18型重組人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人乳頭狀瘤病毒的病毒樣顆粒及其制備方法。更具體而言，本發(fā)明涉 及一種重組的人乳頭瘤病毒Ll蛋白的五聚體及病毒樣顆粒（Virus-like Particle，VLP) 及其制備方法，及含該病毒樣顆粒的疫苗組合物在預(yù)防人乳頭瘤病毒感染中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus,簡稱HPV)主要通過人體密切接觸，如性 傳播的病毒，可引起人類多種增殖性上皮病變，包括乳頭狀瘤(疣）和瘤樣病變。具體來講， HPV誘發(fā)的疾病主要包括3大類，第1類：宮頸、陰道、女性外陰、陰莖和肛門的癌癥及某些 類型的頭頸部腫瘤等惡性病變。100%的宮頸癌患者都是HPV感染所導(dǎo)致的，90%的肛門癌， 40%的外陰、陰道及陰莖，12%的口咽及3%的口腔癌癥歸因于HPV感染。第2類：良性病變 如扁平疣、尖銳濕疣等生殖器疣，是一種性傳播疾病，在性行為活躍的人群中很常見。雖然 生殖器疣不會像癌癥一樣造成嚴(yán)重的后果，但是病變通常會引起病人較為痛苦的臨床癥狀 如灼痛、出血和疼痛，同時產(chǎn)生尷尬、焦慮和自卑等負(fù)而的心理反應(yīng)，而且反復(fù)治療的過程 浪費了大量的醫(yī)療資源。在世界范圍內(nèi)估計由非致癌性HPV(主要是6和11型）引起的生 殖器疣有3000萬，其中20~50%的病變中還包含有高危型HPV的混合感染。第3類：HPV 感染還能引起復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤（RRP)，這是一種罕見的、具有潛在致命性的疾病，主要 發(fā)生在青少年時期，有時，大量的乳頭瘤可以引起呼吸困難并導(dǎo)致較小年齡兒童死亡。所以 預(yù)防或治療HPV感染對人類健康意義十分重大。
[0003] HPV是無囊膜的雙鏈DNA病毒，主要由病毒外殼和基因組DNA組成（Bernard, Burk et al. 2011)。HPV病毒外殼是由360個LI蛋白質(zhì)（形成72個五聚體)和至多72個L2蛋白 質(zhì)構(gòu)成的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑55~60 nm(Howley and Lowy 2007)。病毒外殼蛋白質(zhì)具有自 組裝特性，在體外Ll蛋白質(zhì)單獨或與L2蛋白質(zhì)共同自組裝形成病毒樣樣顆粒（Virus-like Particle, VLP) (Chen, Garcea et al. 2000, Finnen, Erickson et al. 2003, Buck, Cheng et al. 2008, Wang and Roden 2013)〇
[0004] 由于HPV不能在體外細(xì)胞培養(yǎng)，要獲得該病毒的特異性抗原，只能用重組DNA 技術(shù)的方法制備基因工程疫苗。重組Ll或L1/L2組裝形成的病毒樣顆粒VLPs，無病毒DNA， 安全性好，具有和天然病毒顆粒相似的抗原表位，刺激機體后可產(chǎn)生中和抗體IgG和IgA， 因此HPV VLPs可作為預(yù)防性疫苗，從而大大降低因感染HPV導(dǎo)致產(chǎn)生相關(guān)腫瘤的可能性 (Howley and Lowy 2007) 〇
[0005] HPV疫苗研制的關(guān)鍵是能夠大量制備高純度、穩(wěn)定的HPV抗原。在HPV疫苗抗原 制備技術(shù)方面，目前較為常用的生產(chǎn)HPV抗原的表達(dá)系統(tǒng)可以分為真核表達(dá)系統(tǒng)及原核表 達(dá)系統(tǒng)。常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有痘病毒表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)。 在真核表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的HPV Ll能自發(fā)的形成VLP，往往只需進(jìn)行簡單的純化即可獲得 VLP。但是由于真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量低，培養(yǎng)成本高，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大困 難。原核表達(dá)系統(tǒng)中利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPV Ll蛋白質(zhì)已有報道。但是由于大腸 桿菌所表達(dá)的HPV LI蛋白質(zhì)可溶性低，目前已知的純化方法大多通過無鹽沉淀或變性復(fù)性 等步驟從蛋白質(zhì)種類繁雜的細(xì)胞液中最終純化得到HPV VLP。例如：在專利CN02129070. 9 中公開通過原核細(xì)胞表達(dá)和制備HPV Ll多聚體的方法，其中純化工藝包括通過3. 3M尿素 處理和透析復(fù)性過程；在W0-0204007專利中對Ll-GST融合蛋白質(zhì)的純化方法也是通過尿 素變性處理并進(jìn)行透析復(fù)性；在現(xiàn)有技術(shù)中也有公開Ll蛋白質(zhì)的純化方法是包括磷酸緩 沖液超濾透析和離心，使目的蛋白沉淀再復(fù)溶的步驟。但是在這些純化過程中蛋白質(zhì)損失 量大，得率低，難以在大規(guī)模生產(chǎn)上應(yīng)用。
[0006] 在HPV疫苗抗原蛋白質(zhì)VLP的均一性方面，現(xiàn)有技術(shù)中所組裝的HPV LI VLP的粒 徑分散度有使用polyd值表示，polyd值〈15%說明顆粒有很好的均一性，15%到30%之間 說明顆粒有較大的不均一性，大于30%說明顆粒完全不夠均一?，F(xiàn)有技術(shù)中制備的HPV Ll VLP多大于15%。另一個說明粒徑均一的指標(biāo)是PdI值，PdI值為粒徑分布系數(shù)，小于0. 05 為高度均一的樣品；0.05~0. 1為準(zhǔn)均一的樣品，0. 1~0.3為均一性較差的樣品，大于0.3 為不均一的樣品。在US7205125B2專利中公開兩個型別HPV LI VLP的混合蛋白液的PdI 為 0.07。
[0007] 因此，本領(lǐng)域仍然需要成本低、純度高、產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定的HPV Ll蛋白質(zhì)生產(chǎn)技 術(shù)和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)重組HPV LI VLP的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是公開一種優(yōu)化的編碼HPV18 Ll蛋白質(zhì)的核苷酸序列，包含該核 苷酸序列的載體、包括載體的宿主細(xì)胞，以及由該多核苷酸序列翻譯表達(dá)的HPV Ll蛋白質(zhì)， Tag-HPV-Ll重組蛋白，由該Ll蛋白質(zhì)形成的五聚體和VLP，以及由該五聚體和VLP作為抗 原組成的預(yù)防HPV感染的疫苗。
[0009] 本發(fā)明第一方面提供一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV18 Ll的基因，其核苷酸序列為SEQ NO :2〇
[0010] 本發(fā)明第二方面提供一種構(gòu)建的表達(dá)載體，其包含本發(fā)明第一方面的經(jīng)密碼子優(yōu) 化的HPV18 Ll的基因。所述載體適合驅(qū)動異源DNA在細(xì)菌中翻譯表達(dá)HPV Ll蛋白質(zhì)。在 一個實施方案中，所述表達(dá)載體優(yōu)選pGEX-6p-l、pGEX-4T-2、pML或pET28a。
[0011] 本發(fā)明的第三方面提供一種構(gòu)建的工程菌細(xì)胞，該細(xì)胞包含本發(fā)明第一方面的基 因，或第二方面的表達(dá)載體。所述的工程菌宿主細(xì)胞是大腸桿菌，在一個實施方案中，所述 宿主細(xì)胞優(yōu)選BL21細(xì)胞株。
[0012] 本發(fā)明第四方面提供一種Tag_HPV18 Ll融合蛋白，其中標(biāo)簽Tag為6*His.Tag， 白質(zhì)和/或C端截短5個、10個、15個或不多于30個氨基酸和/或N端截短2個、4個、6 個或不多于10個氨基酸的Ll蛋白質(zhì)。
[0013] 編碼 Tag-HPVLl 融合蛋白 GST-HPV18 Ll 的核苷酸序列為 SEQ NO :3、SEQ NO :11，， GST-SUM0-HPV18 Ll 的核苷酸序列為 SEQ NO :4、SEQ NO :12, MBP 的核苷酸序列 SEQ NO :5、 SEQ N0:13,6*His-HPV18 Ll 的核苷酸序列為 SEQ N0:6，6*His-SUM0-HPV18 Ll 的核苷酸 序列為SEQ NO :7。
[0014] 編碼Tag-HPVLl融合蛋白GST-HPV18 Ll的氨基酸序列為SEQ NO :8， GST-SUM0-HPV18 LI的氨基酸序列為SEQ NO :9, MBP的氨基酸序列SEQ NO :10。
[0015] 本發(fā)明第五方面提供Tag-HPVLl融合蛋白質(zhì)經(jīng)過純化后獲得的HPV Ll的五聚體， 及由五聚體組裝的VLP。在一個優(yōu)選實施例中HPV18 Ll五聚體蛋白平均粒徑10~15nm PdKO. 1。在一個優(yōu)選實施例中HPV18 LlVLP的平均粒徑45~65nm PdKO. 1。
[0016] 本發(fā)明第六方面提供了一種疫苗組合物，其包含本發(fā)明HPV LI的五聚體或HPV LI 的VLP，所述組合物中進(jìn)一步包含可藥用的賦形劑和藥用佐劑。
[0017] 在一個實施方案中將含有HPV18 Ll五聚體或VLP蛋白原液(根據(jù)上述方法制備所 得)分別與氫氧化鋁佐劑生理鹽水溶液按照蛋白與鋁含量1:10比例進(jìn)行吸附配制即可制得 重組HPV Ll蛋白質(zhì)五聚體或VLP疫苗，在4°C保存待用。
[0018] 另一方面，本發(fā)明還提供一種獲得Tag-HPVLl融合蛋白的方法，包括如下步驟： A. 通過用大腸桿菌偏愛的密碼子取代HPV18 Ll基因序列的翻譯同種蛋白的密碼子， 得到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)偏愛的密碼子優(yōu)化的HPV18 Ll的基因； B. 構(gòu)建HPV18 Ll基因的大腸桿菌表達(dá)載體； C. 構(gòu)建Tag-HPV18 Ll的大腸桿菌表達(dá)工程菌株； D. 誘導(dǎo)表達(dá)并純化得融合蛋白Tag-HPV18 L1。
[0019] 上述制備融合蛋白Tag-HPV18 LI方法中原核宿主細(xì)胞選自但不限于GI698， ER2566，BL21 (DE3)，XA90，B834 (DE3)，BLR (DE3)。
[0020] 上述制備融合蛋白Tag_HPV18 LI方法中表達(dá)條件是：20~37°C溫度條件下，誘導(dǎo) 表達(dá)3~20小時。在一個具體實施例中優(yōu)選在28°C溫度條件下，誘導(dǎo)表達(dá)16小時。
[0021] 本發(fā)明還提供一種獲得HPV18 Ll五聚體的方法，包括如下步驟： a) 用親和層析方法吸附融合蛋白Tag-HPV18 Ll ; b) 加入蛋白質(zhì)水解酶切除Tag標(biāo)簽，得到HPV18 LI五聚體蛋白質(zhì)； c) 純化HPVLl五聚體蛋白質(zhì)、得到純度>98%，平均粒徑10~15nm PdKO. 1的Ll五聚 體蛋白質(zhì)。
[0022] 上述制備HPV18 Ll五聚體方法中所述用于蛋白酶為切除Tag標(biāo)簽的位點專一的 蛋白質(zhì)水解酶：重組3C蛋白酶，凝血酶，SUMO蛋白酶，SENPl或TEV蛋白酶。
[0023] 上述制備HPV18 Ll五聚體方法中純化方法選自但不限于離子交換色譜法，疏水性 色譜法，分子篩(或稱凝膠過濾或分子排阻）色