轉(zhuǎn)化鑒定：連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到宿主菌DH5a中進(jìn)行重組子的篩選。將篩 選的單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒的提取，之后由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn) 行測(cè)序，得到融合重組載體pETSUM0-28a。
[0081] 再次酶切連接：將含有BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)的LI基因片段以及重組載體 pETSUM0-28a進(jìn)行BamHI/Xhol雙酶切處理，之后利用T4 DNA連接酶將回收的基因片段與含 有對(duì)應(yīng)粘性末端的pETSUM0-28a進(jìn)行連接反應(yīng)，16 °C 10~15 h。
[0082] 再次轉(zhuǎn)化鑒定：連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到宿主菌DH5 α中進(jìn)行重組子的篩選。 將篩選的單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒的提取，之后由上海生工生物公司進(jìn)行測(cè) 序，得到融合重組MBP-HPV18-L1蛋白質(zhì)的基因序列SEQ NO. 7。
[0083] 實(shí)施例7 :重組HPV Ll五聚體蛋白質(zhì)的表達(dá) 將測(cè)序結(jié)果正確實(shí)施例2、3、4、5和6的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞，并作為 表達(dá)重組蛋白質(zhì)的工程菌進(jìn)行HPV Ll蛋白的表達(dá)。工程菌培養(yǎng)基為2YT培養(yǎng)基（10 g/L胰 化蛋白胨；5 g/L酵母粉；10 g/L NaCl)。挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑于IOml 2YT培養(yǎng)基 (含100 μ g/ml氨芐青霉素）中，230轉(zhuǎn)/分鐘（rpm)，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)接5 ml過(guò)夜菌 于500 ml (含100 μg/ml氨芐青霉素 ）2YT液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至重組工程菌生 長(zhǎng)至0D600nm~0. 4~1時(shí)，加入終濃度0. 2mM的IPTG誘導(dǎo)，在28°C的條件下進(jìn)行6h以上 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0084] 細(xì)胞收集及破碎:對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行離心，棄上清，收獲菌體沉淀，稱重；使用 buffer L (pH 8.0,50 mM Tris，200 mM NaCl，5mM DTT)洗滌沉淀，然后將其重懸于 buffer L中進(jìn)行超聲波破碎，隨后通過(guò)高速離心機(jī)對(duì)破菌液進(jìn)行離心（16000 rpm，30 min，4°C )，收 集上清液。
[0085] 實(shí)施例8 :重組HPV Ll五聚體蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量的檢測(cè) 采用ELISA夾心法檢測(cè)親和層析上樣前Tag-HPV Ll五聚體蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量， 樣品及供試品： 包被抗體：自制抗HPV18 Ll小鼠單抗。
[0086] 對(duì)照品：自制高純度的HPV18 Ll蛋白。
[0087] 供試品：用樣品稀釋液將供試品Tag-HPVlS Ll稀釋至濃度在對(duì)照品梯度稀釋濃 度范圍內(nèi)。
[0088] 酶標(biāo)抗體：自制的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗HPV18 Ll蛋白多抗。
[0089] 結(jié)果計(jì)算：計(jì)算平行孔的平均值，以對(duì)照品系列濃度OD 45。吸收值對(duì)其相應(yīng)的Ll 蛋白抗原作直線方程，平行樣品孔間變異系數(shù)不得大于10%，直線回歸方程R2不得小于 0. 980,將供試品的OD45。吸收值代入方程計(jì)算出稀釋后供試品Ll蛋白抗原含量，再乘以相 應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為供試品中Ll蛋白抗原含量，見(jiàn)表1。
[0090] 表1檢測(cè)表達(dá)后Tag-HPV Ll蛋白抗原含量
實(shí)施例9 :重組HPV Ll五聚體蛋白質(zhì)親和層析 帶GST標(biāo)簽重組蛋白的親和層析：親和柱中裝入GST瓊脂糖親和層析介質(zhì)5ml，以 buffer L (pH 8.0,50 mM Tris，200 mM NaCl，5mM DTT)平衡層析柱，然后上樣實(shí)施例 8 中 帶有GST或GST-SUMO標(biāo)簽的蛋白液，完畢后以Buffer L洗至無(wú)蛋白質(zhì)流出，親和完畢。以 5mL Buffer L懸浮親和介質(zhì)，取樣檢測(cè)并計(jì)算介質(zhì)中結(jié)合Ll蛋白質(zhì)的總量。
[0091] 帶MBP標(biāo)簽重組蛋白的親和層析：親和柱中裝入Amylose-Resin親和層析介質(zhì) 5ml，以 buffer L (pH 8. 0,50 mM Tris，200 mM NaCl，5mM DTT)平衡層析柱，然后上樣實(shí)施 例8中帶有GST或GST-SUMO標(biāo)簽的蛋白液，完畢后以Buffer L洗至無(wú)蛋白質(zhì)流出，親和完 畢。以5mL Buffer L懸浮親和介質(zhì)，取樣檢測(cè)并計(jì)算介質(zhì)中結(jié)合Ll蛋白質(zhì)的總量。
[0092] 帶6*HIS標(biāo)簽重組蛋白的親和層析：取5ml Ni-NTA凝膠裝柱，在柱上緩慢加入10 倍柱體積的平衡液（50mmol/L NaH2P04,300mmol/L Nacl，20mmol/L imidazole，用 NaOH 調(diào) 整PH值至8)，以充分平衡Ni-NTA凝膠，流速為lml/min。取實(shí)施例8中過(guò)濾后的帶有6*His 標(biāo)簽的上清液，完全進(jìn)入凝膠后，用10倍柱體積的平衡液繼續(xù)洗滌凝膠，保存流速為lml/ min。用平衡液洗脫至無(wú)蛋白質(zhì)流出，親和完畢。取樣檢測(cè)并計(jì)算介質(zhì)中結(jié)合Ll蛋白質(zhì)的 總量。
[0093] 實(shí)施例10 :重組Tag-HPV Ll蛋白質(zhì)的酶切純化 按照目的蛋白質(zhì)與蛋白酶質(zhì)量比100 :1加入酶量，其中帶有GST-HPV-Ll的蛋白質(zhì) 用3C蛋白酶切，帶有GST-SUM0-HPV-L1和6*His-SUM0-HPV-Ll的蛋白質(zhì)用SENPl蛋白酶 切，帶有Mbp-HPV-Ll的蛋白質(zhì)用Factor Xa蛋白酶切，帶有6*His-HPV-Ll的蛋白質(zhì)用 Thrombin蛋白酶切，分別混合酶切2h后，分別洗脫收集各個(gè)蛋白酶切后所得的HPV18 Ll 五聚體蛋白質(zhì)溶液。
[0094] 將3C酶酶切GST標(biāo)簽后的Ll蛋白質(zhì)溶液用SDS- PAGE凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖 1親和層析電泳結(jié)果，實(shí)驗(yàn)表明，可將90%的目的蛋白切下。圖2為SENPl蛋白酶切帶有 GST-SUM0-HPV-L1的蛋白質(zhì)，用SDS- PAGE凝膠電泳檢測(cè)。圖3為Factor Xa蛋白酶切帶有 Mbp-HPV-Ll的蛋白質(zhì)，用SDS- PAGE凝膠電泳檢測(cè)。圖1-圖3說(shuō)明說(shuō)明得到了 55kDa的 HPV18 Ll 蛋白。
[0095] Thrombin 蛋白酶沒(méi)有切開(kāi) 6*His-HPV-Ll 的蛋白質(zhì)；用 SENPl 酶切 6*His-SUM0-Ll 的蛋白質(zhì)溶液用SDS- PAGE凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4,顯示SENPl蛋白酶未能切開(kāi)帶有 6*His-SUM0標(biāo)簽的溶合蛋白。
[0096] 實(shí)施例11 :重組HPV Ll五聚體蛋白質(zhì)的純化 分子篩色譜純化：將上一個(gè)實(shí)施例收集的酶切純化后的HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)分別 進(jìn)行純化，可先經(jīng)過(guò)離子交換色譜收集的HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)，或不經(jīng)過(guò)離子交換步驟 直接用Superdex200 (GE公司生產(chǎn)）的凝膠過(guò)濾介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分子篩層析，分子篩流動(dòng)相 為pH8. 0，10 mM Tris，100 mM NaCl，收集HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)紫外吸收峰的餾分。 [0097] 純化后測(cè)定樣品純度：將收集的蛋白質(zhì)溶液取樣用SDS- PAGE凝膠電泳檢測(cè)，目 的蛋白質(zhì)HPV18 Ll五聚體經(jīng)過(guò)分子篩層析純化后最終純度均大于98%，詳見(jiàn)圖5,經(jīng)過(guò)分子 篩色譜純化后的重組HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳圖。
[0098] 測(cè)定樣品蛋白濃度：用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，使用標(biāo)樣2mg/ml BAS配制 從lOOug/ul稀釋到500ug/ul，樣品反應(yīng)體系取IOul稀釋的BSA+200ulBradford工作液： 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 0.0013 X - 0.0294，R2 = 0.9986，測(cè)定樣品的OD595，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì) 算樣品的蛋白濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0099] 表2 Bradford法檢測(cè)重組HPV18 LI五聚體蛋白濃度
注：樣品組1為GST-HPV Ll經(jīng)分子篩純化后得HPV Ll五聚體蛋白溶液；樣品組2為 GST-SUMO-HPV Ll經(jīng)分子篩純化后得HPV Ll五聚體蛋白溶液；樣品組3為Mbp-HPV Ll經(jīng) 分子篩純化后得HPV Ll五聚體蛋白溶液。
[0100] 實(shí)施例12 :重組HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)組裝成VLP 在置于如下鹽濃度（NaCl)和PH值條件下，HPV Ll五聚體溶液樣品組1、2和3,放置穩(wěn) 定后，使用馬爾文Zetasizer NanoZS的動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀，進(jìn)行粒徑及粒徑分布測(cè)定(粒 徑分布系數(shù)PdI值為粒徑分散度指標(biāo)，小于0. 05為高度均一的樣品；0. 05~0. 1為準(zhǔn)均一 的樣品，0. 1~0. 3為均一性較差的樣品，大于0. 3為不均一的樣品)，，HPV18 Ll五聚體蛋 白組裝得到粒徑均一的VLP (PdI < 0. 05)。
[0101] 表3不同pH和鹽濃度條件下組裝HPV18 LI VLP的粒徑檢測(cè)
注：樣品組1為GST-HPV Ll經(jīng)分子篩純化后得HPV LI VLP蛋白溶液；樣品組2為 GST-SUMO-HPV Ll經(jīng)分子篩純化后得HPV LlVLP蛋白溶液；樣品組3為Mbp-HPV Ll經(jīng)分子 篩純化后得HPV LlVLP蛋白溶液。
[0102] 實(shí)施例13 :動(dòng)態(tài)光散射（DLS)對(duì)Ll五聚體和VLP蛋白質(zhì)粒徑測(cè)定 儀器為馬爾文Zetasizer NanoZS的動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀，取各樣品組最終制得的HPV18 Ll五聚體和HPV18 LI VLP蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)平均粒徑和分散性指數(shù)PdI (表明蛋白質(zhì)的 均一性)，說(shuō)明各組樣品最終制備的LI五聚體和VLP蛋白均一。其中樣品組2最終制得的 五聚體蛋白質(zhì)和其組裝獲得的HPV18 LI VLP蛋白質(zhì)粒徑分布詳見(jiàn)附圖6和7。
[0103] 實(shí)施例14 :HPV18 Ll五聚體和VLP的制備 依據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例1-13所采用的技術(shù)，制備具有序列11，12,13的HPV18 Ll蛋 白，以上蛋白均可純化得到純度達(dá)到98%以上的蛋白，得到平均粒徑10~15nm PdKO. 1的 HPV18 Ll五聚體蛋白。進(jìn)一步組裝得到平均粒徑45~65nm PdKO. 1的HPV18 LlVLP蛋 白。
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