大麗輪枝菌adp-atp載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因及其干擾載體和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大麗輪枝菌ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因，還涉及含有所述 ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載體，本發(fā)明還涉及所述大麗輪枝菌ADP-ATP 載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因或干擾載體在提高植物對大麗輪枝菌抗病性中的應用，屬于大麗 輪枝菌病程關(guān)鍵基因的克隆及應用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花黃萎病于1914年首次在美國發(fā)現(xiàn)，目前已成為一種世界性的病害，其病原菌 為大麗輪枝菌大麗輪枝菌Verticillium dahliae，屬于半知菌亞門（Deuteromycotina)、 淡色孢科（Moniliaceae)、輪枝菌屬（Verticillium)，它不僅嚴重危害棉花的纖維質(zhì)量和 皮棉產(chǎn)量，還可危害40科660種植物，其中農(nóng)作物184種，雜草153種（Rowe R. C.，Davis J. R. , Powelson M. L.,et al. Potato early dying:causal agents and management strategies. Plant Disease 1987,71:482-489)〇
[0003] ATP-ADP 載體蛋白（ADP，ATP carrier protein，AACP，VDAG-07535. I)作 為真核生物體線粒體膜上一種跨膜蛋白（Kim Y. H.，Haidl G.，Schaefer M.，et al. Compartmentalization of a unique ADP/ATP carrier protein SFEC (Sperm Flagellar Energy Carrier，AAC4)with glycolytic enzymes in the fibrous sheath of the human sperm flagellar principal piece. Developmental Biology 2007, 302:463-476.)，介導線粒體與細胞質(zhì)基質(zhì)之間的ADP/ATP交換（K1 ingenberg M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica et Biophysica Acta 2008, 1778:1978-2021.)，在通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生ATP給細胞提 供能量的過程中起著中心的作用，是保持細胞內(nèi)能量平衡的關(guān)鍵成分（Pebay-Peyroula E., Dahout-Gonzalez C. , Kahn R. , et al. Structure of mitochondrial ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside. Nature 2003,426:39-44)。AACP 與線粒體膜 上其它多種蛋白共同組成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，對保持線粒體內(nèi)的電化學平衡及穩(wěn)定狀態(tài) 具有重要作用（Kroemer G. , Zangami N. , and Susin S. A. Mitochondria and apotosis. Immumology Today 1997, 18:44-51.) 酵母的AACP2與多個蛋白復合體特有的大小和 成分有密切關(guān)系，例如線粒體載體家族（Claypool，S. M.，Oktay，Y.，Boontheung，P.，et al. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. Journal of Cell Biology 2008, 182:937-950.)〇 在酵母的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，Pep4p和AACP可以調(diào)節(jié)線粒體的降解（Pereira C.，Chaves S., Alves S.,et al. Mitochondrial degradation in acetic acid-induced yeast apoptosis: the role of Pep4and the ADP/ATP carrier. Molecular Microbiology 2010, 76:1398-1410.) AACP不僅作為負責能量分子傳導的轉(zhuǎn)運蛋白，在細胞凋亡調(diào)控 網(wǎng)絡中也具有重要的作用（Tsujimoto Y.，and Shimizu S. Role of the mitochondrial membrane permeability transition in cell death. Apoptosis 2007, 12:835-840.)〇 因 此，AACP是生物體內(nèi)能量產(chǎn)生與能量消耗的橋梁，與細胞的發(fā)育、繁殖和凋亡密切相關(guān)。
[0004] AACP在條形柄銹菌（Puccinia striiformis f. sp. Tritici)孢子萌發(fā)時的表達量 較少，在孢子形成時有大量表達。在病原菌與寄主植物相互作用的過程中，此基因的表達量 呈上升趨勢，這說明它在病原菌與植物互作的過程中可能發(fā)揮著重要功能（董艷玲.小麥 成株抗條銹病差異表達基因的cDNA-AFLP分析及小麥與條銹菌互作相關(guān)基因的克隆與特 征研究[博士學位論文].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2010)。
[0005] 目前對于AACP的研究主要集中于其與能量代謝之間的關(guān)系，在真菌中的研究較 少，尤其是其與致病性之間的關(guān)系。因此，以大麗輪枝菌的AACP作為靶標基因，研究其與病 原菌致病力之間的關(guān)系，對于提高植物對大麗輪枝菌的抗病性將具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的 ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因；
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵 靶基因的RNA干擾載體和宿主細胞；
[0008] 本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是將所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因 或RNA干擾載體應用于提高植物對大麗輪枝菌的抗病性。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明首先公開了大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的ADP-ATP載體蛋白 (ADP，ATP carrier protein，AACP)病程關(guān)鍵靶基因，其核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5 所示；優(yōu)選的，所述 ADP-ATP 載體 蛋白病程關(guān)鍵靶基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5所示。
[0011] 本發(fā)明采用寄主誘導的基因沉默技術(shù)（Host-induced gene silencing)，以高致 病力的大麗輪枝菌株V991為實驗材料，根據(jù)大麗輪枝菌AACP cDNA序列信息（其核苷酸序 列為SEQ ID No. 6所示），設計引物克隆獲得針對靶標基因的5個不同區(qū)段，其核苷酸序列 分別為SEQ ID No. 1-5所示。本發(fā)明進一步將克隆獲得的大麗輪枝菌基因的5個靶標片段 分別構(gòu)建到TRV2載體中，成為VIGS系列RNAi載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用于本氏煙草的注射，從 注射VIGS系列載體后的第8天進行大麗輪枝菌接種。病情指數(shù)分析結(jié)果表明，與空載相 比，注射真菌靶標基因片段的本氏煙草，病情指數(shù)均有所下降；其中分別注射VIGS系列載 體VIGS-I (靶標片段的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示）、VIGS-3(靶標片段的核苷酸序列 為SEQ ID No. 3所示）、VIGS-5 (靶標片段的核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示）的煙草，病 情指數(shù)一直保持在較低水平，初步說明它們與病原菌的致病性存在一定關(guān)系。
[0012] 本發(fā)明所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因能夠應用于提高植物對大麗輪枝 菌的抗病性，包括以下步驟：（1)構(gòu)建含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干 擾表達載體；（2)將所構(gòu)建的RNA干擾表達載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細胞中；(3)篩選獲得對 大麗輪枝菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0013] 本發(fā)明進一步公開了含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載體 以及含有所述RNA干擾載體的宿主細胞。
[0014] 構(gòu)建含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載體的方法為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知，優(yōu)選為Gateway技術(shù)，只需BP反應和LR反應就可以完成RNA干擾表達載 體的構(gòu)建。
[0015] 本發(fā)明所述RNA干擾載體也能夠應用于提高植物對大麗輪枝菌的抗病性，包括以 下步驟：（1)將所述RNA干擾表達載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細胞中；(2)篩選獲得對大麗輪枝 菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0016] 本發(fā)明還公開了一種培育抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法，包括以下步 驟：（1)構(gòu)建含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾表達載體；（2)將所構(gòu) 建的RNA干擾表達載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細胞中；（3)篩選獲得對大麗輪枝菌抗病性提高 的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
[0017] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化的方案以及將所述核苷酸引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物 或植物細胞的類型而變化。將所述核苷酸引入植物細胞的合適方法包括：顯微注射、電穿 孔、農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化和直接基因轉(zhuǎn)移等。
[0018] 本發(fā)明所述植物包括：大麗輪枝菌的寄主植物，優(yōu)選為農(nóng)作物，包括：棉花、煙草、 番茄、馬鈴薯、甜瓜、西瓜、黃瓜或花生中的任意一種或多種。
[0019] 本發(fā)明根據(jù)瞬時轉(zhuǎn)化的煙草病情指數(shù)的變化，選擇核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5所示的AACP三個DNA區(qū)段，用于Gateway干擾載體的構(gòu) 建。通過BP反應和LR反應，將上述3個靶標片段連接到Gateway干擾載體pK7GWIWG2 (I)，0 上，形成含有真菌靶標基因的植物轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌，用于本氏