譜法；優(yōu)選地純化包括離子交換色譜法和分 子篩色譜法。
[0024] 上述制備HPV18 Ll五聚體方法中純化方法還包括使用還原劑，例如加入DTT。
[0025] 上述制備HPV18 Ll五聚體方法中最終純化后所得到HPV18 Ll五聚體蛋白平均粒 徑 10 ~15nm PdKO. 1。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種HPV18 LI五聚體組裝成VLP的方法，包括如下步驟： 將平均粒徑10~15nm PdKO. 1的Ll五聚體蛋白質(zhì)液與組裝緩沖液混合，最終獲得 pH值為5. 0~5. 9,鹽濃度為500~2000 mM，平均粒徑45~65nm PdKO. 1的HPV18 Ll VLP蛋白質(zhì)液，優(yōu)選獲得pH值為5. 7,鹽濃度為1300 mM的HPV18 LI VLP蛋白質(zhì)液。
[0027] 組裝緩沖液包括但不限于Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，醋酸緩沖液，HEPES緩沖 液，MOPS緩沖液，枸櫞酸緩沖液、組氨酸緩沖液，硼酸緩沖液等。
[0028] 上述HPV18 Ll五聚體組裝成VLP的方法中HPV18 Ll-VLP蛋白質(zhì)液中還可以加入 保護(hù)劑，例如：〇. Ol~0. 1聚山梨酯80。
[0029] 本發(fā)明還提供了另一種組裝VLP的方法一低溫冷凍處理組裝法，包括如下步驟： 將HPV Ll五聚體蛋白質(zhì)液置于pH值為5. 5~8. 0鹽濃度為150~1000 mM條件下 緩沖液，在-20~-80°C條件下完全冷凍，優(yōu)選冷凍24小時后，再放置室溫至蛋白質(zhì)原液融 解，獲得平均粒徑45~65nm PdKO. 1的HPV18 LlVLP蛋白質(zhì)液。
[0030] 另一方面，本發(fā)明還提供了 HPV Ll的五聚體、VLP和包括五聚體或VLP的疫苗組 合物在制備預(yù)防HPV感染的藥物中的應(yīng)用。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于注射或鼻腔 或口腔吸入或者陰道給藥，優(yōu)選注射劑和肌內(nèi)注射。
[0032] 本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)"是指由大腸桿菌(菌株）與載體組成，其中大 腸桿菌(菌株）來源于市場上可得到的，在此舉例但不限于：GI698, ER2566, BL21 (DE3)， XA90，DH(5a)、B834 (DE3)，BLR (DE3)。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"載體"一詞指的是，可將某編碼蛋白質(zhì)的多聚核苷酸插入其中 并使蛋白質(zhì)獲得表達(dá)的一種核酸運載工具。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使 其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。舉例來說，載體包括：質(zhì)粒；噬菌體；柯斯 質(zhì)粒等等。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"疫苗用賦形劑或載體"是指選自一種或多種，包括但不限于： PH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖 液，表面活性劑包括陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。舉例但不限于：聚山梨酯 80。佐劑舉例但不限于氫氧化鋁，磷酸鋁、氟氏完全佐劑、氟氏不完全佐劑等。離子強度增 強劑舉例但不限于氯化鈉。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"色譜"包括但不限于：離子交換色譜(例如陽離子交換色譜、陰 離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附色譜層析法(例如羥基磷灰石色譜)、分子篩色譜 層析(凝膠過濾或分子排阻層析)、親和色譜層析法。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的重組HPV Ll蛋白質(zhì)的方法中，緩沖液是指一種能在 加入少量酸或堿和水時大大降低pH變動幅度的溶液，包括但不限于Tris緩沖液，磷酸鹽緩 沖液，醋酸緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液，枸櫞酸緩沖液、組氨酸緩沖液，硼酸緩沖液 等。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞破碎包括但不限于通過勻漿器破碎、均質(zhì)機破碎、超聲波處 理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理中的一項或者多項方法來實現(xiàn)； 根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的重組HPV Ll蛋白質(zhì)的方法中，所用的鹽包括但不限于 是中性鹽，特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是 NaCI、KCl、CaC12、NH4Cl、KCI、NH4CI、MgS04、（NH4)2S04 中的一種或幾種。優(yōu)選 NaCI。所 用的還原劑包括但不限于DTT，2-巰基乙醇。所用量包括但不限于2mM~lOOmM，優(yōu)選10~ 15mM〇
[0038] 有益效果 本發(fā)明提供了一種合成基因，該基因序列是根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好進(jìn)行過密碼子 優(yōu)化的核苷酸序列，該序列編碼了 HPV Ll蛋白氨基酸序列。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核 酸序列相對于未經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸序列的LI蛋白的表達(dá)量有顯著提高。
[0039] 本發(fā)明公開的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、易于培養(yǎng)和操作以及生產(chǎn)成本 低等優(yōu)點。但是，僅僅使用該表達(dá)系統(tǒng)仍難以直接獲得大量可溶性的HPV Ll蛋白，其 原因在于Ll蛋白極容易形成包涵體，即無生物學(xué)活性的不溶性聚合體。此外，即使獲得 大量的包涵體，為了得到有生物學(xué)活性的蛋白，還必須對包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性處理， 這個過程往往損失大量的蛋白。為了解決這一難題，本發(fā)明采用融合技術(shù)，將Ll基因與 具有協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊的蛋白如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST)、SUM0、MBP、6*His- SUMO或 GST- SUMO等進(jìn)行融合表達(dá)，不僅蛋白的可溶性及收率有所提高，而且GST-SUM0-HPVL1， 6*His-SUM0-HPVLl使得在HPV Ll蛋白質(zhì)N端沒有外源氨基酸的殘留，同時發(fā)現(xiàn)其中的 GST-SUMO作為重組蛋白HPV Ll表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、顯著增 加重組蛋白表達(dá)量以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高可溶性等功能。因此本發(fā)明采用的技術(shù) 路線是在構(gòu)建HPV Ll蛋白表達(dá)載體時采用了標(biāo)簽蛋白融合技術(shù)，一方面通過標(biāo)簽蛋白與 Ll蛋白形成的融合蛋白來提高目的蛋白的可溶性、提高產(chǎn)量，另一方面通過GST融合標(biāo)簽 可以利用親和層析和蛋白水解酶切除融合質(zhì)標(biāo)簽方法進(jìn)行目的蛋白的純化特點，從而實現(xiàn) 了從種類繁雜的細(xì)胞裂解液中一步純化即可獲得純度達(dá)到70%以上的HPV Ll蛋白，大大提 高了純化效率，從而提高了終產(chǎn)物HPV Ll蛋白的產(chǎn)量。
[0040] 本發(fā)明提供的先表達(dá)、分離純化獲得高純度的HPV Ll五聚體蛋白后再人工控制組 裝形成VLP的技術(shù)路線，可以解決當(dāng)前公知技術(shù)存在的從雜蛋白種類繁多的細(xì)胞破碎液中 直接純化VLP純度低、降解比例高，收率低的問題，得到高純度五聚體體外組裝VLP及VLP 保存條件。
[0041] 另外，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)了一種新的組裝條件和方法：即低溫冷凍處理組 裝法。通過該方法得到的VLP可將凍融前組裝的粒徑不均一的蛋白質(zhì)（PdI大于0. 1)變成 粒徑大小符合理論預(yù)期而且均一的，PdI小于0. 1的VLP，對比現(xiàn)有技術(shù)得到的VLP更加穩(wěn) 定，并且可保存于不同鹽濃度、pH值范圍更廣泛的緩沖液中，更便于最終疫苗制劑的稀釋和 配制。
[0042] 本發(fā)明經(jīng)重組所得的HPV LI VLP蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)高滴度 的針對同型HPV的中和抗體，預(yù)防HPV對人體的感染，是一種良好的疫苗形式。
[0043] 在參考下列詳述和附圖后，本發(fā)明的這些和其它方面將是顯然的。此處公開的所 有參考文獻(xiàn)在此均完整引用作為參考。
【附圖說明】
[0044] 圖I :GST-HPV18 Ll蛋白質(zhì)親和與酶解后的SDS-PAGE凝膠電泳圖。M泳道為蛋白 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)泳道從上至下為：94kDa，66kDa，45kDa，33kDa，26kDa，20kdat，左泳道為親和吸附 GST-Ll的樹脂，右泳道為酶解后GST與LI的樹脂。
[0045] 圖2 :GST-SUM0-HPV18 Ll蛋白質(zhì)經(jīng)親和與酶解后的SDS-PAGE凝膠電泳圖。M泳 道為為蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（從上至下為：94kDa，66kDa, 45kDa, 33kDa, 26kDa, 20kda)，左泳道為親 和吸附GST-SUMO -LI的樹脂，右泳道為酶解后GST-SUMO與LI的樹脂。
[0046] 圖3 :MBP-HPV18 Ll蛋白質(zhì)經(jīng)親和與酶解后的SDS-PAGE凝膠電泳圖。M泳道為為 蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（從上至下為：94kDa，66kDa，45kDa，33kDa，26kDa，20kda)，左泳道為親和吸附 MBP -LI的樹脂，右泳道為酶解后MBP與LI的樹脂。
[0047] 圖4 : 6*HIS-SUM0-HPV18 Ll蛋白質(zhì)經(jīng)親和與酶解后的SDS-PAGE凝膠電泳圖。M 泳道為為蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（從上至下為：94kDa，66kDa, 45kDa, 33kDa, 26kDa, 20kda)，左泳道為 親和吸附6*HIS-SUM0 - LI的樹脂，右泳道為酶解后6*HIS-SUM0與LI的樹脂。通過凝膠 電泳圖顯示蛋白酶未切開帶有6*HIS-SUM0標(biāo)簽的溶合蛋白。
[0048] 圖5 :本發(fā)明經(jīng)過分子篩色譜純化后的重組HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠 電泳圖。M泳道為蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（從上至下為：94kDa，66kDa, 45kDa, 33kDa, 26kDa, 20kda)， 另一泳道為HPV LI蛋白。
[0049] 圖6 :HPV18 LI五聚體的動態(tài)光散射觀測結(jié)果。結(jié)果顯示五聚體的粒徑直徑為 13. 14nM，粒度分布 PdI 為 0. 030。
[0050] 圖7 : HPV18 LI VLP的動態(tài)光散射觀測結(jié)果。結(jié)果顯示VLP的粒徑直徑為61. 56 nM，粒度分布PdI為0.041。
[0051] 圖8 :HPV18 Ll五聚體蛋白的透射電鏡照片。
[0052] 圖9 :HPV18 LI VLP蛋白的透射電鏡照片。
[0053] 圖10 :HPV18 Ll五聚體蛋白質(zhì)的高壓液相分子篩色譜圖，圖中顯示經(jīng)高度純化的 Ll五聚體蛋白質(zhì)純度大于98%。