無(wú)菌狀態(tài)下取100yL感受態(tài)細(xì)胞，加入l-2yL連接產(chǎn)物，吹吸混勻。
[0061 ]⑵將混勻的感受態(tài)細(xì)胞移入預(yù)冷過的電轉(zhuǎn)杯中，避免產(chǎn)生氣泡。
[0062]⑶將電轉(zhuǎn)杯放入Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀，調(diào)到合適預(yù)設(shè)程序檔位，電轉(zhuǎn)。電壓條件為 1·8kv〇
[0063] ⑷加入lmL S0C復(fù)蘇培養(yǎng)基于電轉(zhuǎn)后的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管 中，37°C，150rpm 孵育 lh。
[0064] (5)取200yL涂布含有100yg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板。倒置37 °C培養(yǎng)過夜。 [0065]挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明連接成功，獲得二元表達(dá)載體 pBIG2-ura5s-〇PpFADS17〇
[0066]其中，S0C復(fù)蘇培養(yǎng)基的組成為：20g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g//L氯化鈉，2.5mM 氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖;LB固體培養(yǎng)基的組成是：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/ L氯化鈉，20g/L瓊脂。
[0067] 二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-〇PpFADS17電擊轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌的方法參照轉(zhuǎn)化大 腸桿菌T0P10的方法。得到含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的根瘤土壤桿菌C58C1。
[0068]實(shí)施例3:根瘤土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高山被孢霉
[0069] 在已有的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法報(bào)道的基礎(chǔ)上，做了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化調(diào) 整，具體如下：
[0070] ⑴取保存于-80°c的含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的根瘤農(nóng)桿菌C58C1于含有 100yg/mL利福平和100yg/mL卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基平板劃線。28°C倒置避光培養(yǎng)48h。
[0071] ⑵挑取單克隆接種至20mL含有100yg/mL利福平和100yg/mL卡那霉素的液體YEP培 養(yǎng)基中28°C，200rpm避光培養(yǎng)24-48h。
[0072] (3)4000 Xg離心5min收集菌體，倒掉上清。加5mL IM培養(yǎng)基重懸菌體，4000 Xg離心 5min，倒掉上清。加2mL頂培養(yǎng)基重懸菌體。
[0073] ⑷用頂培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至0D6Q()為0.3。置于28°C，200rpm搖床避光培養(yǎng)至OD6〇〇到 1.0〇
[0074] (5)用500yL滅菌的生理鹽水沖刷在GY-U斜面培養(yǎng)1個(gè)月以上的高山被孢霉尿嘧啶 營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株CCFM501(即CN 201310347934.8公開的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株1^1]1)，收集 孢子，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度到1〇7個(gè)每l〇〇yL。
[0075] (6)取100yL根瘤土壤桿菌與100yL孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙的頂固體培養(yǎng) 基上。23 °C避光培養(yǎng)36-48h。
[0076]⑵將玻璃紙轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)OOwg/mL壯觀霉素和100yg/mL頭孢噻肟抗生素的SC平板 (SC-CS)上。18°C避光培養(yǎng)12h，隨后轉(zhuǎn)移至25°C培養(yǎng)。
[0077] (8)持續(xù)觀察菌落在SC-CS平板上的生長(zhǎng)情況，若長(zhǎng)出明顯菌落，及時(shí)用尖頭鑷子將 菌落外沿挖出，接種于SC-CS平板上，繼續(xù)正置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0078] (9)待SC-CS平板上的轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，挑菌絲轉(zhuǎn)接于SC-CS平板，重復(fù)篩選3次，排除 陰性轉(zhuǎn)化子。
[0079] (10)將篩選3次后生長(zhǎng)的菌落接種至GY平板，28°C培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子，保藏在4°C。
[0080] 其中，MM培養(yǎng)基成分是：1 · 74g/L磷酸氫二鉀，1 · 37g/L磷酸二氫鉀，0 · 146g//L氯化 鈉，0.49g/L七水硫酸鎂，0.078g/L氯化鈣，0.0025g/L七水硫酸亞鐵，0.53g/L硫酸銨，1.8g/ L葡萄糖，0.5%甘油。
[0081 ] IM培養(yǎng)基是在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了200μΜ的乙酰丁香酮(AS)構(gòu)成的。
[0082] SC培養(yǎng)基的組分是:5g/L酵母氮源(無(wú)氨基酸與硫酸銨），1.7g/L硫酸銨，20g/L葡 萄糖，20mg/L腺噪呤，30mg/L絡(luò)氨酸，lmg/L甲硫氨酸，2mg/L組氨酸，4mg/L賴氨酸，4mg/L色 氨酸，5mg/L蘇氨酸，6mg/L異亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸為組分構(gòu) 成的。
[0083] GY固體培養(yǎng)基是以組分20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸鉀，lg/L磷酸二 氫鈉，3g/L七水硫酸鎂，20g/L瓊脂構(gòu)成的。
[0084] YEP培養(yǎng)基的組分是：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化鈉，余量為水。 涉及到固體培養(yǎng)基時(shí)添加20g/L瓊脂。
[0085] 實(shí)施例4:高山被孢霉過表達(dá)oPpFADS17工程菌株篩選和鑒定
[0086] 1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個(gè)無(wú)菌1.5mL離心管中。過25μπι濾膜；
[0087] 2)用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度108個(gè)每100yL、10 6個(gè)每100yL、104 個(gè)每100yL，分別取200yL涂布于含有100yg/mL壯觀霉素和100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板 上，25°C避光培養(yǎng)2-3d;
[0088] 3)隨時(shí)用無(wú)菌鑷子挑出生長(zhǎng)的真菌菌絲SC-CS平板上，25°C培養(yǎng)2-3d;
[0089] 4)觀察高山被孢霉在平板上的生長(zhǎng)情況，挑出在SC-CS平板上生長(zhǎng)的菌絲接種于 GY斜面上；
[0090] 5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；
[0091] 6)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為異源表達(dá)〇PpFADS17基因的重組高山被孢霉菌株，保 藏于GY斜面上；
[0092] 7)提取鑒定正確的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，用一對(duì)與啟動(dòng)子和終止子 特異性結(jié)合的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證：
[0093] PI (sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0094] P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0095] 重組菌株鑒定的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖2，M為marker;泳道1為陰性對(duì)照； 泳道2-6為1-5號(hào)MA-〇PpFADS17重組菌株。結(jié)果可見，5株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子均可擴(kuò)增出兩條大小分 別為818bp和1086bp的產(chǎn)物條帶，電泳結(jié)果說明1-5號(hào)轉(zhuǎn)化子均為二元表達(dá)載體成功整合到 高山被孢霉基因組中的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
[0096] 8)所得重組菌株分別保藏于GY斜面上。
[0097] 實(shí)施例5:陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子MA-〇PpFADS17總RNA提取
[0098] 1.取出適量在液氮中凍存的菌體，于預(yù)冷的無(wú)菌無(wú)酶研缽中加入液氮充分研磨。
[0099] 2.加入lmL TRIzol(購(gòu)自 Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA)繼續(xù)研磨至粉末，室 溫放置至溶解。
[0100] 3.用無(wú)酶槍頭吸取lmL上述步驟中液體于無(wú)酶離心管中，加入200yL三氯甲烷混 勻。
[0101 ] 4.13200 Xg，4°C，離心15min吸上清于新的無(wú)酶離心管中。
[0102] 5.加入200yL三氯甲烷混勻，13200Xg，4°C，離心15min吸上清于新的無(wú)酶離心管 中。
[0103] 6.加入等體積的異丙醇，靜置15min，13200 X g，4°C，離心15min。棄上清，室溫晾 干。
[0104] 7 ·加入lmL的70vol %乙醇，13200 X g，4°C，離心15min。用無(wú)酶槍頭吸去乙醇，室溫 放置干燥。
[0105] 8 ·加入50yL無(wú)酶水溶解RNA，-80 °C儲(chǔ)存。
[0106] 9.濃度測(cè)定：取lyL RNA用Nanodrop 2000測(cè)定濃度。
[0107] 10.變性膠電泳檢測(cè)RNA完整性:取lyg RNA在1.2vol %的變性膠中電泳，觀察RNA 完整性。
[0108] 11 ·取lyg總RNA為模板，根據(jù)PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa，Otsu，Shiga， Japan)試劑盒說明進(jìn)行操作，獲得重組菌株的cDNA。
[0109] 實(shí)施例6:陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子MA-〇PpFADS17轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR檢測(cè) [0110] 根據(jù)oPpFADS17序列和內(nèi)參18SrRNA序列設(shè)計(jì)引物：
[0111] q-〇PpFADS17F：TCTTCCCCACCCTCACCG
[0112] q-〇PpFADS17R：CAAGCCACGAGCGTAGTTCA
[0113] 18SRTF：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAG
[0114] 18SRTR：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT
[0115] 取0.5_lyg cDNA為模板，使用Bio-Rad CFX ConnectTM system按照iTaq Universal SYBR Green Supermix的說明進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：8yL無(wú)酶水，10yL iTaq Universal SYBR Green Supermix,0.5yL q-〇PpFADS17F,0.5yL q-〇PpFADS17R,lyL 模板，總體積20μΙ^ΡΟ?循環(huán)設(shè)置為50°C 2min，95°C 10min，95°C 15s，60°C 30s，30個(gè)循環(huán)。 以高山被孢霉的18S rRNA作為內(nèi)參基因，各轉(zhuǎn)化子取三個(gè)平行。結(jié)果如圖3所示，高山被孢 霉野生型對(duì)照ω -3脫飽和基因（oPpFADS17)無(wú)轉(zhuǎn)錄，而5株基因工程菌ω -3脫飽和基因 (〇PpFADS17)的轉(zhuǎn)錄量有顯著提高，-Δ ACt值達(dá)到8左右。這說明使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法能 夠使外源ω -3脫飽和酶基因（oPpFADSl7)在高山被孢霉中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
[0116]實(shí)施例7:陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子脂肪酸提取
[0117] ⑴將高山被孢霉原養(yǎng)型菌株與實(shí)施例3篩選獲得的高山被孢霉過表達(dá)〇PpFADS17 工程菌株接種于Broth培養(yǎng)基中，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)7d。
[0118] ⑵收集菌體，真空冷凍干燥