期FACS分析或PCNA檢測軟骨細(xì)胞增殖，用阿爾新藍(lán)及茜素紅染色檢測軟骨細(xì)胞終末分化，用X型膠原免疫組化染色檢測軟骨細(xì)胞過度增殖。
在另一個(gè)可供選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明所采用的評(píng)估測試系統(tǒng)為包含內(nèi)源性表達(dá)亞精胺合酶的離體骨培養(yǎng)。優(yōu)選為胚胎骨培養(yǎng)。最優(yōu)選為由鼠胚胎后腿獲得的骨培養(yǎng)。
本測試系統(tǒng)中，不同候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞終末分化的作用將通過對(duì)實(shí)驗(yàn)骨和對(duì)照骨進(jìn)行染色來檢測，染色法采用茜素紅染色及能使正常關(guān)節(jié)軟骨著色的阿爾新藍(lán)染色。骨的徑向生長將通過增殖區(qū)域及鈣化骨長度的增加來計(jì)算。本測試系統(tǒng)將使用X型膠原免疫組化染色對(duì)過度增殖進(jìn)行評(píng)估，候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的作用將用PCNA進(jìn)行檢測。
另一個(gè)可供選擇的測試系統(tǒng)為動(dòng)物模型體內(nèi)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法，使用動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估能把關(guān)節(jié)炎的發(fā)生作為終點(diǎn)指示。將關(guān)節(jié)炎的發(fā)生作為終點(diǎn)指示可通過測量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腳爪厚度進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腳爪大小的增加小于對(duì)照組動(dòng)物的，就意味著所測試候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)或關(guān)節(jié)炎的發(fā)生起到了抑制作用。
在優(yōu)選測試系統(tǒng)中，適用的動(dòng)物模型可為表達(dá)外源性亞精胺合酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。確切地說，該轉(zhuǎn)基因鼠在II型膠原增強(qiáng)子的作用下表達(dá)亞精胺合酶。
根據(jù)此特定實(shí)施方案，該體內(nèi)測試系統(tǒng)對(duì)候選亞精胺合酶抑制劑作用的評(píng)估方法為，將候選抑制劑在通常情況下能導(dǎo)致亞精胺生物合成的條件下給予上述轉(zhuǎn)基因小鼠。這些特定的適宜條件可為在使用候選抑制劑前先給予對(duì)象轉(zhuǎn)基因鼠亞精胺合酶底物如SAM等。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”可為任何動(dòng)物，優(yōu)選為非人類哺乳動(dòng)物，鳥類或兩棲類動(dòng)物也可，該動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因成分，即用人為手段如轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入的異源性核酸。該核酸可通過精細(xì)的基因操作如微注射或重組病毒感染等方法直接或間接導(dǎo)入前體細(xì)胞?；虿僮鞑⒉话▊鹘y(tǒng)的雜種或體外受精法，而是直接指代重組DNA分子的導(dǎo)入。該分子可整合于染色體內(nèi)，或可為染色體外復(fù)制DNA。在本文描述的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因成分使細(xì)胞表達(dá)人亞精胺合酶基因。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還包括組成性(constitutive)及條件性(conditional)“敲除”動(dòng)物。本發(fā)明所指代的“非人類動(dòng)物”包括脊椎動(dòng)物，如嚙齒類動(dòng)物，非人類靈長類動(dòng)物，羊，狗，牛，雞，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物等。優(yōu)選非人類動(dòng)物為嚙齒類，包括大鼠和小鼠，最優(yōu)選為小鼠。“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指在其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)重組基因，或其某些細(xì)胞但并非全部細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組基因的動(dòng)物。
“轉(zhuǎn)基因成分”是指一段核酸序列(如編碼亞精胺合酶的序列)，其為部分或全部異源性或外源性，即對(duì)于其導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞而言是外來的；或者其與導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源性基因同源，但其插入動(dòng)物基因組的位點(diǎn)與天然基因的位點(diǎn)不同，或者其插入將導(dǎo)致基因敲除或其他失功能性突變。轉(zhuǎn)基因成分可包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列及其他核酸如內(nèi)含子，這對(duì)于所選擇核酸的最佳表達(dá)可能是必需的。
除了檢測關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以外，最好還能用上文所述離體測試系統(tǒng)所采用的終點(diǎn)指示對(duì)候選抑制劑對(duì)于轉(zhuǎn)基因鼠的作用進(jìn)行評(píng)估。
另一個(gè)優(yōu)選體內(nèi)測試系統(tǒng)可選用表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶的關(guān)節(jié)炎哺乳動(dòng)物模型。該模型可將關(guān)節(jié)炎的發(fā)生作為終點(diǎn)指示。
可通過測量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腳爪厚度對(duì)于關(guān)節(jié)炎的發(fā)生進(jìn)行檢測。只要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腳爪大小的增加小于對(duì)照組動(dòng)物的，就意味著所測試候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)或關(guān)節(jié)炎的發(fā)生起到了抑制作用。如前所述，該候選抑制劑的作用還將通過分化和增殖終點(diǎn)指示進(jìn)行進(jìn)一步檢測。
“動(dòng)物“是指任何適用于實(shí)驗(yàn)的、在分類學(xué)上屬哺乳動(dòng)物的，如大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、家兔、狗、貓等。優(yōu)選哺乳動(dòng)物為小鼠或大鼠，但本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法和系統(tǒng)最好也能適用于非哺乳類動(dòng)物。
根據(jù)特定優(yōu)選實(shí)施方案，關(guān)節(jié)炎哺乳動(dòng)物模型可以為外源性誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠或小鼠。確切地說，優(yōu)選大鼠為II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)雌性Lewis鼠。
本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案與骨性關(guān)節(jié)炎(OA)藥物組合物的制備方法相關(guān)。該方法由確定一種能導(dǎo)致對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程產(chǎn)生抑制作用的亞精胺合酶抑制劑，以及將上述抑制劑與藥用可接受載體相混合兩步驟組成。確定一種適合的抑制劑包括獲取一個(gè)候選抑制劑及對(duì)其作用的評(píng)估。根據(jù)該實(shí)施方案，候選的亞精胺合酶抑制劑可選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物組成的組，并對(duì)其作用進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。
一個(gè)替代方法為通過篩選可作為亞精胺合酶抑制劑的物質(zhì)來獲得候選抑制劑，并對(duì)其作用進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。根據(jù)本發(fā)明，上述篩選方法包含下列步驟(a)準(zhǔn)備包含亞精胺合酶的混合物；(b)將上述混合物與被篩選物質(zhì)在通常能引起亞精胺生物合成的條件下進(jìn)行接觸；以及
(c)確定被篩選物質(zhì)對(duì)終點(diǎn)指示的作用，對(duì)上述終點(diǎn)的抑制即意味著亞精胺合酶受到被篩選物質(zhì)的抑制。
根據(jù)該替代方法的一個(gè)特異性實(shí)施方案，終點(diǎn)指示可為亞精胺合酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的生成。上述產(chǎn)物可為亞精胺和甲基腺苷(MTA)中的任意一種。可通過熒光法或放射標(biāo)記法對(duì)其進(jìn)行檢測，具體方法在下文實(shí)施例4中將加以描述。
本發(fā)明篩選及評(píng)估的實(shí)驗(yàn)藥物可為基于蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、核酸、自然有機(jī)物、合成衍生有機(jī)物及抗體的物質(zhì)中任意一種。明確地說，上述基于核酸、蛋白質(zhì)或抗體的物質(zhì)可為組合文庫的產(chǎn)物。
術(shù)語“核酸”是指多核苷酸如脫氧核糖核酸(DNA)，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候?yàn)楹颂呛怂?RNA)。
該術(shù)語還應(yīng)包括由核苷酸類似物生成的RNA或DNA等價(jià)物及類似物，以及用于上述實(shí)施方案的雙鏈多核苷酸及單鏈多核苷酸如有意義(sense)或反義(antisense)單鏈多核苷酸。
在當(dāng)選藥物或物質(zhì)中，有模擬亞精胺合酶活性區(qū)域的肽類，以及非肽類小分子。就其識(shí)別的難易程度而言，肽類在替代檢測亞精胺合成抑制作用的篩選實(shí)驗(yàn)中尤為有用。盡管上述篩選實(shí)驗(yàn)在對(duì)大型化學(xué)物質(zhì)庫的直接篩庫中未必全部適用，但可與其他技術(shù)合用在所選方向上對(duì)候選物質(zhì)進(jìn)行精細(xì)篩選。
本發(fā)明并不僅限于所公開及描述的實(shí)施例、方法步驟及材料，這些方法步驟及材料可在一定程度上改變。同樣由于本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書及其等價(jià)物所限定，因此本說明書中所用術(shù)語并非限定性，而是僅用于描述特定實(shí)施方案。
必須指出的是，除非在內(nèi)容中明確說明，否則本說明書及附錄權(quán)利要求書中單數(shù)意義的“一個(gè)”、“一種”、“該(所述)”等冠詞亦包括復(fù)數(shù)范圍。
在本說明書及下文權(quán)利要求書中，除非在上下文中明確指出，否則“包含”一詞應(yīng)理解為包括一個(gè)或一組規(guī)定的整數(shù)或步驟，而并非意味著除外其他任何一個(gè)或一組規(guī)定的整數(shù)或步驟。
下文所列舉的實(shí)施例代表發(fā)明人在本發(fā)明的各個(gè)方面中所使用的技術(shù)。在仿效本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案使用這些技術(shù)時(shí)，本領(lǐng)域人員在本說明書所公開的基礎(chǔ)上，可在不破壞本發(fā)明整體領(lǐng)域的前提下對(duì)其進(jìn)行各種修改。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)1.細(xì)胞系1.1.HMSC-由人軟骨獲得的正常成年人關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞。軟骨在切割后于新鮮DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中還加入了10％FCS，L-谷酰胺和抗生素。兩周后去除殘余碎片，并獲得貼壁細(xì)胞。
1.2.U2OS-由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(HTB-96)獲得的人成骨細(xì)胞樣骨肉瘤細(xì)胞系。
1.3.RCJ3.1C5.18-由加拿大多倫多大學(xué)Jane Aubin教授捐贈(zèng)的細(xì)胞系。對(duì)該細(xì)胞系的描述請(qǐng)參閱《成軟骨大鼠細(xì)胞系新家族中軟骨祖細(xì)胞頻率及軟骨分化的分析》(Grigoriadis A.E，Heersche J.N，AubinJE(1996)Differentiation，60299-307)。
1.4.293人腎細(xì)胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(CRL-1573)。
2.機(jī)械牽拉(mechanical stress)HMSC細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長以使其融合。第二代次代培養(yǎng)為將細(xì)胞以1×105/cm2的密度接種于聚氨基甲酸乙酯軟膜上，并將其用夾子固定于機(jī)械裝置上。為使細(xì)胞更好地貼附和生長，該膜事先用完全血清在室溫下預(yù)處理了60分鐘。在24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞貼附于膜上。將該膜用夾子牽拉伸長33％以對(duì)其進(jìn)行張力處理。該張力保持穩(wěn)定達(dá)1小時(shí)。用機(jī)械刮除法收集細(xì)胞以用于分離RNA。壓縮步驟如下所述在接種細(xì)胞前將軟膜用夾子固定于機(jī)械裝置上，并將其牽拉伸長25％，再接種細(xì)胞并孵化24小時(shí)使其貼附于膜上。然后將拉緊的軟膜放松使其恢復(fù)原先長度，使細(xì)胞壓縮。壓縮細(xì)胞在進(jìn)行RNA提取前先靜置1小時(shí)。
3.轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染根據(jù)制造者的說明，用Lipofectamine 2000試劑(GibcoBRL)將人亞精胺合酶基因克隆入pCMVNSVneo表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染RCJ3.1C5.18細(xì)胞。在每毫升培養(yǎng)基中加入0.3mg G418后篩選出穩(wěn)定克隆。
RT-PCR根據(jù)產(chǎn)品說明書，用EZ-RNA分離試劑盒(Biological Industries)提取穩(wěn)定RCJ3.1C5.18克隆的全部RNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書，用Superscript II試劑盒(GibcoBRL)進(jìn)行第一條cDNA鏈的合成及PCR反應(yīng)。
Northern印跡用U2OS細(xì)胞提取的RNA與人亞精胺合酶進(jìn)行Northern印跡。每個(gè)印跡包含2μg多聚腺苷酸+RNA，并用亞精胺合酶完全開放讀碼框作為探針。具體方法參見《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(Ausubel FM等(ed)，(1987)，Vol.1，Section 4.9.1.)。
分化標(biāo)記物染色1.阿爾新藍(lán)染色用Bouin固定劑將胚胎骨固定10分鐘，再用阿爾新藍(lán)(用3％的醋酸制成1％溶液)染色30分鐘，用蒸餾水洗滌。
2.茜素紅染色用70％乙醇溶液將胚胎骨固定，在冰上孵化60分鐘后再用40mM的茜素紅溶液(Sigma)染色10分鐘。
檢測增殖1.PCNA法根據(jù)產(chǎn)品說明書，用抗PCNA抗體(DAKO)對(duì)胚胎骨切片進(jìn)行免疫組化染色。
檢測過度增殖X型膠原法根據(jù)產(chǎn)品說明書，用抗X型膠原抗體(quartett)對(duì)胚胎骨切片進(jìn)行免疫組化染色。
動(dòng)物模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型小鼠CIA詳請(qǐng)參閱《對(duì)II型膠原的自身免疫關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型》(Trentham D.E，Townes A.S，Kang A.H(1977).J.Exp.Med.146857-868)。
佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AA)AA詳請(qǐng)參閱《活化T細(xì)胞通過osteoprotegerin配體在佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎中調(diào)節(jié)骨丟失和關(guān)節(jié)破壞》(Kong Y.Y等，(1999).Nature，402304-308)。
半月板切除術(shù)模型半月板切除術(shù)詳請(qǐng)參閱《透明質(zhì)酸鈉在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)中對(duì)家兔膝關(guān)節(jié)的作用》(Hah F，Ishiguro N，Ito T，Sakai T，Iwata H.(1999).NagoyaJ Med Sci Nov，62(3-4)115-26)。
實(shí)施例1確定骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和軟骨修復(fù)所涉及基因的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑榱死斫釵A發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制，發(fā)明人使用了一系列體外和離體模型。同時(shí)使用數(shù)個(gè)互相補(bǔ)充的模型促進(jìn)了對(duì)幾個(gè)相互關(guān)聯(lián)但又相互獨(dú)立生理狀況的分類，從而也促進(jìn)了對(duì)某特定生理或病理步驟決定性基因的選擇。
所采取的實(shí)驗(yàn)策略是基于以下已知事實(shí)上的1.保存于組織培養(yǎng)物內(nèi)的正常成人關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞(HMSC細(xì)胞)及新鮮分離的人胎兒骨骺能準(zhǔn)確地模擬關(guān)節(jié)軟骨的正?；虮磉_(dá)模式。
2.關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)生長的經(jīng)IGF-1處理的HMSC細(xì)胞和分離的人胎兒骨骺能模擬軟骨修復(fù)相關(guān)步驟正常軟骨細(xì)胞成熟，為HMSC細(xì)胞過度合成高質(zhì)基質(zhì)，以及為骨骺保留正常軟骨結(jié)構(gòu)。請(qǐng)注意，為了模擬損傷后軟骨修復(fù)過程，發(fā)明人在關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)生長的部分骨骺內(nèi)刻意制造了軟骨缺陷。
3.FGF-2及IL-1β，該兩者都為成骨因子，都促進(jìn)HMSC細(xì)胞啟動(dòng)成骨過程。
4.牽拉或壓縮等機(jī)械刺激可能會(huì)引起軟骨缺陷，導(dǎo)致周圍軟骨退化和超氧陰離子及一氧化氮(NO)合成增加，因而能模擬OA的表現(xiàn)。
因此，由IGF-1及關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)軟骨生長引起的基因表達(dá)的改變對(duì)正常軟骨的功能是有益的，可通過對(duì)其模擬起到治療作用。與此相反的是，由IL-1、FGF-2及機(jī)械刺激引起的基因表達(dá)的改變可能與OA發(fā)生有關(guān)，因此應(yīng)通過治療手段對(duì)其進(jìn)行拮抗。
1.1.體外測試系統(tǒng)所選用細(xì)胞為人間葉干細(xì)胞(HMSC細(xì)胞)。骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制提示，在患病關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，間葉干細(xì)胞不僅分化成軟骨細(xì)胞系(正常修復(fù)過程所需)，還分化為成骨細(xì)胞及成纖維系細(xì)胞，因而使得損傷修復(fù)過程同時(shí)也成為致病過程。此外，通常靜止于II型膠原期的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)一步分化為肥大軟骨細(xì)胞。如此周而復(fù)始，由于成骨因子的分泌(見上文)使得祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化增多(這兩種前體細(xì)胞并非常駐細(xì)胞，而是在骨髓內(nèi)產(chǎn)生的)。根據(jù)已知事實(shí)，數(shù)種刺激可能對(duì)間葉干細(xì)胞產(chǎn)生作用并使其發(fā)生異常分化。這些刺激包括廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)成分及結(jié)構(gòu)變化，生長因子、細(xì)胞因子、化學(xué)因子的分泌，以及持續(xù)的機(jī)械強(qiáng)制作用。由不同刺激因素激活的間葉干細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑為強(qiáng)制性步驟。正是由于這個(gè)原因，體外研究采用了源于關(guān)節(jié)軟骨的正常成人間葉干細(xì)胞培養(yǎng)。這些細(xì)胞是由University of Tel Aviv醫(yī)學(xué)院的Zvi Nevo教授向申請(qǐng)人提供的。
發(fā)明人選用了下列處理方法IGF-1使用對(duì)正常軟骨功能和恢復(fù)有益的生長因子。抑制將最終導(dǎo)致軟骨骨替代的軟骨細(xì)胞終末分化及軟骨血管化。
白介素-1已知該炎癥細(xì)胞因子在OA關(guān)節(jié)內(nèi)過度產(chǎn)生。其誘導(dǎo)軟骨退化酶、骨重吸收細(xì)胞因子和生物活性分子如TNF-a、IL-6、可溶性IL-6受體(slL-6R)和NO的表達(dá)。
FGF-2該成纖維生長因子已被應(yīng)用于OA發(fā)病機(jī)制及該疾病動(dòng)物模型中。重癥OA患者的FGF-2濃度顯著高于輕癥患者的。
在協(xié)同培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，用重癥RA患者滑液刺激產(chǎn)生的破骨細(xì)胞形成過程在使用FGF-2抗體中和后被實(shí)質(zhì)性抑制，且該抑制作用強(qiáng)于其他細(xì)胞因子抗體的抑制作用。發(fā)明人由此得出結(jié)論，OA患者滑液內(nèi)源性FGF-2水平的上升可能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞(其作用可能直接進(jìn)行觀察)及破骨細(xì)胞系(靶細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá)可能是破骨反應(yīng)的間接介質(zhì)，可對(duì)其進(jìn)行觀察)在關(guān)節(jié)破壞中起一定作用。
機(jī)械刺激持續(xù)性機(jī)械負(fù)荷是OA發(fā)病的主要原因之一。
1.2.離體測試系統(tǒng)所選用系統(tǒng)為關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)生長的完整分離骨骺*。
除體外實(shí)驗(yàn)外，發(fā)明人還使用了關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)生長的分離胎兒骨骺離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停撃Ｐ褪怯蒢vi Nevo教授和Dr.Dror Robinson建立的，生長中的分離骨骺在該特殊裝置中引起人間葉干細(xì)胞的顯著增殖及其向成熟功能性軟骨細(xì)胞的分化，以及大量高質(zhì)基質(zhì)的合成。與此相反的是，在常規(guī)組織培養(yǎng)條件下得到的骨骺關(guān)節(jié)組織大量凋亡和壞死。該模型的優(yōu)越性體現(xiàn)在其能更好地反映在復(fù)雜組織內(nèi)發(fā)生的基因事件(用關(guān)節(jié)模擬裝置儲(chǔ)存移植用活胚胎及成人軟骨移植物Cohen，I.，Robinson，D.，Cohen，N.，Nevo，Z.(2000)，Biomaterials，212117-2123)。
*該關(guān)節(jié)模擬器由一個(gè)無菌生長槽組成，通過一個(gè)封閉的管道系統(tǒng)由大培養(yǎng)基儲(chǔ)存器補(bǔ)充培養(yǎng)基。因此關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)的軟骨能不斷獲得富含CO2的新鮮培養(yǎng)基。
在體內(nèi)，關(guān)節(jié)軟骨是由滑液滋養(yǎng)的，關(guān)節(jié)活動(dòng)及負(fù)荷所產(chǎn)生的靜水壓不斷地將滑液泵入關(guān)節(jié)腔。深層軟骨，確切地說是鈣化帶上方的生長層軟骨是由血管滋養(yǎng)的。因此在正常關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在兩種搏動(dòng)模式，即關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)和血液循環(huán)模式。在關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)，培養(yǎng)基以事先確定的最佳速度即570ml/h持續(xù)作用于組織。蠕動(dòng)移液泵則產(chǎn)生類似于收縮壓范圍(150mmHg，100次/分)的正弦式壓力。總而言之，關(guān)節(jié)模擬器的優(yōu)點(diǎn)在于—持續(xù)灌注系統(tǒng)為組織提供了充分的營養(yǎng)，并避免了廢棄產(chǎn)物的堆積；—灌注系統(tǒng)模擬了作用于關(guān)節(jié)軟骨的靜水壓和重力作用以刺激軟骨生長。
實(shí)施例2
實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)的確立1.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)明人用HMSC細(xì)胞進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)。通過各種處理方法引起成軟骨反應(yīng)(如IGF-1)或成骨及血管形成反應(yīng)(如IL-1和FGF-2)。體外實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了兩輪。最初進(jìn)行的是校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，以確定各種刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)的時(shí)間/劑量動(dòng)力學(xué)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了制備RNA的大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，并將RNA用于基因表達(dá)輪廓實(shí)驗(yàn)。
1.1體外細(xì)胞系統(tǒng)的校準(zhǔn)為了驗(yàn)證HMSC細(xì)胞對(duì)不同刺激的分化反應(yīng)，發(fā)明人將細(xì)胞用不同方法處理(見表1)，并用免疫組化染色檢測其成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞系細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)。為完善HMSC細(xì)胞對(duì)分化處理的反應(yīng)，發(fā)明人用不同的細(xì)胞密度(稀疏和融合)研究其生長。
表1.先導(dǎo)研究中對(duì)HMSC細(xì)胞的處理方案

“機(jī)械刺激”如實(shí)驗(yàn)步驟中所述。
在實(shí)驗(yàn)中對(duì)下列分化標(biāo)記物進(jìn)行了檢測軟骨細(xì)胞終末分化及骨發(fā)生標(biāo)記物—骨鈣蛋白(骨細(xì)胞)；
—VEGF(肥大軟骨細(xì)胞，血管形成)；—成纖維生長因子受體3(FGFR 3)(軟骨祖細(xì)胞及上級(jí)肥大軟骨細(xì)胞)。
軟骨形成標(biāo)記物—II型膠原(軟骨細(xì)胞成熟)；—阿爾新藍(lán)(軟骨細(xì)胞成熟)。
經(jīng)校正的最佳處理方法的結(jié)果如圖1-3所示。
所獲結(jié)果說明下列問題1.HMSC細(xì)胞能在高密度(融合細(xì)胞)生長及成熟，并表現(xiàn)出分化為成軟骨細(xì)胞系和成骨細(xì)胞系跡象，但是沒有肥大軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞特異性標(biāo)記物的顯著表達(dá)(見圖1-3，對(duì)照細(xì)胞)。
2.阿爾新藍(lán)染色證實(shí)，IGF-1通過增加II型膠原表達(dá)及減少FGFR3表達(dá)加速軟骨細(xì)胞成熟及軟骨基質(zhì)產(chǎn)生(見圖1)。
3.IL-1β或FGF-2對(duì)HMSC細(xì)胞似乎都有復(fù)合作用，該處理i)誘導(dǎo)祖細(xì)胞增殖，如FGFR-3表達(dá)增加所示(可能還同時(shí)反映對(duì)軟骨細(xì)胞終末分化的誘導(dǎo)，見下文)；ii)VEGF表達(dá)增加提示對(duì)軟骨細(xì)胞終末分化及血管形成的促進(jìn)；iii)骨鈣蛋白表達(dá)增加提示對(duì)骨發(fā)生的刺激；iv)阿爾新藍(lán)染色減少提示對(duì)正常軟骨基質(zhì)產(chǎn)生的抑制。
結(jié)論—IGF-1僅能刺激HMSC細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞系分化，并對(duì)其向成骨細(xì)胞系分化有一定抑制作用。因此可將其作為意圖發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物促進(jìn)正常軟骨形成或抑制OA骨贅形成的基因的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> —IL-Iβ或FGF-2會(huì)使HMSC細(xì)胞發(fā)生OA中的大多數(shù)變化。
因此，其表達(dá)受該兩者影響的基因可作為抗OA藥物的潛作用靶點(diǎn)。
1.2.基因表達(dá)輪廓全尺寸體外實(shí)驗(yàn)在先導(dǎo)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了如下調(diào)整1.由于沒有觀察到HMSC細(xì)胞發(fā)生任何劑量依賴性反應(yīng)，因此在每種處理方案中僅使用一種劑量的細(xì)胞因子/生長因子(起初設(shè)計(jì)使用兩種劑量)。這是由于在本研究中所使用的細(xì)胞因子/生長因子劑量都超出了生理范圍之外。因此任何預(yù)定劑量都可能足以引起細(xì)胞的最大反應(yīng)，增大劑量不會(huì)增加細(xì)胞反應(yīng)。此外，大劑量的IL-1β處理顯示出細(xì)胞毒作用。
2.增加了收獲細(xì)胞以制備RNA的時(shí)間點(diǎn)(由預(yù)定的2個(gè)增加到了5個(gè))，以增加各種處理方案引起的基因反應(yīng)產(chǎn)物的溶解。
全尺寸實(shí)驗(yàn)中使用的處理方案總結(jié)見表2。
表2.全尺寸實(shí)驗(yàn)中對(duì)HMSC細(xì)胞的處理方案

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都進(jìn)行了堿性磷酸酶染色。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了兩次，總共進(jìn)行了44次實(shí)驗(yàn)(22種處理方案×2次重復(fù))。所獲RNA用于制備專用OA芯片(見下文)以及用于雜交“OA”芯和“纖維變性”芯片的探針。
2.OA研究離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统鼿MSC體外測試系統(tǒng)外，發(fā)明人還分別于切除同時(shí)及在關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)生長3天后提取(胎齡22周)人胎兒骨骺RNA。由于在原定的第一天時(shí)間點(diǎn)上沒有觀察到任何生物效應(yīng)，因而將該點(diǎn)取消。為了啟動(dòng)基質(zhì)恢復(fù)，在將其置于關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)之前先對(duì)部分骨骺進(jìn)行了損傷。由于先導(dǎo)研究已經(jīng)證實(shí)，骨骺在常規(guī)組織培養(yǎng)條件下無法存活，因而用該損傷后培養(yǎng)的方案取代了原定在常規(guī)組織培養(yǎng)條件下對(duì)骨骺進(jìn)行離體培養(yǎng)的方案。每個(gè)離體實(shí)驗(yàn)皆進(jìn)行了兩次，總共進(jìn)行了6次實(shí)驗(yàn)(3種條件×2次重復(fù)＝6次實(shí)驗(yàn))(見表3)。離體實(shí)驗(yàn)所提取的RNA也同樣用于制備專用“OA”芯片。由此產(chǎn)生的探針用于雜交“OA”芯片和“纖維變性”芯片。
表3關(guān)節(jié)模擬器內(nèi)人胎兒骨骺的處理方案

*每個(gè)探針都是從由3個(gè)經(jīng)類似方法處理的骨骺提取的RNA池中制備的。
實(shí)施例3確定在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和軟骨修復(fù)中涉及的基因
1.制備“OA”和“纖維變性”芯片發(fā)明人用其SDGI法由經(jīng)上述方法處理的HMSC細(xì)胞提取的RNA及由離體實(shí)驗(yàn)所獲的RNA池制備“OA”芯片，其具體方法的描述見于出版號(hào)為No.WO01/75180的美國專利申請(qǐng)，其全文在此并入以作參考。其共包含10,000個(gè)cDNA克隆。“纖維變性”芯片也通過發(fā)明人的上述SDGI法制備。
2.與cDNA微陣列雜交。
2.1.標(biāo)記探針并與DNA微陣列雜交用1克polyA RNA合成探針，RNA由經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript，Gibco-BRL)及18-mer oligo-dT引物處理的樣本獲得。在逆轉(zhuǎn)錄過程中還使用了Cy3-dCTP(Amersham)或Cy5-dCTP(Amersham)標(biāo)記cDNA。雜交、以及接下來的掃描和顯影方法參見Schena，M.等(1996)Proc Natl Acacl，Sci ilSA 93，10614-10619。雜交質(zhì)控用發(fā)明人自身的方法進(jìn)行。
2.2.雜交設(shè)計(jì)根據(jù)表4，用cDNA探針去雜交OA及人纖維變性cDNA微陣列。
在所有的雜交中，探針2都是同樣的，其成分為0時(shí)間點(diǎn)RNA提取物(見表4，共用對(duì)照)。其作為標(biāo)準(zhǔn)化探針使得我們可將不同雜交的結(jié)果用統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行比較。每種雜交的探針1都是由經(jīng)各種方法處理的細(xì)胞或離體培養(yǎng)器官提取的RNA制備的。全套雜交重復(fù)2次，總次數(shù)為26種雜交×2個(gè)cDNA微陣列×2次重復(fù)＝104次雜交。
表4雜交方案


*探針SOA5表現(xiàn)出偽象，因而在進(jìn)一步分析中將其舍去。
2.3.雜交結(jié)果分析發(fā)明人用運(yùn)算法則分析雜交數(shù)據(jù)以進(jìn)行質(zhì)量控制，并用兩種不同的算法分析基因群集。
2.3.1質(zhì)量控制質(zhì)量控制的目的在于準(zhǔn)確平衡Cy3和Cy5信號(hào)，以檢測出在某給定雜交中推定為鑒別價(jià)值很差的“可疑”信號(hào)，并將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為合適的形式以共進(jìn)一步分析。用于檢測在某給定雜交中推定為鑒別價(jià)值很差的“可疑”像素的算法，是建立在一套實(shí)驗(yàn)中不同雜交的共用對(duì)照信號(hào)對(duì)數(shù)在二維平面上穩(wěn)定分布的基礎(chǔ)上的。
在正常情況下，該分布集中于對(duì)角線，數(shù)據(jù)變異有其合理的穩(wěn)定性。根據(jù)該變異，可對(duì)任一像素是否“可疑”進(jìn)行評(píng)分，這些“可疑”像素即被自動(dòng)標(biāo)記。如果某雜交中僅有部分像素為“可疑”，則該雜交可用于進(jìn)一步的分析，但必須事先了解的是那些數(shù)據(jù)是可信的，而那些不是。
2.3.2群集算法算法1.該步驟為“盲算”，并不需要事先了解生物條件之間的關(guān)系。
在多維空間中，待分析基因都是分布于其中的點(diǎn)，群集的基礎(chǔ)找出其中最密集的區(qū)域。密度的計(jì)算是通過相關(guān)性或歐幾里德距離得到的。具體算法大致如下所述。選擇待分析基因最密集的區(qū)域，將其定為第一群，將密集其次且與第一個(gè)區(qū)域無交集的區(qū)域定為第二群，依此類推。對(duì)區(qū)域范圍的限定所依據(jù)的原則是該區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)化的基因的平均表觀為1。根據(jù)其在空間中的接近程度，這些窄群可進(jìn)一步合并為寬群。根據(jù)其在全部基因表達(dá)輪廓的共變矩陣中分布的程度將經(jīng)確定的群進(jìn)行排位。
算法2.待分析組內(nèi)不同雜交的生物學(xué)分類的假說一經(jīng)確立，即可檢測其行為與該假說密切相關(guān)的基因。用Fisher標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算每個(gè)基因的差別表現(xiàn)。那些差別基因是最顯著的基因。
根據(jù)下列方案對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析1.對(duì)每個(gè)微陣列分別進(jìn)行質(zhì)量控制。
2.對(duì)每個(gè)微陣列按算法1分別進(jìn)行群集。
3.對(duì)每個(gè)微陣列按算法2分別進(jìn)行群集。
4.對(duì)每個(gè)微陣列分別進(jìn)行群集數(shù)據(jù)比較。
5.單獨(dú)按算法1、單獨(dú)按算法2及同時(shí)按兩種算法對(duì)每個(gè)微陣列進(jìn)行選擇，將所獲數(shù)據(jù)建立一個(gè)統(tǒng)一的群集基因表達(dá)數(shù)據(jù)組6.確定最突出的基因表達(dá)模式(群集)并據(jù)其選擇用于測序和注解的基因。
7.(用上述算法識(shí)別后)將由兩個(gè)微陣列選擇出來的基因組進(jìn)行測序基礎(chǔ)上的比較，并確證同一基因的表達(dá)模式是一致的。
8.建立由兩個(gè)微陣列所獲群集基因的無冗余目錄。
9.進(jìn)一步解釋那些與EST’s(識(shí)別及同族搜索)一致的無注解克隆。
10.進(jìn)一步解釋未知基因和推定蛋白(同族搜索和結(jié)構(gòu)域分析)。
11.對(duì)已知基因進(jìn)行文獻(xiàn)分析。
2.4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果在完成了對(duì)雜交結(jié)果的全部分析之后，發(fā)明人得到一個(gè)基因目錄，其中57個(gè)基因是由“纖維變性”芯片獲得的，197個(gè)是由“OA”芯片獲得的。
根據(jù)已有生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和公共數(shù)據(jù)庫的資料，發(fā)明人對(duì)部分已知基因進(jìn)行了分析。
其中最令人感興趣的是IL-1和FGF調(diào)節(jié)基因，這是由于其作為骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)的潛在意義(見上文)，即軟骨基質(zhì)的退化和對(duì)異位骨發(fā)生的刺激。
因此，其表達(dá)受FGF-2的基因影響的基因是本發(fā)明的終點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。
該范疇內(nèi)的基因是指在經(jīng)FGF處理細(xì)胞內(nèi)其表達(dá)不同于未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的基因。
在已經(jīng)確認(rèn)的基因中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)亞精胺合酶(也表示為SEQ IDNo.1)的表達(dá)受FGF-2上調(diào)，但其在關(guān)節(jié)炎性疾病中的作用仍然未知。
亞精胺是三種生物活性多胺的其中之一。在小牛肩胛骨骨骺軟骨中，多胺在骨化區(qū)即鈣化發(fā)生的部位的濃度比靜止區(qū)的要大。其中亞精胺含量大于精胺和腐胺含量。由于只能在靜止區(qū)組織內(nèi)檢測到鳥氨酸脫梭酶，因此多胺的生物合成發(fā)生于靜止區(qū)，隨后在骨化區(qū)濃聚。免疫組化證據(jù)亦顯示僅在骨化區(qū)有細(xì)胞外亞精胺的存在。因此，多胺可能與骨化前軟骨的鈣化有關(guān)(Vittur F等1986)。亞精胺依賴性蛋白在由1α，25-(OH)2D3及白介素4誘導(dǎo)的小鼠齒槽巨噬細(xì)胞融合中有一定作用。多胺，尤其是亞精胺，可能是1α，25-(OH)2D3誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成并最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞融合的重要細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)。當(dāng)加入甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(丙咪腙)(MGBG)抑制亞精胺合成后，1α，25-(OH)2D3誘導(dǎo)合成增加的14種蛋白質(zhì)中，其中9種合成增加效應(yīng)顯著減小，同時(shí)巨噬細(xì)胞的融合也隨之受到抑制。再次加入亞精胺則使該9種蛋白質(zhì)的合成及巨噬細(xì)胞的融合得到恢復(fù)。由于破骨細(xì)胞也必須經(jīng)由融合才能獲得活性，因此多胺可能在破骨細(xì)胞活化過程中有一定作用。維生素D在骨骼形成過程中的已知作用也支持該假說(Hayashi T等，1986)。
在此本發(fā)明人第一個(gè)證實(shí)了FGF-2對(duì)HMSC細(xì)胞亞精胺合酶的上調(diào)作用可能有骨發(fā)生作用。因此亞精胺合酶可作為篩選OA候選藥物的優(yōu)選靶點(diǎn)。
實(shí)施例4對(duì)亞精胺合酶抑制劑作為OA藥物可能性的評(píng)估將亞精胺合酶作為篩選可用于抑制或延緩OA藥物的候選抑制劑的靶點(diǎn)是基于其受bFGF-2(3ng/ml bFGF，50mg/ml維生素C和10-8M地塞米松)上調(diào)的事實(shí)上的。此外，對(duì)人胚胎骨的原位雜交研究顯示，在滑膜內(nèi)、骨小梁附近成骨細(xì)胞內(nèi)以及骨內(nèi)膜內(nèi)有亞精胺合酶的表達(dá)。在新發(fā)生骨的軟骨細(xì)胞內(nèi)也觀察到了同樣的信號(hào)。
以下發(fā)現(xiàn)支持亞精胺合酶在OA中可能起一定作用1.骨化軟骨的多胺含量比靜止區(qū)的高。骨化區(qū)的亞精胺含量比靜止區(qū)高5倍，精胺含量高2倍。骨化區(qū)的亞精胺/精胺比值為1.7，而靜止區(qū)的比值為0.69(Vittur F等，1986)。
2.關(guān)節(jié)炎患者滑液中的多胺水平增高(Nesher G等，1997)。
3.ODC生物合成抑制劑在降低亞精胺水平及血清抗II型膠原抗體的同時(shí)，能預(yù)防膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的發(fā)生(Wolos J.A等，1990)。
4.抑制亞精胺的生物合成能抑制巨噬細(xì)胞融合。加入亞精胺能使該活性恢復(fù)(Hayashi T等，1986)。
5.體外研究顯示，三種多胺中僅亞精胺具有將蛋白多糖亞基從II型膠原柱上置換下來的能力(Vittur F等，1986)。
6.亞精胺能增加堿性磷酸酶的活性(過度增殖及鈣化的標(biāo)記物)(Vittur F等，1986)。
在第一次大體分析中，發(fā)明人使用Northern印跡分析亞精胺合酶在不同組織內(nèi)的基因表達(dá)形式。如圖4所示，在所有檢測組織內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了所預(yù)期的1.3Kb mRNA條帶。
1.潛在的亞精胺合酶抑制劑發(fā)明人對(duì)下列現(xiàn)有已知的不同亞精胺合酶抑制劑作為OA藥物的可能性進(jìn)行了評(píng)估腺苷亞精胺AdoDATODCHA反式-4-甲基環(huán)己胺環(huán)己胺甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))2-巰基丙胺N-氯磺酰二環(huán)己胺5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷1-氨基氧基-3-氨基丙烷5′-(異丁硫基)腺苷5′-(甲硫基)腺苷還對(duì)用下列篩選方法所獲的新亞精胺合酶抑制劑進(jìn)行了評(píng)估1.1.放射性法用放射性酶標(biāo)法檢測亞精胺合酶的方法詳見《快速法檢測腐胺氨丙基轉(zhuǎn)移酶(亞精胺合酶)和亞精胺氨丙基轉(zhuǎn)移酶(精胺合成酶)》(Raina，A.，Eloranta，T.，Pajula，R.L.(1983)，酶學(xué)方法94257260.)。這些方法中要使用3H-，14C-或35S-標(biāo)記的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(用E.coli SAM合成酶制備標(biāo)記甲硫氨酸)。對(duì)甲硫氨酸中最初標(biāo)記原子的選擇決定何種產(chǎn)物(亞精胺或甲基腺苷(MTA))被最終標(biāo)記。在最初的使用方法中使用DL-(2-14C)甲硫氨酸，得到標(biāo)記的亞精胺產(chǎn)物。該方法需將標(biāo)記亞精胺與標(biāo)記反應(yīng)物脫梭SAM分開，不能滿足高產(chǎn)量篩選(HTS)的要求。因而產(chǎn)生了改良法，即使用L-(甲基-14C)甲硫氨酸，最后產(chǎn)生標(biāo)記產(chǎn)物為甲基腺苷，使得實(shí)驗(yàn)方法大大簡化，從而成為HTS生物方法發(fā)展的候選方向之一。簡而言之，該方法需將標(biāo)記脫梭SAM與標(biāo)記MTA分開，用磷纖維素陽離子交換器即可做到。該交換器在酸性條件下結(jié)合MTA，而不結(jié)合脫梭SAM。
1.2.熒光法現(xiàn)有多種不同的熒光法可用于識(shí)別一級(jí)胺和二級(jí)胺。在該方法中，一級(jí)胺先與水楊醛反應(yīng)以獲得希夫堿。亞精胺和腐胺之間的差異在于前者有一個(gè)二級(jí)胺，因而該二級(jí)胺可與丹磺酰氯或NBD氯化物反應(yīng)以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
2.對(duì)亞精胺合酶抑制劑作為OA藥物可能性的評(píng)估為了評(píng)估不同亞精胺合酶抑制劑作為OA藥物的可能性，發(fā)明人對(duì)其導(dǎo)致的對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及終末分化的抑制，以及對(duì)關(guān)節(jié)炎發(fā)生的抑制作用進(jìn)行了檢驗(yàn)。發(fā)明人用下列評(píng)估測試系統(tǒng)對(duì)不同的亞精胺合酶抑制劑進(jìn)行了檢驗(yàn)2.1.體外測試系統(tǒng)2.1.1.人亞精胺合酶全長cDNA的亞克隆發(fā)明人用U2OS細(xì)胞提取的RNA通過RT-PCR克隆了人亞精胺合酶的全部開放讀碼框(接入號(hào)為BC000309和NM-003132)。用AvrII和KpnI雙分解RT-PCR產(chǎn)物，并將其亞克隆為pCMVNSV-neo和pBScKS以用于TNT反應(yīng)。此外，發(fā)明人還用RT-PCR法克隆了在N端用組蛋白標(biāo)記的全部開放讀碼框。用AvrII消化RT-PCR產(chǎn)物，并將其亞克隆為pBSc以用于TNT反應(yīng)。用NotI和HindIII消化該構(gòu)建體，并將嵌入段亞克隆入pCMVNSV-neo NotI-HindIII。將上述四種構(gòu)建體完全測序，其結(jié)果證實(shí)克隆序列于公布序列完全匹配。此外，還將該基因亞克隆為pIRES-puro表達(dá)載體(Clontech)。
2.1.2.用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞檢驗(yàn)亞精胺合酶構(gòu)建體為了檢驗(yàn)上述構(gòu)建體，發(fā)明人使用了用人亞精胺合酶cDNA(包含組蛋白標(biāo)記并克隆為pIRES puro)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長2天后收集培養(yǎng)液及溶解產(chǎn)物。用10％SDS凝膠分離蛋白質(zhì)，再進(jìn)行雜交。用抗組蛋白抗體與膜進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果觀察到了所預(yù)期的35kDa條帶(代表亞精胺合酶的一個(gè)亞基)(見圖5)。
2.1.3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞中增殖或分化速率的增加用過度表達(dá)外源性人亞精胺合酶基因的不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(如軟骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞)檢驗(yàn)一個(gè)亞精胺合酶抑制劑，可獲得不同的終點(diǎn)指示參數(shù)，其結(jié)果意味著對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及其終末分化的抑制。增殖或分化速率增大則意味著上述基因可能在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎發(fā)生的途徑中起一定作用。
2.1.4.建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系將缺乏組蛋白標(biāo)記的人亞精胺合酶cDNA克隆為pCMVneo表達(dá)載體，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RCJ3.1.C5.18細(xì)胞系。用RT-PCT法共分離了30個(gè)以上的克隆并對(duì)其進(jìn)行了篩選(見圖6)。選擇最高表達(dá)克隆用于藥物評(píng)估實(shí)驗(yàn)。
用提示軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)的終點(diǎn)指示檢驗(yàn)亞精胺合酶的過度表達(dá)效應(yīng)。這些參數(shù)在過去已經(jīng)被證實(shí)與OA相關(guān)。本發(fā)明的體外測試系統(tǒng)也被用于評(píng)估不同亞精胺合酶抑制劑抑制及減弱這些效應(yīng)的能力。
用阿爾新藍(lán)染色(將軟骨蛋白多糖著色)、堿性磷酸酶活性及X型膠原免疫組化染色可評(píng)估軟骨細(xì)胞的分化。堿性磷酸酶活性或X型膠原免疫組化染色的增加意味著軟骨細(xì)胞的終末分化。
軟骨細(xì)胞增殖可通過測定細(xì)胞數(shù)量和胸腺嘧啶摻入率進(jìn)行評(píng)估。
2.2.離體測試系統(tǒng)發(fā)明人用表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶的離體胚胎骨器官培養(yǎng)檢驗(yàn)不同的候選抑制劑對(duì)軟骨及骨形成中亞精胺合酶的抑制作用。實(shí)驗(yàn)材料為小鼠胚胎(E16)后腿。用加入10％胎牛血清(FCS)、0.05mg/ml維生素C及1mM磷酸甘油的改良Eagle′s培養(yǎng)基培養(yǎng)骨。在300l完全培養(yǎng)基內(nèi)用24孔組織培養(yǎng)板上以每孔一骨的密度，將培養(yǎng)板置于5％CO2孵箱中，在37℃及98％濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將濃度漸增的不同亞精胺合酶抑制劑如AdoDATO抑制劑(5-50M)加入培養(yǎng)基，骨培養(yǎng)共持續(xù)7天。在0時(shí)間點(diǎn)和培養(yǎng)7天后，對(duì)經(jīng)候選抑制劑處理的骨及對(duì)照骨進(jìn)行評(píng)估。
用茜素紅(使鈣化組織著色)和阿爾新藍(lán)(使軟骨蛋白多糖著色)將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組骨切片染色，以評(píng)估軟骨細(xì)胞終末分化。同時(shí)也測量了骨的徑向生長以計(jì)算過度增殖區(qū)及鈣化骨長度的增加。還通過X型膠原染色進(jìn)一步評(píng)估過度增殖的程度。軟骨細(xì)胞增殖的程度由PCNA法檢測。
2.3.體內(nèi)測試系統(tǒng)發(fā)明人用兩個(gè)體內(nèi)測試系統(tǒng)評(píng)估不同亞精胺合酶抑制劑對(duì)不同OA相關(guān)參數(shù)如軟骨細(xì)胞增殖、終末分化及關(guān)節(jié)炎的發(fā)生等的作用其一過度表達(dá)外源性亞精胺合酶，另一個(gè)表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶。兩者都作為本發(fā)明的OA模型。
2.3.1.表達(dá)外源性亞精胺合酶的轉(zhuǎn)基因小鼠在本系統(tǒng)中，用提示軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成、破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)及關(guān)節(jié)炎發(fā)生的不同終點(diǎn)指示檢驗(yàn)亞精胺合酶過度表達(dá)的作用。
在II型膠原增強(qiáng)子作用下表達(dá)人亞精胺合酶cDNA的轉(zhuǎn)基因FVBN小鼠模型已經(jīng)建立成功。在轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎(E17)或一周齡小鼠切片中檢測軟骨的形成。用阿爾新藍(lán)和茜素紅染色切片評(píng)估終末分化的程度。用PCNA法評(píng)估增殖的程度。
通過測量成年亞精胺合酶轉(zhuǎn)基因小鼠腳爪的厚度來檢測關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。為促進(jìn)這些轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)生亞精胺合成，小鼠都經(jīng)脫梭SAM(亞精胺合酶底物之一)處理。脫梭SAM是溶解于飲用水中，經(jīng)口施用給小鼠的。
2.3.2.表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶的關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎大鼠作為表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶的評(píng)估系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)中使用。根據(jù)Trentham的方法在雌性Lewis鼠中誘導(dǎo)膠原性關(guān)節(jié)炎(對(duì)II型膠原的自身免疫一個(gè)關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚑rentham D.E，TownesA.S，Kang A.H(1977)，J.Exp.Med.146857-868)。將1.6mg/ml小牛II型膠原及0.4mg/ml佐劑肽溶液加入等體積弗氏不完全佐劑(DIFCO，MI)，用勻漿器在4℃下以10,000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌15分鐘制成乳劑。在實(shí)驗(yàn)的第0天，每個(gè)動(dòng)物都皮內(nèi)給予1ml乳劑，內(nèi)含0.8mg膠原。
用提示軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成、破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)及關(guān)節(jié)炎發(fā)生的不同終點(diǎn)指示參數(shù)檢驗(yàn)不同候選抑制劑對(duì)亞精胺合酶的抑制作用。
將不同亞精胺合酶抑制劑施用于關(guān)節(jié)炎大鼠(II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA))。將抑制劑溶解于水中，可經(jīng)口使用給大鼠或直接進(jìn)行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射施用。通過測量腳爪厚度監(jiān)測關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。此外，還用組織學(xué)方法檢測實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組動(dòng)物的切片。
用阿爾新藍(lán)及茜素紅染色切片評(píng)估終末分化的程度。用PCNA法評(píng)估增殖的程度。
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權(quán)利要求
1.一種治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象的方法，其包含給所述的對(duì)象施用足以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞精胺生物合成的實(shí)質(zhì)性抑制的量的亞精胺生物合成抑制劑以由此達(dá)到治療所述對(duì)象的目的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的亞精胺合酶抑制劑選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺(4MCHA)、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(MGBP)、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其任何功能同族物和類似物組成的組。
4.亞精胺生物合成抑制劑在治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象中的用途，其中所述的抑制劑的量足以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞精胺生物合成的實(shí)質(zhì)性抑制而由此達(dá)到治療所述對(duì)象的目的。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述的亞精胺生物合成抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述的抑制劑選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(MGBP)、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其任何功能同族物和類似物組成的組。
7.亞精胺生物合成抑制劑在制備用于治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象的藥物組合物中的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述的亞精胺生物合成抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述的抑制劑選自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)(MGBP)、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物組成的組。
10.一種用于治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象的治療組合物，其包含一種亞精胺生物合成抑制劑以及一種載體，所述的抑制劑的量足以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞精胺生物合成的實(shí)質(zhì)性抑制。
11.權(quán)利要求10的治療組合物，其中所述的亞精胺生物合成抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
12.權(quán)利要求10或11的治療組合物，其中所述的載體為藥用或獸用可接受的載體。
13.一種制備用于治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象的治療組合物的方法，所述方法包含的步驟為a.獲得足以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞精胺生物合成的實(shí)質(zhì)性抑制的量的亞精胺生物合成抑制劑，以及b.將所述的抑制劑與藥用可接受的載體混合。
14.一種鑒定亞精胺生物合成抑制劑的方法，其中所述的抑制劑為亞精胺合酶抑制劑而所述的鑒定通過以下步驟進(jìn)行a.獲得候選亞精胺合酶抑制劑；b.用一種評(píng)估方法通過與對(duì)照比較而評(píng)估所述候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成以及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程的作用。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的評(píng)估方法包含的步驟為i.提供包含編碼亞精胺合酶的DNA的測試系統(tǒng)；ii.將所述系統(tǒng)與所述候選亞精胺合酶抑制劑在正常情況下能導(dǎo)致亞精胺表達(dá)的條件下進(jìn)行接觸；以及iii.與對(duì)照比較而確定檢測候選抑制劑對(duì)終點(diǎn)指示的作用，其中所述作用意味著所述檢測候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程有抑制作用。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述測試系統(tǒng)為包含外源性表達(dá)的亞精胺合酶的體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物為以pCMVneo表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RCJ3.1C5.18細(xì)胞培養(yǎng)物，所述的載體包含編碼亞精胺合酶蛋白的核酸序列。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述的測試系統(tǒng)為包含內(nèi)源性表達(dá)亞精胺合酶的離體骨培養(yǎng)物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的骨培養(yǎng)物為胚胎骨培養(yǎng)物。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述的測試系統(tǒng)為包含動(dòng)物模型的體內(nèi)測試系統(tǒng)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的終點(diǎn)指示為關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是通過測量所述動(dòng)物的腳爪的厚度而確定的，其中與對(duì)照比較腳爪尺寸的增加較小意味著所述檢測候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程以及對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有抑制作用。
23.權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物模型為轉(zhuǎn)基因小鼠。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述的體內(nèi)測試系統(tǒng)為表達(dá)內(nèi)源性亞精胺合酶的關(guān)節(jié)炎哺乳動(dòng)物模型。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述終點(diǎn)指示為關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是通過測量所述動(dòng)物的腳爪的厚度而確定的，其中與對(duì)照比較腳爪尺寸的增加較小意味著所述檢測候選抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞終末分化、血管形成及破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)中任一過程以及對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有抑制作用。
27.權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎哺乳動(dòng)物為關(guān)節(jié)炎大鼠。
28.權(quán)利要求14的方法，其中通過自由腺苷亞精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基環(huán)己胺、環(huán)己胺、甲基乙二醛雙(環(huán)戊基脒腙)，(MGBP))、2-巰基丙胺、N-氯磺酰二環(huán)己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脫氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(異丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和類似物組成的組中選出一種抑制劑而獲得一種候選亞精胺合酶抑制劑。
29.權(quán)利要求14的方法，其中通過進(jìn)行一種物質(zhì)篩選方法而獲得一種候選亞精胺合酶抑制劑，所述物質(zhì)為亞精胺合酶抑制劑，所述的篩選方法包含的步驟為a.提供包含亞精胺合酶的混合物；b.將所述混合物與檢測物質(zhì)在正常情況下能導(dǎo)致亞精胺生物合成的條件下進(jìn)行接觸；以及c.確定所述檢測物質(zhì)對(duì)終點(diǎn)指示的作用，其中對(duì)所述終點(diǎn)指示的抑制意味著亞精胺合酶被所述檢測物質(zhì)抑制。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的終點(diǎn)指示為亞精胺合酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的出現(xiàn)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的亞精胺合酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的出現(xiàn)導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測的熒光信號(hào)或放射性信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象的方法，其包含給所述對(duì)象施用一定量的亞精胺生物合成抑制劑，所述的量足以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞精胺生物合成的實(shí)質(zhì)性抑制。本發(fā)明還提供了亞精胺生物合成抑制劑在治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象中的用途，其中所述的抑制劑的量足以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞精胺生物合成的實(shí)質(zhì)性抑制。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了制備用于治療有骨性關(guān)節(jié)炎的治療需求的對(duì)象的治療組合物的方法，并進(jìn)一步提供了鑒定亞精胺生物合成抑制劑的方法，其中所述的抑制劑為亞精胺合酶抑制劑。
文檔編號(hào)A61K31/13GK1525818SQ01822613
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月12日
發(fā)明者德加尼特·巴, 埃琳娜·范斯坦, 奧里特·塞格夫, 塞格夫, 范斯坦, 德加尼特 巴 申請(qǐng)人:希奧諾吉有限公司