ED顯色液，搖動(dòng)96孔板混勻。
[0057] (6)在室溫下孵育30min，避免光照。
[0058] (7)每孔分別加入10yL GENMED終止液。
[0059] (8)即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測(cè)定光吸收度(A)，選擇波長(zhǎng)570nm。
[0060] (9)根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞死亡率：
[0061] 處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)=處理樣品孔吸光讀數(shù)一樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù)一背景空 對(duì)照孔吸光讀數(shù)
[0062]樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)=樣品最大酶活性對(duì)照孔吸光讀數(shù)一樣品 對(duì)照孔吸光讀數(shù)一背景空對(duì)照孔吸光讀數(shù)
[0063]細(xì)胞死亡率=(處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)+樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)） X100%
[0064] 3.3肝細(xì)胞功能指標(biāo)的測(cè)定：
[0065] 按上述方法進(jìn)行細(xì)胞分組、預(yù)處理和模擬缺血再灌注損傷。到終末時(shí)間點(diǎn)分別將 各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液100yL收集于Ep管中，每管分別加入100yL完全培養(yǎng)基稀釋至200yL，室 溫下離心5min，速度為1200r/min。取上清液在全自動(dòng)生化儀下檢測(cè)ASL、ALT和LDH水平。實(shí) 驗(yàn)重復(fù)2次。
[0066] 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0067] 使用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示， 組間比較采用單因素方差分析，P<〇.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0068]三、結(jié)果及結(jié)論
[0069] 1、化合物（I)預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞活力的影響
[0070] IR組肝細(xì)胞活力比N組明顯下降（P〈0.05)，表明體外模擬缺血再灌注過程成功地 造成了肝細(xì)胞的缺血再灌注損傷。給予5ng/mL化合物（I)預(yù)處理1小時(shí)，缺血再灌注損傷肝 細(xì)胞的活力較缺血再灌注組和生理鹽水組增強(qiáng)(P〈〇.05)，但未能恢復(fù)到正常組肝細(xì)胞活力 水平(P〈0.05)，生理鹽水組則與缺血再灌注組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而0.5ng/mL和 50ng/mL濃度的化合物（I)預(yù)處理1小時(shí)，均未能增強(qiáng)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞的活力（P> 0.05)，其肝細(xì)胞活力與生理鹽水組之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1(1表示 與N組比較，P〈0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義'表示與IR組和NS組比較，P〈0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義，下同）。
[0071] 2、化合物(I)預(yù)處理對(duì)肝細(xì)胞缺血再灌注損傷的細(xì)胞繁殖和毒性的影響
[0072]與正常組相比，體外模擬缺血再灌注損傷使細(xì)胞死亡率>90 %。給予5ng/mL化合物 (I)預(yù)處理1小時(shí)，肝細(xì)胞死亡率下降約35%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，但其細(xì)胞死亡率 仍比正常組高約50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);而生理鹽水組肝細(xì)胞死亡率比缺血再 灌注組雖略有下降（約為8% )，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.5ng/mL和50ng/mL濃度的化合物（I) 預(yù)處理1小時(shí)，肝細(xì)胞死亡率比缺血再灌注組分別降低6%和13%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);而與生理鹽水組的肝細(xì)胞死亡率相近(P>0.05)。結(jié)果見表2。
[0073] 3、化合物(I)預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞肝功能指標(biāo)的影響
[0074]與正常組比較，缺血再灌注損傷組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALT水平未見明顯升高(P> 0.05);而AST、LDH水平以及AST/ALT比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。給予5ng/ mL化合物（I)預(yù)處理1小時(shí)，肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的AST、LDH水平以及AST/ALT比值較缺血再 灌注組和生理鹽水組降低，但仍較正常組高(P〈0.05);而ALT水平與缺血再灌注組和生理鹽 水組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>〇. 05)。生理鹽水組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALT、AST、LDH水平 以及AST/ALT比值與缺血再灌注組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PXhOShO.Sng/mL和50ng/mL化 合物（I)預(yù)處理1小時(shí)，均未能使肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的AST、LDH水平降低(P>0.05)。結(jié)果見 表3〇
[0075]本研究顯示，化合物（I)(RE2組)使肝細(xì)胞對(duì)之后經(jīng)歷的缺血再灌注損傷的耐受力 增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率降低。以上結(jié)果提示，化合物（I)預(yù)處理能夠減輕 人肝細(xì)胞缺血再灌注損傷，起到肝細(xì)胞保護(hù)作用。
[0076]表1 MTT法檢測(cè)化合物（I)預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷肝細(xì)胞活力的影響
[0077]
[0078]~表2 LDH釋放法肝細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)細(xì)胞死亡率
[0079]
[0080] ~表3肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH水平的變化(η = 5) '
[0081]
[0082] 實(shí)施例3
[0083] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0084] 實(shí)施例4
[0085] 口服液制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0086] 實(shí)施例5
[0087] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0088] 實(shí)施例6
[0089] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0090] 實(shí)施例7
[0091] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0092] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于肝臟保護(hù)的三萜化合物，其特征在于:它具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α)， 、1 乂 〇2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：（a)將文冠 果的干燥枝粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、 乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物；（b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用 80%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫物浸膏；（c)步 驟(b)中80 %乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、15:1和1:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次 用體積比為20:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2 用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收 集10~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101大 孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟a中用乙醇熱回流提 取采用的乙醇濃度為75 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可接受的載體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于肝臟保護(hù)的三萜化合物及其制備方法。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的三萜類化合物，可以從文冠果的干燥枝中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物使肝細(xì)胞對(duì)之后經(jīng)歷的缺血再灌注損傷的耐受力增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率降低?；衔?Ⅰ)預(yù)處理能夠減輕人肝細(xì)胞缺血再灌注損傷，起到肝細(xì)胞保護(hù)作用，可以進(jìn)一步用來開發(fā)成肝臟保護(hù)的藥物。
【IPC分類】A61P1/16, A61K31/56, C07J63/00
【公開號(hào)】CN105622706
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511000781
【發(fā)明人】王賽波
【申請(qǐng)人】溫州統(tǒng)益生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2015年12月27日