· 7(CH3，30-C)，16 · 3(CH3，31-C);碳原子標記參見圖 1。咕 NMR譜顯示五個甲 基單峰（δΗΟ · 93，Me-18; 1 · 68，Me-27;0 · 85，Me-28; 1 · 32，Me-29; 1 · 21，Me-30)，兩個甲基雙峰 (SH1.01，J = 6.6Hz，Me-21;0.93，J = 7.0Hz，Me-31)，一對順式二取代的雙鍵氫質(zhì)子（δ 冊.81，(1，了 = 9.8!^，!1-2;6.26，(1，了 = 9.8泡，!1-3)，一個末端雙鍵（3邢.01，8，!1-26;4.79,8， 11-26)，以及一個含氧次甲基0!13.27，(1，1 = 6.3抱，!1-11)。13〇匪1?譜顯示31個碳信號，分別 為七個甲基，八個亞甲基(一個為烯烴碳），七個次甲基(兩個烯烴碳，一個含氧次甲基)和九 個季碳(一個酮羰基，三個烯烴碳，一個含氧季碳）。HMBC譜中，CH 3-29 (CH3-30)與C-3，C-4和 C-5，以及Η-2與C-l，C-4和C-10的相關性表明環(huán)Α為4，4-二甲基-2，5-二烯酮部分。HMBC譜 中，H2-19與C-l，C-10，C-5，C-9和C-8，H2-6與C-4，C-5，C-7，C-8和C-10的相關性，以及CH 2 (6) -CH2 (7) -CH⑶自旋系統(tǒng)，表明B環(huán)為取代的環(huán)庚烷。通過HMBC譜中CH3-31與C-23，C-24和 C-25的相關性，可知C-24位連有一個甲基。此外，CH3-27與C-24，C-25和C-26的相關性表明 C-25和C-26之間存在雙鍵。C-9(SC62.7)和C-11(SC60.9)的化學位移表明兩者各連有一個 羥基基團。綜合氫譜，碳譜，HMBC譜和NOESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確 定該化合物如圖1所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致（圖 2) 〇
[0024]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗
[0025] -、材料和儀器
[0026] HL7702肝細胞株由中國科學院上海生命科學研究所提供?；衔铮↖)自制，方法見 實施例1，HPLC歸一化純度大于98%。高糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM/F12 = 1:1培養(yǎng)基、胎牛血 清均購于HycLoneJDTA購于上海試劑一廠。臺盼藍購于北京化工廠。無糖DMEM培養(yǎng)基購于 Gibco。胰酶、MTT、DMS0均購于Amresco。LDH釋放法檢測試劑盒購于GENMDE。ALT生化檢測試 劑盒、AST生化檢測試劑盒、LDH生化檢測試劑盒均購于美國貝克曼試劑有限公司。Western 及IP細胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MDA檢測試劑盒均購于碧云天生物技術研 究所。
[0027] C02培養(yǎng)箱（SheL-Lab 2300)，電熱恒溫孵育箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），缺氧培養(yǎng) 盒(長沙長錦科技有限公司），GasALert Extreme氧氣檢測儀(加拿大BW TechnoLogies)，酶 標儀（美國BioTek Epoch)，全自動生化儀（Beckman LX20)，離心機（德國Eppendorf centrifyge 5415D)，孔板離心機（德國Eppendorf centrifyge 5430R)，電子微量天平 (METTLER TOLEDO AL104)，PH儀（Thermo ORION 3STAR)〇
[0028] 二、試驗方法
[0029] 1、細胞分組
[0030] 將細胞分為6組，每組6個復孔：
[0031] (1)正常培養(yǎng)組(N組）：完全培養(yǎng)基，正常條件下培養(yǎng)；
[0032] (2)缺血再灌注組（IR組）：完全培養(yǎng)基正常條件培養(yǎng)lh后，模擬缺氧8h，再灌注4h;
[0033] (3)化合物（I)組：
[0034] RE1 組：化合物（I )0 · 5ng/mL預處理 lh;
[0035] RE2 組：化合物（I) 5ng/mL 預處理 lh;
[0036] RE3組:化合物（I )50ng/mL預處理lh;模擬缺氧8h，再灌注4h;
[0037] (4)生理鹽水組(NS組）：以與化合物（I)同等體積的生理鹽水預處理1 h，模擬缺氧 8h，再灌注4h。
[0038] 2、化合物（I)的預處理
[0039] (1)化合物（I)的配制：將lmg化合物（I)溶解于500mL生理鹽水中。移液槍吸取 2.5mL于第一支離心管中，用生理鹽水稀釋至10mL配制成濃度為500ng/mL的化合物（I)溶 液。從第一支離心管中吸取lmL至第二支離心管中，用生理鹽水稀釋至10mL配制成濃度為 50ng/mL的化合物（I)溶液。從第二支離心管中吸取lmL至第三支離心管中，用生理鹽水稀釋 至1 OmL配制成濃度為5ng/mL的化合物（I)溶液。作好標記。
[0040] (2)化合物（I)預處理：正常培養(yǎng)組和缺血再灌注組以每孔lOOyL新鮮的完全培養(yǎng) 基更換。RE1組每孔加入5ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL，RE2組每孔 加入50ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL，RE3組每孔加入500ng/mL的 化合物（I)溶液l〇yL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL。生理鹽水組每孔加入生理鹽水10yL和新鮮 的完全培養(yǎng)基90yL。輕輕搖動96孔板，使藥液充分混混勻，放入C0 2培養(yǎng)箱中孵育lh。
[0041 ] 3、肝細胞體外模擬缺血再灌注損傷模型的建立：
[0042] (1)體外模擬缺血過程:預處理時間結(jié)束后，從細胞培養(yǎng)箱中取出第一塊96孔板， 正常培養(yǎng)組每孔用1 OOyL完全培養(yǎng)基更換，放入C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h。從C02培養(yǎng)箱中取 出第二塊96孔板，缺血再灌注組、化合物（I)預處理組和生理鹽水組每孔用100yL無糖DMEM 培養(yǎng)基置換完全培養(yǎng)基，放入缺氧培養(yǎng)盒中，培養(yǎng)盒中放入盛有50mL滅菌水的無菌小瓶保 持飽和濕度。將缺氧培養(yǎng)盒放入37°C恒溫孵育箱中，進氣口連接94%N 2-5 %⑶2-1 %02混合 氣體，出氣口連接氧氣檢測儀。以2L/min的氣體流量通入混合氣體，當氧氣檢測儀顯示出氣 口氧氣濃度〈1 %時，調(diào)節(jié)混合氣體流量300mL/min維持出氣口氧氣濃度〈1 %。以此模擬缺血 過程8h。
[0043] (2)體外模擬再灌注過程:從C02培養(yǎng)箱中取出第一塊96孔板，正常培養(yǎng)組每孔更 換100yL新鮮的完全培養(yǎng)基，放入C0 2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。從缺氧培養(yǎng)盒中取出第二塊96 孔板，缺血再灌注組、化合物（I)預處理組和生理鹽水組每孔用1〇〇此新鮮的完全培養(yǎng)基置 換無糖DMEM培養(yǎng)基，放入C0 2培養(yǎng)箱中正常條件下(37 °C、5 % C02、95 %空氣、飽和濕度)培養(yǎng) 4h，模擬再灌注過程。
[0044] 3、指標檢測
[0045] 3 · 1MTT法檢測肝細胞活力
[0046] (l)MTT溶液配制：用電子微量天平稱取250mg MTT，放入小燒杯中，加入50mL PBS 攪拌30min，使之充分溶解，即為濃度為5mg/mL的MTT溶液。在超凈工作臺中用0.22μπι的微孔 濾器除菌，分裝為每支lmL，4 °C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0047] (2)細胞準備：按上述方法進行細胞分組，并另設調(diào)零孔。并按上述方法進行化合 物(I)預處理和體外模擬缺血再灌注過程。
[0048] (3)呈色：終末時間點每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL，放入37°C、5 %⑶2、95 %空 氣、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入100yL DMS0溶液，微量振蕩器上振蕩1 Omin，使結(jié)晶物充分溶解。
[0049] (4)比色:選擇570nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收度(A)，記錄結(jié)果。實驗重復 2次。
[0050] 3.2乳酸脫氫酶釋放法細胞繁殖與毒性檢測
[0051 ]按GENMED乳酸脫氫酶釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒說明書操作，重復2 次。
[0052] (1)按上述方法準備待測細胞，并另設無細胞的培養(yǎng)液（背景空對照孔)和未處理 的后續(xù)裂解的細胞(樣品最大酶活性對照孔），作好標記。
[0053 ] (2)到規(guī)定的檢測時間點前1小時，從C02培養(yǎng)箱中取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板，加 入10yL GENMED裂解液到未處理的后續(xù)裂解的細胞孔里，同時加入10yL GENMED補充液到其 余所有檢測孔里。放回C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1小時即規(guī)定檢測時間。
[0054] (3)從⑶2培養(yǎng)箱取出待測96孔細胞培養(yǎng)板，放入孔板離心機離心10min，速度為 250g〇
[0055] (4)分別小心移取50yL上清液到新的96孔板的相應孔里，同時作好標記。
[0056] (5)混勻GENMED反應液，每孔分別加入50yL GENMED反應液，再分別每孔加入10yL GENM