一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食用菌常規(guī)的菌種選育可分為自然選育和人工選育，人工選育又分為誘變育種、雜交育種和原生質(zhì)體融合育種。自然選育雖然選育目的性很強(qiáng)，但是效果是相對的，有條件的，從本質(zhì)上將不能改變個體的基因型，而只是積累并利用其自然條件下發(fā)生的有益變異，既費(fèi)時又費(fèi)力。誘變育種盡管具有速度快、收效大、方法比較簡便等優(yōu)點(diǎn)，但其遺傳突變率較大，存在盲目性。雜交育種雖然具有一定的定向性，但由于食用菌是有極性的真菌，因不親合性及細(xì)胞壁的存在使得雜交育種受到一定的限制。食用菌原生質(zhì)體育種研究雖起步較晚，但發(fā)展很快。它比傳統(tǒng)的雜交育種具有明顯的開拓性。由于原生質(zhì)體育種具有不受親緣關(guān)系的影響、遺傳信息傳遞量大、不需了解雙親詳細(xì)的遺傳背景等優(yōu)點(diǎn)，因而便于操作，使得食用菌在屬間、科間甚至更高分類層次上的雜交成為可能。
[0003]有效制備原生質(zhì)體是原生質(zhì)體育種的第一步，由于不同原生質(zhì)體之間的融合概率低，以及存在再生率，融合子篩選等問題，使成功獲得融合子的概率非常低，因此使用數(shù)量巨大的原生質(zhì)體進(jìn)行融合是保證原生質(zhì)體育種成功的有效途徑?，F(xiàn)有的報道中，獲取原生質(zhì)體普遍采用酶解菌絲的方法，但該方法獲取原生質(zhì)體的效率偏低，且酶解條件不易控制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法，該方法通過先制備單細(xì)胞懸液，然后酶解制備原生質(zhì)體，在此過程中通過添加金屬離子控制菌絲生長和穩(wěn)定原生質(zhì)體，有效的提高了原生質(zhì)體的制備效率。
[0005]解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是:一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法，包括以下步驟:
⑴按常規(guī)方法收集新鮮羊肚菌孢子后，將孢子置于液體培養(yǎng)基中于35-40°C培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)液初始濃度為5 X 15?5 X 16個/ml;所述液體培養(yǎng)基是在常規(guī)H)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加C11CI2至終濃度為10mmol/L;
⑵培養(yǎng)4-6天后，離心收集菌體，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液重懸菌體;PBS緩沖液與步驟⑴液體培養(yǎng)基體積比為1:8-1:12;
(3)將重懸后的菌體與直徑0.2_的石英砂按體積比2:1混合后，置于漩渦振蕩器上振蕩15-30min；
⑷將震蕩后的菌體過濾2次；
(5)收集過濾液離心處理，菌體用等體積0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液洗滌2次后，再重懸于4-6倍體積的0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液中；
(6)向重懸液中添加溶壁酶至終濃度10-15mg/ml，添加蝸牛酶至終濃度10-15mg/ml，30°C 處理 l_3h; (7)將酶處理后的細(xì)胞于離心處理，沉淀經(jīng)等體積0.5mol/L的ZnCl2溶液洗滌2次后，重懸于等體積的ZnCl2溶液中，即獲得羊肚菌原生質(zhì)體溶液。
[0006]步驟(5)離心處理是在5000rpm離心5min。
[0007]步驟(7)離心處理是在3500 rpm離心3min。
[0008]步驟⑷第一次過濾使用150目濾布，第二次使用800目濾布。
[0009]采用現(xiàn)有方法制備原生質(zhì)體，每批次之間的制備率變化很大，這是因為制備過程是用菌絲直接進(jìn)行酶解，酶解過程不能很好的控制，所以制備的原生質(zhì)體的量很難上去。本發(fā)明是通過先制備單細(xì)胞懸液，然后酶解制備原生質(zhì)體，在此過程中通過添加金屬離子控制菌絲生長和穩(wěn)定原生質(zhì)體，有效的提高了原生質(zhì)體的制備效率，能在短時間內(nèi)制備大量的羊肚菌原生質(zhì)體，為后續(xù)的育種奠定基礎(chǔ)。
[0010]該方法除了可以應(yīng)用在羊肚菌原生質(zhì)體的制備上，還可用于平菇、香菇、金福菇、雙孢菇、松茸、金針菇、茶樹菇等多種食用菌的原生質(zhì)體制備上。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1:一種羊肚菌原生質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟:
1.按常規(guī)方法收集羊肚菌孢子后，將孢子置于液體培養(yǎng)基中于35-40°C培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)液初始濃度為5 X 15?5 X 16個/ml。該培養(yǎng)基是在常規(guī)H)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加CuCl2至終濃度為10mmol/L。
[0012]2.培養(yǎng)4-6天后，離心收集菌體，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液重懸菌體。PBS緩沖液與原培養(yǎng)液體積比為1:8-1:12。
[0013]3.將重懸后的菌體與直徑0.2mm的石英砂按體積比2:1混合后，置于漩渦振蕩器上振蕩15_30min。
[0014]4.將震蕩后的菌體經(jīng)過2次過濾，第一次過濾使用150目濾布，第二次使用800目濾布。
[0015]5.收集過濾液后于5000 rpm離心5min，將菌體后用等體積0.15mol/L的ρΗ7.0的PBS緩沖液洗滌菌體2次后，再重懸于4-6倍體積的0.15mol/L的ρΗ7.0的PBS緩沖液中。
[0016]6.向重懸液中添加溶壁酶至終濃度10-15mg/ml，添加蝸牛酶至終濃度10-15mg/ml，30°C處理 1-3 ho
[0017]7.將酶處理后的細(xì)胞于3500 rpm離心3min，沉淀經(jīng)等體積0.5mol/L的ZnCl2溶液洗滌2次后，重懸于等體積的ZnCl2溶液中，即獲得金福菇原生質(zhì)體溶液。
[0018]本發(fā)明除了可用于羊肚菌原生質(zhì)體的制備外，還可以用于平菇、香菇、金福菇、雙孢菇、松茸、金針菇、茶樹菇等多種食用菌的原生質(zhì)體制備上。
【主權(quán)項】
1.一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法，其特征在于:包括以下步驟: ⑴按常規(guī)方法收集新鮮羊肚菌孢子后，將孢子置于液體培養(yǎng)基中于35-40°C培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)液初始濃度為5 X 15?5 X 16個/ml;所述液體培養(yǎng)基是在常規(guī)H)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加CuCh至終濃度為10mmol/L; ⑵培養(yǎng)4-6天后，離心收集菌體，再使用0.15mo VL的pH7.0的PBS緩沖液重懸菌體;PBS緩沖液與步驟⑴液體培養(yǎng)基體積比為1:8-1:12; (3)將重懸后的菌體與直徑0.2_的石英砂按體積比2:1混合后，置于漩渦振蕩器上振蕩15-30min； ⑷將震蕩后的菌體過濾2次； (5)收集過濾液離心處理，菌體用等體積0.15moVL的pH7.0的I3BS緩沖液洗滌2次后，再重懸于4-6倍體積的0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液中； (6)向重懸液中添加溶壁酶至終濃度10_15mg/ml，添加蝸牛酶至終濃度10-15mg/ml，30°C 處理 l_3h; (7)將酶處理后的細(xì)胞于離心處理，沉淀經(jīng)等體積0.5mol/L的ZnCl2溶液洗滌2次后，重懸于等體積的ZnCl2溶液中，即獲得羊肚菌原生質(zhì)體溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法，其特征在于:步驟(5)離心處理是在5000rpm離心5min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法，其特征在于:步驟⑵離心處理是在3500 rpm離心3min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊肚菌原生質(zhì)體的高效制備方法，其特征在于:步驟⑷第一次過濾使用150目濾布，第二次使用800目濾布。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種食用菌原生質(zhì)體的高效制備方法，包括以下步驟：⑴收集新鮮羊肚菌孢子后置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基是在常規(guī)PD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加CuCl2；⑵培養(yǎng)4-6天后，離心收集菌體，再使用PBS緩沖液重懸菌體；⑶將重懸后的菌體與石英砂混合后，振蕩；⑷將震蕩后的菌體過濾2次；⑸收集過濾液離心處理，菌體用PBS緩沖液洗滌2次后，再重懸于PBS緩沖液中；⑹向重懸液中添加溶壁酶、蝸牛酶，30℃處理1-3h；⑺將酶處理后的細(xì)胞于離心處理，沉淀經(jīng)ZnCl2溶液洗滌后，重懸于ZnCl2溶液中，獲得羊肚菌原生質(zhì)體溶液。該方法通過先制備單細(xì)胞懸液，然后酶解制備原生質(zhì)體，在此過程中通過添加金屬離子控制菌絲生長和穩(wěn)定原生質(zhì)體，有效的提高了原生質(zhì)體的制備效率。
【IPC分類】C12R1/645, C12N1/14
【公開號】CN105647820
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】譚俊呈, 黃建星, 蘭健勇, 陳振坤, 易弋
【申請人】廣西生眾生物科技開發(fā)有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月22日