eSO4 6mM，L-抗壞血酸8mM和20mg/L的頭孢替安 (TTCT)抗生素所述轉(zhuǎn)化液，調(diào)節(jié)pH值為6. 5,反應(yīng)溫度為24-28°C，轉(zhuǎn)速為140rpm，時(shí)間為 60h〇
[0014] 本發(fā)明取得的有益效果：通過(guò)優(yōu)化順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因，構(gòu)建其工 程菌株，并誘導(dǎo)表達(dá)順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶蛋白，以菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源，催 化L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為順式-3-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率得到了很大提高，提高到90%，降低了 反應(yīng)產(chǎn)物中L-脯氨酸的量，有利于反應(yīng)產(chǎn)物順式-3-羥基-L-脯氨酸的純化分離，具有較 好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖 1:HPLC 檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均 為常規(guī)方法。
[0017] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018] 實(shí)施例1順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因優(yōu)化及工程菌株的構(gòu)建 (1)基因優(yōu)化 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的來(lái)自鏈霉菌THl 5/7. strain TH1)的順 式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶（GenBank ID :AF003371. 1)的基因序列按照以下原則進(jìn)行基 因優(yōu)化：①通過(guò)同義轉(zhuǎn)換，對(duì)稀有密碼子進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化；②使整個(gè)基因的GC含量在50%左 右。
[0019] (2)質(zhì)粒構(gòu)建 將優(yōu)化好的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因分別與表達(dá)載體pET-M-3C、 PET-32M-3C、pET-HGB-3C、pET-GST-3C、pET-MBP-3C相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至擴(kuò)增型大腸 桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆，分別獲得相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒pET-M-3C-Phy、pET-32M-3C-Phy、 pET-HGB-3C-Phy、pET-GST-3C-Phy、pET-MBP-3C-Phy。
[0020] 實(shí)施例2不同表達(dá)質(zhì)粒在宿主A coJi BL21-CodonPlus (DE3)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 將上述5種表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-CodonPlus (DE3)中，37°C、180rpm搖 培菌體（OD6。。達(dá)到0. 6-0. 8)，添加0. 1-0. 5mM的IPTG，28°C誘導(dǎo)表達(dá)7-llh，離心收集菌體， 稱取Ig菌體并重新懸浮于IOmL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中[含有200mM L-脯氨酸，200mM α -酮戊二 酸，6mMFeS04,8mM L-抗壞血酸，IOOmM PIPES緩沖液及20mg/L頭孢替安（TTCT)，調(diào)節(jié)pH值 為6. 5]，于28°C、HOrpm振蕩反應(yīng)60h，離心去除菌體，通過(guò)HPLC檢測(cè)上清中順式-3-羥 基-L-脯氨酸的生成情況，其轉(zhuǎn)化率如表1所示。其中含表達(dá)載體pET-M-3C-Phy菌株的轉(zhuǎn) 化率最高，為83.0% (表1)。
[0021] 表1不同表達(dá)載體在宿主A coh BL21-CodonPlus (DE3)中的轉(zhuǎn)化率
實(shí)施例3 重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶誘導(dǎo)表達(dá)條件及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化。
[0022] 將重組質(zhì)粒 pET-M-3C-Phy 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21-CodonPlus (DE3)中，37 °C、 180rpm搖菌（OD6。。達(dá)到0. 6-0. 8)，加入終濃度為0. 1-0. 5mM的誘導(dǎo)劑IPTG，28°C誘導(dǎo) 7h-llh，離心收集菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源，稱取Ig菌體重懸于轉(zhuǎn)化液[PIPES緩沖劑 IOOmM pH 6. 5, L-脯氨酸 200mM，α -酮戊二酸 200mM，F(xiàn)eS04 6mM，L-抗壞血酸 8mM，頭孢替 安（TTCT)20mg/L]中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為24°C-28°C，轉(zhuǎn)速為140 rpm，時(shí)間為60h。離心除去 菌體，經(jīng)HPLC檢測(cè)上清中順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成情況，工程菌將底物L(fēng)-脯氨酸轉(zhuǎn) 化為順式-3-羥基-L-脯氨酸的最高轉(zhuǎn)化率為90% (圖1)。
[0023] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因，其特征在于基因序列如SEQIDNo.I 所示。2. 含有權(quán)利要求1所述的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因的工程菌的構(gòu)建方 法，其特征在于：將所述改造基因構(gòu)建于表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；所述表達(dá)載體 為PET-M-3C，所述大腸桿菌為BL21-CodonPlus。3. 含有權(quán)利要求1所述的順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因的工程菌的培養(yǎng)方 法，其特征在于：在LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD6。。為0. 6-0. 8時(shí)，加入0. 1-0. 5mM的IPTG， 于28°C誘導(dǎo)7-llh，收集菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源。4. 含權(quán)利要求2所述工程菌菌體作為酶源生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化 體系及條件，其特征在于：以L-脯氨酸為底物；轉(zhuǎn)化液由PIPES100mM，L-脯氨酸200mM， a-酮戊二酸200mM，F(xiàn)eSO4 6mM，L-抗壞血酸8mM，頭孢替安（TTCT) 20mg/L組成，pH值為 6. 5 ;菌體與轉(zhuǎn)化液的比例為lg:IOmL;轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為24°C_28°C，轉(zhuǎn)速為140rpm，時(shí)間為 60h〇5. 權(quán)利要求1所述改造基因的應(yīng)用，其特征在于用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)順式-3-羥 基-L-脯氨酸。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因及其應(yīng)用。通過(guò)優(yōu)化鏈霉菌TH1(<i>Streptomyces？sp</i>.？strain？TH1)中順式-3-羥基-L-脯氨酸羥化酶（GenBank？ID：AF003371.1）的核苷酸序列，構(gòu)建優(yōu)化基因的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以L-脯氨酸為底物，以工程菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源，經(jīng)轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，生成順式-3-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%。本發(fā)用于生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/53, C12P13/24
【公開號(hào)】CN105177026
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張金秀, 王立安, 陳嬌嬌, 趙利維
【申請(qǐng)人】河北師范大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月22日