一種順式-3-羥基-l-脯氨酸羥化酶改造基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有高轉(zhuǎn)化率的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因及其應(yīng) 用，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 輕脯氨酸（Hydroxy proline, Hyp)不屬于20種常見氨基酸，是脯氨酸被輕化酶 羥基化修飾后的產(chǎn)物。羥基可加在第4位或者第3位碳上，形成3-羥脯氨酸（3-Hyp)和 4_羥脯氨酸（4-Hyp)。因脯氨酸3位和4位碳為非對(duì)稱手性碳原子，所以羥脯氨酸具有4 種立體異構(gòu)體：順式-3-羥脯氨酸、反式-3-羥脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸以及反式-4-羥 脯氨酸。天然羥脯氨酸大多存在于膠原蛋白中，對(duì)維持膠原蛋白三螺旋構(gòu)象穩(wěn)定性具有重 要作用。近年發(fā)現(xiàn)，具手型結(jié)構(gòu)的羥脯氨酸對(duì)一些手性藥物的合成具重要意義。研究報(bào)道 較多的為反式-4-羥基-L-脯氨酸，其已被證明是合成新一代培南類抗生素、抗腫瘤、抗高 血壓及新型胃藥等多種新創(chuàng)制藥物的重要原料。順式-3-羥基-L-脯氨酸也被研究發(fā)現(xiàn)可 作為合成一些藥物的中間成分，據(jù)報(bào)道，BMS-564929作為抗癌劑的雄激素受體調(diào)節(jié)劑正在 開發(fā)中，而其合成的關(guān)鍵手性中間體是順式-3-羥基-L-脯氨酸。這一發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)順 式-3-羥基-L-脯氨酸生產(chǎn)的高度重視。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，早期就有人開始嘗試用化學(xué)合成法 合成順式-3-L-羥脯氨酸，如John C.S.等（1963)報(bào)道過來自遠(yuǎn)霉素的順式和反式3-Hyp 的合成方法，之后Sengoda G. . (2006)以脯氨酸為底物，利用過氧化反應(yīng)生產(chǎn)3-Hyp，收率 為5%-6%。近年來，國(guó)內(nèi)外仍有人在不斷探索研究3-Hyp的合成方法，Kumar T.P.等（2012) 通過兩個(gè)關(guān)鍵步驟：非對(duì)稱性環(huán)氧化作用和還原環(huán)化作用合成3-Hyp和它的一些衍生物。 黃培強(qiáng)等曾報(bào)道過利用一種改進(jìn)的三步法來合成（2S, 3S) -3-hydroxyproline。但利用化 學(xué)合成方法來制備順式-3-羥脯氨酸并不是最佳的方法，其存在的缺點(diǎn)是：原料昂貴，反應(yīng) 工序長(zhǎng)，分離純化工序復(fù)雜，副產(chǎn)品多以及生產(chǎn)效率低等。隨著人們對(duì)微生物資源的研究 和開發(fā)，發(fā)現(xiàn)一些微生物具有順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶。1996森英郎等人從3000 多株微生物菌株中篩選出產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶的菌株，經(jīng)鑒定這些菌株分 別為鏈霉菌 THl strain TH1)，暗灰鏈霉菌 ATCC12646 和 ATCC12647 (5"ire/? ￡>6· caw?Λ? ATCC12646 and ATCC 12647 )，芽抱桿菌 TH2 和 TH3 6·/λ ΤΗ2 and ΤΗ3)。其中鏈霉菌THl含有的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶活性最高， 可特異催化L-脯氨酸生成順式-3-羥脯氨酸。隨后，他們將來自鏈霉菌THl的羥化酶基因 進(jìn)行克隆并重組到fecAericAia DHl進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示重組菌的酶活是原始菌株鏈 霉菌THl的5倍。為利用微生物轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸奠定了基礎(chǔ)。
[0003] 在此期間，日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社曾公開了一項(xiàng)專利《順式-3-羥基-L-脯 氨酸的制造方法》。該專利以L-脯氨酸為底物原料，通過發(fā)酵法，利用可產(chǎn)羥化酶的微生物 或者羥化酶的酶制劑作為催化劑，制備順式-3-羥基-L-脯氨酸。此外，該專利還公開了反 應(yīng)所需的最佳PH，最佳溫度及抑制劑等參數(shù)，但其所用的產(chǎn)酶微生物主要還是原始菌株鏈 霉菌THl。之后，該株式會(huì)社又公開一項(xiàng)《生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法》專利，此項(xiàng) 專利利用含有順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因的工程菌，宿主細(xì)胞主要是大腸桿菌，也 可以是酵母菌等，實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶，從而可以低成本地以工業(yè) 規(guī)模生產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸。順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶酶活是原始菌株鏈霉菌THl 的40-100倍。但是其在利用大腸桿菌工程菌菌體作為酶源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)，底物L(fēng)-脯氨 酸濃度為24mM，反應(yīng)60分鐘后，產(chǎn)物順式-3-羥基-L-脯氨酸的濃度為17. 7mM，底物濃度 低且轉(zhuǎn)化率不高，不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶的催化過程， 由下式給出：


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因序列，含改造 基因工程菌的培養(yǎng)誘導(dǎo)方法及生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種新的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因 序列，其改造后的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0006] 本發(fā)明還提供含有上述基因的載體及宿主細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明還提供含有上述基因的工程菌。
[0008] 本發(fā)明還提供上述順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶工程菌的培養(yǎng)方法和酶蛋白的 誘導(dǎo)條件。
[0009] 本發(fā)明還提供以工程菌菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的 生物轉(zhuǎn)化體系及條件。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： (1) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公開的來自5/7. strain THl的順式-3-輕 基-L-脯氨酸羥化酶的基因序列信息，依據(jù)大腸桿菌的密碼子頻率進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)化稀有密 碼子，獲得優(yōu)化后的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因（phy); (2) 將優(yōu)化后的基因 phy與表達(dá)載體連接，構(gòu)建含有順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶的 表達(dá)質(zhì)粒； (3) 將上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到工程菌中，誘導(dǎo)表達(dá)該酶蛋白； (4) 以工程菌菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源，以脯氨酸為主要底物，生產(chǎn)順式-3-羥 基-L-脯氨酸。
[0011] 制備方法的優(yōu)選條件：步驟（2)中所述的最優(yōu)表達(dá)載體為pET系列的pET-M-3C ; 步驟（3)中所述工程菌為大腸桿菌方.coJi BL21-CodonPlus (DE3)。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶優(yōu)化基因的工程菌的培養(yǎng) 誘導(dǎo)方法，如下：在LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD6。。為0. 6-0. 8時(shí)，加入0. 1-0. 5mM的IPTG， 于28°C誘導(dǎo)7-llh，收集菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了以上述工程菌為酶源，利用其表達(dá)的順式-3-羥基-L-脯氨 酸羥化酶生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸轉(zhuǎn)化條件如下：將菌體懸浮于轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中對(duì)L-脯 氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述菌體與轉(zhuǎn)化液的比例為lg: 10mL，轉(zhuǎn)化液包括：PIPES緩沖液100mM， L-脯氨酸200mM，α -酮戊二酸200mM，F(xiàn)