一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于工程菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是能將纖維素降解為葡萄糖單體的一組酶系的總稱，通常包括內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纖維素酶資源對(duì)于可持續(xù)利用生物質(zhì)資源具有重要意義，可廣泛應(yīng)用于生物能源、飼料、洗滌、造紙及植物源活性物質(zhì)制備等領(lǐng)域。瑞氏木霉(Trichoderma reesei)能夠產(chǎn)生完整的纖維素酶系，是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。當(dāng)前，傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)難以繼續(xù)提升瑞氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力。借助基因工程手段改良瑞氏木霉的纖維素酶產(chǎn)生能力，成為降低纖維素酶生產(chǎn)成本的有效途徑。
[0003]絲狀真菌的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)能夠控制許多重要基因的表達(dá)調(diào)控。硫氧還蛋白系統(tǒng)(th1redoxin system)是存在于絕大多數(shù)生物體中的一類抗氧化系統(tǒng)，具有調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡等多種重要功能。硫氧還蛋白從氧化態(tài)轉(zhuǎn)化成還原態(tài)依賴于硫氧還蛋白還原酶(th1redoxin reductase，TrxR)的催化作用。因而，TrxR對(duì)于胞內(nèi)的氧化還原平衡或某些蛋白分子的氧化還原狀態(tài)具有重要的調(diào)控作用。瑞氏木霉細(xì)胞中具有高水平的TrxR會(huì)極大的改變其細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而增強(qiáng)相關(guān)蛋白(如纖維素酶)分子的基因表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl，能高產(chǎn)纖維素酶。本發(fā)明的另一目的是提供上述瑞氏木霉工程菌CstrxRl的構(gòu)建方法。
[0005]技術(shù)方案，為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl，分類名稱為瑞氏木霉Trichoderma reesei CstrxRl，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為:2016年3月I日，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2016078，保藏地址為:中國湖北武漢武漢大學(xué)。
[0006]在所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl中克隆有來自于蟲擬錯(cuò)菌的硫氧還蛋白還原酶基因序列，該基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]構(gòu)建所述瑞氏木霉工程菌CstrxRl的方法:將序列如SEQ ID N0.1所示的DNA片段通過質(zhì)粒pAgl-CstrxRl導(dǎo)入瑞氏木霉基因組，所述質(zhì)?？诹?1-081:^1?1是在質(zhì)粒。481-!13的KpnI和ApaI位點(diǎn)順序裝入瑞氏木霉纖維二糖水解酶I啟動(dòng)子序列Pcbhl、序列如SEQ IDN0.1所示的DNA片段和瑞氏木霉纖維二糖水解酶I終止序列Tcbhl。
[0008]所述瑞氏木霉為瑞氏木霉D-86271。
[0009]所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl在產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
[0010]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明成功構(gòu)建出瑞氏木霉工程菌CstrxRl，通過實(shí)驗(yàn)證明高表達(dá)蟲擬蠟菌中硫氧還蛋白還原酶編碼基因的瑞氏木霉工程菌，其纖維素酶產(chǎn)量(濾紙酶活)與親本瑞氏木霉相比提高0.78倍。本發(fā)明對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中提高纖維素酶生產(chǎn)效率具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0011]圖1是表達(dá)質(zhì)粒pAgl-CstrxRl的圖；
圖2是基因CstrxRl大腸桿菌重組表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測圖；
圖3是CstrxRl基因瑞氏木霉轉(zhuǎn)化株的鑒定圖；
圖4是固態(tài)發(fā)酵條件下瑞氏木霉基因工程菌株纖維素酶產(chǎn)量的比較圖;D-86271為未轉(zhuǎn)化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌，CK為含空載體的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化菌株；
圖5是固態(tài)發(fā)酵條件下瑞氏木霉基因工程菌株胞外蛋白的比較結(jié)果圖;D-86271為未轉(zhuǎn)化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌，CK為含空載體的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化菌株；
圖6是固態(tài)發(fā)酵條件下瑞氏木霉基因工程菌株生物量的比較結(jié)果圖;D-86271為未轉(zhuǎn)化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌；
圖7是瑞氏木霉基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中纖維素酶合成基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果圖；其中，D-86271為未轉(zhuǎn)化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0013]實(shí)施例1基因表達(dá)載體pAgl-CstrxRl的構(gòu)建
1、蟲擬錯(cuò)菌硫氧還蛋白還原酶編碼基因CstrxRl的獲得及E.coli表達(dá)分析蟲擬錯(cuò)菌(Ceripor1sis subvermispora B)的全基因組序列(GenBank號(hào):AE0V00000000.1)，獲得一個(gè)候選的硫氧還蛋白還原酶蛋白編碼基因CstrxRl。采用TrizoI試劑分離蟲擬錯(cuò)菌(Ceripor1psis subvermispora)FP-105752-Sp (由Forest ProductsLaboratoryCCentre for Forest Mycology Research) , Madison, WI, USA提供)的總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen，北京)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成(oligo(dT)引物)，并作為模板以引物CstrxR_fl (含NdeI識(shí)別序列和保護(hù)堿基)和CstrxR_rl(含HindIII識(shí)別序列和保護(hù)堿基)擴(kuò)增獲得CsTrxRl的cDNA片段。將獲得的cDNA片段克隆到載體pEASY-Blunt(TransGen，北京)，并由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行測序分析(Invitrogen,上海)，經(jīng)測序驗(yàn)證正確，其序列如SEQ ID N0.1所示，推測得出對(duì)應(yīng)的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示。各引物的序列如下:
CstrxR_fI:57-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-37 ；
CstrxR_rl:57-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-37。
[0014]對(duì)CstrxRl基因的cDNA片段進(jìn)行Ndel/HindllI雙酶切，并連接入大腸桿菌(E.coli)表達(dá)載體pET23b(Novagen，Germany)的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pET-CstrxRl。根據(jù)產(chǎn)品操作說明，將pET-CstrxRl轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株(E.coli )Rosseta菌株(TransGen，北京)，并以異丙基-1-硫代β-D吡喃型半乳糖(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。借助表達(dá)的CstrxRl重組蛋白具有C端融合的組氨酸標(biāo)簽，對(duì)其進(jìn)行His.Bind柱(Novagen，Germany)純化，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(如圖1所示)。圖1顯示，獲得的重組Cs trxRI分子大小與理論分子量(38.4kD，包括His標(biāo)簽)相符。
[0015]2、構(gòu)建瑞氏木霉基因表達(dá)質(zhì)粒pAgl-CstoxRl
以瑞氏木霉(Trichoderma reesei )D-86271 (=Rut_C30)(購買于 VTT culturecenter ,Finland)基因組DNA為模板，在高保真酶(Fastpfu)作用下，以引物Tcbhl—f (含XhoI識(shí)別序列和保護(hù)堿基VTcbhl—K含ApaI識(shí)別序列和保護(hù)堿基)擴(kuò)增獲得長1088 bp的纖維二糖水解酶 I 終止序列(Tcbhl)，并將其插入 pAgl-H3(Zhang，A.，Lu，P.，Dahl-Roshak,A.M., Paress, P.S., Kennedy , S., Tkacz, J.S., An，Z., 2003.Efficientdisrupt1n of a polyketide synthase gene (pksI) required for melaninsynthesis through Agrobacterium-mediated transformat1n of Glarea lozoyensis.Mol Gen Genomics 268，645-655.)的Xhol/Apal位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒 pAgl-Tcbhl。同時(shí)，以瑞氏木霉(Trichoderma reesei) D-86271基因組DNA為模板，以引物Pcbhl—f/Pcbhl—r擴(kuò)增獲得891 bp纖維二糖水解酶I啟動(dòng)子序列(Pcbhlh以質(zhì)粒pET-CstrxRl為模板，以引物CstrxR_f2/CstrxR_r2 擴(kuò)增獲得 CstrxRl 基因序列。通過Hieff CloneTM One Step Pcr克隆試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，上海)將以上獲得的Pcbhl和CstrxRl基因序列同源重組方式克隆到質(zhì)粒pAg-Tcbhl(經(jīng)過KpnI/XhoI雙酶切)，產(chǎn)生質(zhì)粒pAgl_CstrxRl?；虮磉_(dá)質(zhì)粒pAgl- CstrxRl的物理圖譜如圖2所示。各引物序列如下:
CstrxR—f2:57-catgtctagaatggcacccctcacgaatg-37 ；
CstrxR_r2:57-ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc-37 ；
Pcbhl—f:57-agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca-37 ；
Pcbhl—r:57-tgaggggtgccattctagacatgatgccagtccgcggttg-37 ；
Tcbhl—f:57-gactcgagagctccgtgcgaaagcctgacgca-37 ；
Tcbhl—r:57-ctgggcccatcgtaaccgagaatccagagctg-37 0
[0016]實(shí)施例2構(gòu)建表達(dá)CstoxRl基因的瑞氏木霉基因工程菌株
1、基因表達(dá)質(zhì)粒pAgl-CstrxRl轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
取I Ug質(zhì)粒pAgl-CstrxRl的DNA加入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL_l(Mullins , E.D., Chen, X., Romaine, P., Raina, R., Geiserj D.M., Kang, S.,2001.Agrobacterium-mediated transformat1n of Fusarium oxysporum: anefficient tool for insert1nal mutagenesis and gene transfer.Phytopathology.91: 173-180.)的感受態(tài)細(xì)胞中混勻，放入液氮中5分鐘。取出，立即在42 °C熱激2分鐘后加入700 uL LB液體培養(yǎng)基，28 °(:振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。將菌液均勻涂布在含有75 ug/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，28 °(:倒置培養(yǎng)2天，得到含有重組質(zhì)粒pAgl-CstrxRl的根癌農(nóng)桿菌單菌落。
[0017]2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及菌株的初步抗性篩選
將獲得的含有重組質(zhì)粒PAgl-CstrxRl的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于5 mL MM液體培養(yǎng)基中，28 °(:振蕩培養(yǎng)2天。用IM培養(yǎng)基將菌體稀釋到0D6Q()=0.15，28 °(:振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，至OD600=0.6。取100 UL菌液與等體積的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)D_86271孢子懸液混合(懸液濃度=2 X 16個(gè)孢子/mL)，均勻涂布在CM瓊脂平板(鋪有玻璃紙)上，24 °C正置共培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)菌體轉(zhuǎn)接至含有75 yg/mL潮霉素B和400 yg/mL噻孢霉素鈉的TOA瓊脂平板上，28 °(:倒置培養(yǎng)4-5天至含有潮霉素B抗性基因的轉(zhuǎn)化子長出。
[0018]3、PCR篩選表達(dá)Cs trxRl基因的瑞氏木霉基因工程菌株
將獲得的潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)化子接種于Mandels培養(yǎng)基(以1%乳糖作為碳源)，28 °C、180 rmp振蕩培養(yǎng)2天。根據(jù)前述方法提取其總DNA和RNA后，分別進(jìn)行如下PCR和RT-PCR反應(yīng):
PCR(圖3A):根據(jù)h