ph(潮霉素抗性基因)設(shè)計引物hph_f/hph_r，目的產(chǎn)物為0.9 kb；RT-PCR(圖3B):根據(jù)CstrxR的特異性引物CstrxR_fl/ CstrxR_rl，目的產(chǎn)物為1.032 kb;各引物序列如下:
CstrxR_fI:57-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-37 ；
CstrxR_rl:57-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-37 ；hph_f:57-aagttcgacagcgtctcc-37 ；hph_r:57-ttccactatcggcgagta-370
[0019]同時，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)D_86271、空載體pAgl-Tcbhl的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化菌株(CK)和無菌水(NC)為對照，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果如圖3所示。圖3A中，以質(zhì)粒pAgl-CstrxRl和空載體pAgl-Tcbhl轉(zhuǎn)化的瑞氏木霉的菌株均能獲得0.9 kb的條帶；未轉(zhuǎn)化菌株D-86271和無菌水(NC)均無擴增條帶。圖3B中，含質(zhì)粒pAgl-CstrxRl的瑞氏木霉基因工程菌可獲得1.032 kb的目標(biāo)條帶，而未轉(zhuǎn)化菌株D-86271、pAgl-Tcbhl轉(zhuǎn)化菌(CK)和無菌水(NC)均無擴增條帶。
[0020]從篩選的9株高表達CstrxRl基因的瑞氏木霉基因工程菌株中取一株編號為CstrxRl，2016年3月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，分類名稱為瑞氏木霉(Trichoderma reesei)CstrxRl，保藏編號為CCTCC N0:M2016078o
[0021]瑞氏木霉CstrxRl在正常培養(yǎng)條件下菌落呈廣鋪的棉絮狀，起初為白色致密的平坦菌絲，而后邊緣出現(xiàn)淺綠的產(chǎn)孢子叢束區(qū)，反面無色;分生孢子梗菌絲的短側(cè)枝，透明，多分枝;小梗瓶形，中部彎曲，形成大量的分生孢子，分生孢子橢圓形或長形，單細(xì)胞，透明，無色，壁光滑，成堆時綠色;該菌可正常利用葡萄糖、淀粉、甘油等碳源，及蛋白胨、尿素、硫酸銨等氮源。
[0022]實施例3瑞氏木霉基因工程菌株的發(fā)酵及纖維素酶的產(chǎn)量測定
取瑞氏木霉基因工程菌株CstrxRl接種于PDA斜面，28 °C培養(yǎng)7天，等待產(chǎn)生分生孢子。取I X 18個瑞氏木霉孢子接種于100 mL Mandels培養(yǎng)基(以1%葡萄糖作為碳源)，280C ,180 rpm培養(yǎng)2天。取I mL菌懸液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于30 °C、70%濕度條件下黑暗發(fā)酵培養(yǎng)15天。
[0023]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方:麥桿(粉碎至1-3mm，且脫木素)1.5 g，麩皮1.5 g，10 XMandels培養(yǎng)基(同上述，不含碳源)5 mL，以上組分裝入250_mL三角瓶中，充分混勻，高壓滅菌。麥桿的脫木素方法:按每10 g麥桿加入20 mL 4% NaOH溶液，混勻后，121 V,20 min處理，并以流水去除褐色物質(zhì)，處理后的麥桿晾干備用。
[0024]發(fā)酵結(jié)束后，按每三角瓶加入30 mL無菌水(含0.1% Tween-80)，攪拌均勻，并于28°C、120 rpm振蕩浸提2 h。繼續(xù)以7000 rpm離心20 min，將粗酶液轉(zhuǎn)入新的離心管中，于4°C冰箱保存。
[0025]濾紙酶活的測定，以Whatman N0.1濾紙(3 cmX0.5 cm)作為底物，50 V反應(yīng)60min;內(nèi)切型纖維素酶(EG)活的測定以1%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作為底物，50 V反應(yīng)30 min;最后均以3,5-二硝基水楊酸法DNS的方法(Miller，G.L., 1959.Use ofdinitrosalicylic acid reagent for determinat1n of reducing sugar.Anal Chem,31，426-428.)測定還原糖的生成量，通過標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線，換算獲得酶活(IU/g基質(zhì)干重)葡萄糖苷酶的活性測定，以5 mM的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作為底物，50 V反應(yīng)30 min，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酶活性(IU/g基質(zhì)干重)。以上酶活測定均在pH4.8的50 mM的檸檬酸緩沖液中進行，每處理3-4次重復(fù)。
[0026]濾紙酶或CMC酶單位酶活定義為:該實驗條件下，每分鐘催化相應(yīng)底物生成Inmol葡萄糖的酶量。β-葡萄糖苷酶單位酶活定義為:該實驗條件下，每分鐘催化pNPG生成I μπιο?4-硝基苯酚的酶量。
[0027]結(jié)果如圖4所示，表達CstrxRl基因的瑞氏木霉基因工程菌CstrxRl所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、CMC酶和濾紙酶活性均顯著高于未轉(zhuǎn)化的親本瑞氏木霉(D-86271)。發(fā)酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxRl的β-葡萄糖苷酶、CMC酶和濾紙酶的產(chǎn)量分別比親本菌株D-86271增加了0.84,0.48和0.78倍。同時，對照質(zhì)粒pAgl_Tcbhl轉(zhuǎn)化菌(CK)各種酶的產(chǎn)量與未轉(zhuǎn)化的瑞氏木霉親本菌株(D-86271)—致。
[0028]實施例4固態(tài)發(fā)酵瑞氏木霉胞外蛋白的分析
取實施例3中各菌株的發(fā)酵液，按一定比例稀釋后，以BCA檢測試劑盒(Thermo Tech,USA)測定菌株發(fā)酵所產(chǎn)胞外蛋白總量。結(jié)果如圖5所示，在發(fā)酵7到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxRl所產(chǎn)胞外蛋白量顯著高于未轉(zhuǎn)化的瑞氏木霉親本菌株D-86271。在發(fā)酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxRl所產(chǎn)胞外蛋白量比未轉(zhuǎn)化的瑞氏木霉親本菌株D-86271增加了1.4倍。
[0029 ]實施例5、固態(tài)發(fā)酵過程中瑞氏木霉菌體生物量的測算分析
通過測定發(fā)酵基質(zhì)中菌絲體的核酸含量，間接法換算出菌體的生物量。取2 g固態(tài)發(fā)酵物70 0C，烘干12小時，并于液氮中充分研磨至粉狀。取0.04 g研磨物放入1.5 mL無菌離心管中，并加入I mL 5%三氯乙酸后充分混合?；旌衔镉?0 0C水浴鍋處理30分鐘(每5分鐘混勻一次)，后置于冰上3分鐘。10,000 g離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。樣品稀釋100倍后，測定波長260 nm下的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌體生物量。
[0030]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:以MandeIs培養(yǎng)基(以1%葡萄糖作為碳源)培養(yǎng)獲得純的瑞氏木霉菌絲體，并烘干至恒重。分別取O、2.5、5、1、20、40 mg干菌絲按照以上方法測定其中的核酸含量，并以菌絲干重為縱坐標(biāo)和核酸含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031]結(jié)果如圖6顯示:發(fā)酵5到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxRl的生物量低于未轉(zhuǎn)化的瑞氏木霉親本菌株D-86271。因此，CstrxRl基因的表達并沒有增加瑞氏木霉的菌體生物量。
[0032]實施例6瑞氏木霉基因工程菌株中纖維素酶合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析
用Trizol試劑分別提取經(jīng)實施例3發(fā)酵培養(yǎng)5天、7天、9天和11天瑞氏木霉基因工程菌株CstrxRl和瑞氏木霉親本菌株D-86271的菌體樣品總RNA。取Iyg的RNA用TransScript ?RT/RI Enzyme Mix (引物oligo(dT)和 6-mers 隨機引物)(Transgene，北京)合成cDNA。以該cDNA為模板，用引物Qcel la_f/Qcella_r、QeglI_f/ Qegl I_i^PQcbhl_f/Qcbhl_r分別對β-葡萄糖苷酶合成基因cella(Genbank號:XM_006963374)、內(nèi)切型纖維素酶合成基因egll(Genbank號:XM_006965612)和纖維二糖水解酶合成基因cbhl (Genbank號:XM_006969162)進行實時定量PCR(ABI StepOne Plus, USA)。反應(yīng)程序:94 °C預(yù)變性30 s；94 °C變性5 s，58 °C退火15 s，72 °C延伸10 s(40個熱循環(huán))。設(shè)置不添加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的陰性對照。同時，以β-actin基因表達為內(nèi)參，PfaffI’s方法計算目標(biāo)基因的相對轉(zhuǎn)錄水平(即相對表達量)，結(jié)果如圖7所示。所用引物的序列如下:
Qcbhl—f:57-cttggcaacgagttctctt-37 ；
Qcbhl_r:57-tgttggtgggatacttgct-37 ；
Qcella—f:57-cgtgctcttcaccaacaa-37 ；
Qcella—r:57-tcttgctgatccacacca-37 ；
Qegll—f:57-cttctgctgcaacgagatgg-37 ；
QeglI_r:57-tcttggaggtgtcaacggtat-37 ；
Qactin—f:57-tccatcatgaagtgcgac-37 ；
Qactin_r:57-gtagaaggagcaagagcagtg-370
[0033]其中引物QcbhI—f、QcbhI—r、Qce11a—f、Qce 11a—r、Qactin—f及Qactin—r源自文獻Xuj J.T., Zhao, G.L., Kou，Y.B., Zhang, ff.X., Zhou, Q.X., Chen, G.J.,Liu, ff.F., 2014.1ntracellular beta-glucosidases CELla and CELlb areessential for cellulase induct1n on lactose in Trichoderma reese1.Eukaryotic Cell, 13(8): 100卜1013。
[0034]結(jié)果表明:纖維素酶合成基因ce 11a、egl I和cbhl在瑞氏木霉基因工程菌(CstoxRl)中的表達水平顯著高于未轉(zhuǎn)化的親本瑞氏木霉菌株D-86271，這進一步證明了瑞氏木霉基因工程菌CstrxRl的纖維素酶產(chǎn)生能力得到顯著的提高。
【主權(quán)項】
1.一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl，分類名稱為瑞氏木霉Trichoderma reesei CstrxRl，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為:2016年3月I日，保藏編號為CCTCC NO:M2016078，保藏地址為中國湖北武漢武漢大學(xué)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl，其特征在于，在所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl中克隆有來自于蟲擬蠟菌的硫氧還蛋白還原酶基因序列，該基因序列如SEQID N0.1所示。3.構(gòu)建權(quán)利要求2所述瑞氏木霉工程菌CstrxRl的方法，其特征在于:將序列如SEQIDN0.1所示的DNA片段通過質(zhì)粒pAgl-CstrxRl導(dǎo)入瑞氏木霉基因組，所述質(zhì)粒pAgl-CstrxRl是在質(zhì)粒pAgl-H3的KpnI和ApaI位點順序裝入瑞氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子序列Pcbhl、序列如SEQ ID N0.1所示的DN A片段和瑞氏木霉纖維二糖水解酶I終止序列Tcbhl。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述構(gòu)建瑞氏木霉工程菌CstrxRl的方法，其特征在于:所述瑞氏木霉為瑞氏木霉D-86271。5.權(quán)利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl在產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分類名稱為瑞氏木霉<i>Trichoderma</i><i>？reesei？</i>CstrxR1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為：2016年3月1日，保藏編號為CCTCC？NO:？M2016078，保藏地址為中國湖北武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明的瑞氏木霉工程菌CstrxR1，其各纖維素酶產(chǎn)量與瑞氏木霉親本菌株相比提高0.78倍。本發(fā)明對提高纖維素酶生產(chǎn)效率具有重要應(yīng)用價值。CCTCC NO: M201607820160301
【IPC分類】C12N15/80, C12N9/42, C12N1/15, C12R1/885
【公開號】CN105647821
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】龍良鯤, 丁少軍, 丁達繁, 徐梅娟
【申請人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月24日