pBIG2RHPH2中的HPH表達(dá)單 元，進(jìn)一步構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2_ura5s。更進(jìn)一步地在質(zhì)粒pBIG2_ura5s和質(zhì)粒pET28a-HPHs的基礎(chǔ)上，構(gòu)建高山被孢霉基因操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基因組中獲 得非編碼的內(nèi)含子DNA片段IT。用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I分別對IT基因片段和質(zhì)粒 pET28a-HPHs進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng)將IT片段取代質(zhì)粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到質(zhì) 粒pET28a-ITs。用限制性內(nèi)切酶Spe I和Xba I雙酶切質(zhì)粒pET28a-ITs得到ITs表達(dá)單元。將 ITs表達(dá)單元插入到Xba I酶切過的質(zhì)粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用載 體pBIG2-ura5s-ITs。然后通過基因工程技術(shù)將ω-3脫飽和酶基因插入高山被孢霉通用載 體pBIG2_ura5s_ITs中，構(gòu)建二元表達(dá)載體pBIG2_ura5s-〇PpFADS17。
[0037]在本發(fā)明中，所述高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是已公開的重組高山被孢霉 MAUI (CCFM501 )，其保藏編號為CGMCC No . 8414，該菌株已在中國專利申請CN 201310347934.8 中公開。
[0038] 根據(jù)CN 201310347934.8說明書記載，重組高山被孢霉CCFM501是通過失活高山被 孢霉ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶OPRTase的ura5基因構(gòu)建而成的。其 中，ura5基因的失活是通過缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而實(shí)現(xiàn) 的，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的 1362bp的片段，具體步驟為：首先獲得ura5敲除基因片段，并進(jìn)一步構(gòu)建敲除質(zhì)粒 pBIG4K0ura5,然后用重組質(zhì)粒pBIG4K0ura5轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，最后用經(jīng)轉(zhuǎn)化的含質(zhì)粒 pBIG4K0ura5的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉并對轉(zhuǎn)化后的高山被孢霉進(jìn)行篩選和鑒定， 獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型高山被孢霉MAU1(CCFM501)菌株。
[0039]在本發(fā)明中，應(yīng)用于轉(zhuǎn)化高山被孢霉的根瘤土壤桿菌為：根瘤土壤桿菌 Agrobacterium tumefaciens C58Cl(Tsuji G , F u j i i S,Fujihara N,e t al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J].Journal of General Plant Pathology,2003,69(4) :230-239.),為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以公開獲得的菌株，在某些文獻(xiàn) 中，它也可能被稱為根癌農(nóng)桿菌。
[0040]本發(fā)明所涉及的Broth培養(yǎng)基，其組成為：20g/L葡萄糖，5g//L酵母提取物，lg/U粦 酸二氫鉀，〇. 25g/L七水硫酸鎂，10g/L硝酸鉀，余量為水，pH 6.0。
[0041 ]本發(fā)明所涉及的MM固體培養(yǎng)基，其組成為：1.74g/L磷酸氫二鉀，1.37g/L磷酸二氫 鉀，0.146g/L氯化鈉，0.49g/L七水硫酸鎂，0.078g/L氯化鈣，0.0025g/L七水硫酸亞鐵， 0.53g/L硫酸銨，1.8g/L葡萄糖，0.5 %甘油，20g/L瓊脂，余量為水，pH 6.8。
[0042]本發(fā)明所涉及的頂培養(yǎng)基是在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了200μΜ的乙酰丁香酮(AS) 構(gòu)成的。
[0043] 本發(fā)明所涉及的SC-CS培養(yǎng)基是添加了濃度為100yg/mL壯觀霉素奇霉素 (Spectinomycin)和濃度為100yg/mL頭抱噻月虧抗生素 （Cefotaxime Sodium)的SC固體培養(yǎng) 基。SC固體培養(yǎng)基組成為:20g/L葡萄糖，5g//L酵母氮源無氨基酸和硫酸銨，1.7g/l硫酸銨， 60mg/L異亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L蘇氨酸，40mg/L賴氨酸，30mg/L酪 氨酸，20mg/lJ泉嘌呤，20π^/1精氨酸，20π^/1組氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L瓊脂，余量為 水，pH 6.8。
[0044] 本發(fā)明所涉及的GY-CS培養(yǎng)基是添加了濃度為100yg/mL壯觀霉素奇霉素和濃度為 100yg/mL頭孢噻肟抗生素的GY固體培養(yǎng)基。GY固體培養(yǎng)基組成為:20g/L葡萄糖，10g/L酵母 提取物，2g/L硝酸鉀，lg/L磷酸二氫鈉，3g/L七水硫酸鎂，20g/L瓊脂，余量為水，pH 6.8。
[0045] 本發(fā)明在現(xiàn)有的高山被孢霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，采用根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn) 化方法，構(gòu)建了在高山被孢霉中過表達(dá)來源于寄生疫霉的ω -3脫飽和酶基因 oPpFADS 17的 工程菌株。獲得的重組高山被孢霉經(jīng)過多次傳代，經(jīng)鑒定〇PpFADS17片段仍穩(wěn)定存在基因組 中，且菌株的生長特性與原養(yǎng)型菌株無明顯差別，但重組菌的EPA產(chǎn)量達(dá)到總脂肪酸的 31.5%，對AA的轉(zhuǎn)化率高達(dá)77.6%，而原始菌株幾乎檢測不到EPA，較其他異源表達(dá)ω-3脫 飽和酶基因的重組高山被孢霉、甚至在先申請的過表達(dá)來源于瓜果腐霉的ω-3脫飽和酶基 因的高山被孢霉MA-〇PaFADS17-3菌株在ΕΡΑ產(chǎn)量上均得到了顯著提高，進(jìn)一步推動(dòng)了產(chǎn)油 真菌產(chǎn)業(yè)進(jìn)步和EPA的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0046] 本發(fā)明的重組高山被孢霉菌株1^-〇???40317-4于2016年1月18日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué) 院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11820。 【【附圖說明】】
[0047] 圖1為二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的構(gòu)建示意圖；
[0048] 圖2為過表達(dá)oPpFADSl7基因的高山被孢霉重組菌株鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。其 中，Μ為marker; 1:代表陰性對照;2-6:代表1-5號轉(zhuǎn)化子；
[0049] 圖3為高山被孢霉野生型菌株與5株基因工程菌株ω-3脫飽和酶基因（oPpFADS17) RT-qPCR的結(jié)果分析圖。其中，M.alpina為高山被孢霉野生型對照；1-5代表重組菌株1^_ oPpFADS17-l,MA-〇PpFADS17-2,MA-〇PpFADS17-3,MA-〇PpFADS17-4,MA-〇PpFADS17-5〇 【【具體實(shí)施方式】】
[0050] 實(shí)施例1:酶切反應(yīng)
[0051] 根據(jù)高山被孢霉的密碼子使用偏好性，對來源于天然寄生疫霉的ω-3脫飽和酶基 因的核酸序列(Genbank accession No:ΧΜ_008906963)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并且人工合成了 優(yōu)化后的基因序列〇PpFADS17,如SEQ No.l和2所示。然后與PUC57載體連接得PUC57-oPpFADS17〇
[0052] 在37°C條件下，先用限制性內(nèi)切酶Hind III過夜酶切質(zhì)粒PUC57-〇PpFADS17及載 體pBIG2-ura5s-ITs片段，Hind III酶切體系（100yL)為：2yL Hind III-HF，30yL質(zhì)?；蜉d 體，l〇yL Cutsmart Buffer，58yL去離子水，37°C孵育 12h〇
[0053] 其中，載體pBIG2-ura5s-Its是根據(jù)中國專利申請CN201310524221.4直接獲得的。
[0054] 通過PCR的方法從pD4質(zhì)粒上獲得HPH表達(dá)單元，將HPH表達(dá)單元用限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Xba I酶切，插入到EcoR I和Xba I酶切過的pET28a( + )的多克隆位點(diǎn)(MCS)中，得 到質(zhì)粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉cDNA中獲得ura5(乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶； OPRTase)基因，并利用限制性內(nèi)切酶BspH I和BamH頂每切ura5基因，將酶切過的ura5基因 插入到Nco I和BamH頂每切過的質(zhì)粒pET28a-HPHs中，以替換hpt基因，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ura5s。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切質(zhì)粒pET28a_ura5s得到ura5s表達(dá)單元。將 ura5s表達(dá)單元替換質(zhì)粒pBIG2RHPH2中的HPH表達(dá)單元，進(jìn)一步構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2-ura5s。更進(jìn)一步地在質(zhì)粒pBIG2-ura5s和質(zhì)粒pET28a-HPHs的基礎(chǔ)上，構(gòu)建高山被孢霉基因 操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基因組中獲得非編碼的內(nèi)含子DNA片段IT。用限 制性內(nèi)切酶Ncol和BamHI分別對IT基因片段和質(zhì)粒pET28a-HPHs進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng) 將IT片段取代質(zhì)粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到質(zhì)粒pET28a-ITs。用限制性內(nèi)切酶Spe I和 Xba I雙酶切質(zhì)粒pET28a-ITs得到ITs表達(dá)單元。將ITs表達(dá)單元插入到Xba I酶切過的質(zhì)粒 pBIG2_ura5s中得到高山被孢霉基因操作通用載體pBIG2_ura5s_ITs。
[0055]回收酶切產(chǎn)物，進(jìn)一步使用限制性內(nèi)切酶Xho I單酶切，切膠純化回收目的基因 (ω-3脫飽和酶基因片段oPpFADS17)和載體pBIG2-ura5s-ITs片段。酶切體系為（100μυ:2μ L Xho I，30yL質(zhì)?；蜉d體pBIG2_ura5s_ITs片段，10yL cutsmart Buffer，58yL去離子水， 37°C水浴酶切12h。
[0056] 其中，內(nèi)切酶緩沖液Cutsmart buf f er: 50mM乙酸，20mM Tris-乙酸，10M乙酸儀， 100yg/mL牛血清白蛋白，pH 7.9。
[0057] 實(shí)施例2:連接反應(yīng)
[0058]用T4連接酶將酶切純化后的ω-3脫飽和酶基因片段〇PpFADS17與載體pBIG2-ura5s-ITs連接，4°C連接12h，得到重組表達(dá)載體pBIG2-ura5s-〇PpFADS17。連接體系為（10μ L): 2yL目的基因酶切后片段，3yL載體酶切后片段，lyL連接酶buff er，lyL Τ4連接酶，3yL無 菌水，4°C連接12h。
[0059]連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法如下：
[0060]⑴