一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶的重組高山被孢霉、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
【專利說明】一株過表達來源于寄生疫霉的ω -3脫飽和酶的重組高山被孢 霉、其構(gòu)建方法及應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶 〇PpFADS17基因的高山被孢霉，還涉及其構(gòu)建方法及用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 高山被孢霉(Mortierella alpina)是一種脂質(zhì)積累可以達到細胞干重50%的產(chǎn) 油真菌，是脂質(zhì)生物化學基礎(chǔ)研究的重要模式生物。高山被孢霉已經(jīng)被應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn) 花生四稀酸(Arachidonic acid，AA，C20:4)，其生產(chǎn)的食用油脂已經(jīng)通過美國食品藥品監(jiān) 督管理局(FDA)的安全性評估。除了合成AA之外，高山被孢霉也具有一定的合成二十碳五烯 酸(Eicosapentanoic acid，EPA，C20 : 5)的能力。EPA屬于ω -3長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs)，具有重要的生理功能，如：促進哺乳動物大腦發(fā)育以及神經(jīng)組織形成和修復的能 力，預(yù)防哮喘、癌癥、抑郁、肥胖、免疫紊亂以及心血管疾病等。但是人體自身不能合成這些 脂肪酸，需要從富含ω-3LC-PUFAS的食物(如深海魚油）中攝取。由于大肆捕撈和環(huán)境污染 破壞，深海魚類提供的《-3LC-PUFAs已無法滿足日益增長的市場需求，所以利用微生物生 產(chǎn)co-3LCPUFAs已經(jīng)成為當前的研究熱點。
[0003] 由AA合成EPA的反應(yīng)是通過ω -3脫飽和酶催化完成的。不同物種來源的ω -3脫飽 和酶對催化的底物具有明顯的偏好性，其中偏好催化20碳PUFAs的ω -3脫飽和酶可以較高 效的催化ΑΑ生成ΕΡΑ，對于ΕΡΑ的生產(chǎn)有十分重要的作用。2004年，Pereira等人發(fā)現(xiàn)來源于 異枝水霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶sddl7,對18碳的多不飽和脂肪酸沒有催化活性，卻能將20 碳的AA催化為EPA，轉(zhuǎn)化率為25.9%。同樣的，來源于致病疫霉的ω-3脫飽和酶0ΡΙΝ 17也不 能以18碳的多不飽和脂肪酸為底物，但是對ΑΑ的轉(zhuǎn)化率達到了 30.94%。
[0004] 近年來，Xue等人從瓜果腐霉、大豆疫霉菌、櫟樹猝死病菌中分離出三種ω -3脫飽 和酶一PaD 17、PsD 17、PrD 17,這三種酶對18碳和20碳的ω-6多不飽和脂肪酸都具有催化 能力，但偏好催化20碳的ΑΑ，轉(zhuǎn)化率分別達到了 56 %、47 %和36 %。上述幾種ω -3脫飽和酶 可以直接、高效的催化ΑΑ生成ΕΡΑ，且催化反應(yīng)均可在常溫下進行，因此對ΕΡΑ的工業(yè)化生產(chǎn) 具有十分重要的作用。其中PaD 17是目前已知的對ΑΑ轉(zhuǎn)化率最高的ω -3脫飽和酶。
[0005] 申請人在前期研究中將優(yōu)化后的PaD 17轉(zhuǎn)化入高山被孢霉，得到的高山被孢霉重 組菌可以在28°C下生產(chǎn)EPA，且EPA含量達到總脂肪酸含量的18.7%，具有高于當時其他現(xiàn) 有技術(shù)的產(chǎn)率。
[0006] 然而，獲得具有更優(yōu)秀的EPA產(chǎn)率的產(chǎn)油真菌特別是高山被孢霉依然是本領(lǐng)域技 術(shù)人員的期望。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一株能在常溫環(huán)境下高產(chǎn)EPA的重組 高山被孢霉工程菌株，借助根瘤土壤桿菌介導的方法、通過過表達其他來源的ω-3脫飽和 酶〇PpFADS17基因得到一株重組高山被孢霉，還涉及將所述重組高山被孢霉工程菌株用于 工業(yè)生產(chǎn)脂肪酸、特別是生產(chǎn)EPA。
[0008] 本申請人在中國發(fā)明專利申請CN 2015109025795中公開了三種常溫偏好20C的 ω-3脫飽和酶，其中涉及來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶，并公開了依據(jù)釀酒酵母特性將 其優(yōu)化得到〇PpFADS17序列，通過化學法轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSc 1中并成功表達，驗證了所得 工程菌株對ARA具有良好的轉(zhuǎn)化效率。
[0009]經(jīng)過上述前期研究，申請人期望驗證在比高山被孢霉中過表達來源于寄生疫霉的 ω -3脫飽和酶能夠提高高山被孢霉的EPA產(chǎn)量，并期望從中獲得一株產(chǎn)量突出的工程菌株。
[0010]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，對來自寄生疫霉的ω -3脫飽和 酶進行優(yōu)化，得到經(jīng)過優(yōu)化的〇PpFADS17,其與天然的來源于瓜果腐霉的PaD 17具有相似的 催化特性，且對20C底物的偏好性更強。所以，將〇PpFADS17轉(zhuǎn)化入高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺 陷型菌株，構(gòu)建常溫下EPA產(chǎn)量更高的高山被孢霉。
[0011]具體地，本發(fā)明提供一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因 的重組高山被孢霉(1〇1*1:丨6代113 3]^;[仙)1^-0?口?六0317-4，該菌株于2016年1月18日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11820。
[0012] 在本發(fā)明中，所述ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因是經(jīng)過優(yōu)化的來源于寄生疫霉的 ω-3脫飽和酶基因，其核酸序列如SEQ N0.1(Genbank accession N〇:KT372001)所示，其氨 基酸序列如SEQ NO.2所示。
[0013] 在本發(fā)明中，所述高山被孢霉菌株是用含有ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因的重組 質(zhì)粒pBIG2_ura5s-〇PpFADS17轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌后，再以含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2_ura5s_ oPpFADS 17的根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。
[0014] 根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，所述高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是一株使高山 被孢霉ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶OPRTase的ura5基因失活的高山被 孢霉菌株。更優(yōu)選地，所述高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是中國發(fā)明專利申請CN 201310347934.8中公開的高山被孢霉MAU1，該菌株于2013年11月01日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.8414。該菌株也保存于江南大學 的實驗室，被命名為CCFM501。
[0015] 為了獲得上述重組高山被孢霉，本發(fā)明還提供所述菌株的構(gòu)建方法，包括以下步 驟：
[0016] a)根據(jù)天然的來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶序列(Genbank accession No :XM_ 008906963)，根據(jù)高山被孢霉密碼子使用偏好性，人工合成優(yōu)化后的ω-3脫飽和酶基因 oPpFADS17,如SEQ NO. l(Genbank accession Ν〇:ΚΤ372001)所示；
[0017] b)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBIG2-ura5s-〇PpFADS17;
[0018] c)用構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌；
[0019] d)用含重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶 營養(yǎng)缺陷型菌株；
[0020] e)篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株，獲得一株特別高產(chǎn)EPA的過表達ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基 因的重組高山被孢霉菌株MA-〇PpFADSl 7-4。
[0021 ] 其中，步驟c)的根瘤土壤桿菌為根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) C58Cl〇
[0022] 步驟d)的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是重組高山被孢霉MAU1 (CGMCC No. 8414)，或按照江南大學的實驗室的命名稱為CCFM501。
[0023] 其中，步驟e)中篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株的方法包括以下步驟：
[0024] 1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個無菌1.5mL離心管中。
[0025]過 25μπι 濾膜；
[0026] 2)用血球計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度108個每100yL、10 6個每100yL、104 個每100yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上， 25°C避光培養(yǎng)2-3d;
[0027] 3)隨時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲于含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素，lOOyg/mL頭孢 噻肟的SC-CS平板上，25°C培養(yǎng)2-3d;
[0028] 4)觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于 GY斜面上；
[0029] 5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；
[0030] 6)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過表達ω -3脫飽和酶oPpFADS 17基因的重組高山被孢 霉菌株，保藏于GY斜面上；
[0031] 7)提取含有ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，設(shè) 計一對與啟動子和終止子特異性結(jié)合的引物進行PCR驗證：
[0032] PI (sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0033] P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0034] 8)所述重組菌株保藏于GY斜面上。
[0035] 本發(fā)明還提供上述重組高山被孢霉菌株或根據(jù)上述方法得到的重組高山被孢霉 在生產(chǎn)脂肪酸、特別是EPA中的用途。
[0036] 在本發(fā)明中，重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的構(gòu)建可參考中國專利申請 CN201310524221.4中公開的內(nèi)容。根據(jù)該申請的記載，首先用PCR的方法從pD4質(zhì)粒上獲得 HPH表達單元，將HPH表達單元用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切，插入到EcoR I和Xba I 酶切過的pET28a( + )的多克隆位點(MCS)中，得到質(zhì)粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉 cDNA中獲得ura5(乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶;OPRTase)基因，并利用限制性內(nèi)切酶BspH I和 BamH I酶切ura5基因，將酶切過的ura5基因插入到Nco I和BamH I酶切過的質(zhì)粒pET28a_ HPHs中，以替換hpt基因，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ura5s。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切質(zhì)粒 pET28a_ura5s得到ura5s表達單元。將ura5s表達單元替換質(zhì)粒