納米粒子重新懸浮在乙醇(80mL)含濃縮鹽酸(4mL，37%)中，在80°C下回流24h，通過10000轉(zhuǎn)離心3分鐘收集，用乙醇和蒸餾水洗滌三遍，納米粒子50°C下真空干燥過夜。其形貌通過TEANA1-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖1所示。其粒徑在80nm左右。
[0040]將上述制備得到的MSNs (50mg)溶于乙醇(20mL)與1.8mL的3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)混合溶液中在氮?dú)鈿夥障?0°C攪拌24h。然后，顆粒通過離心收集(10000轉(zhuǎn)，5min)，得到巰基化介孔二氧化硅(MSNs-SH)。將巰基化的介孔二氧化硅(MSNs-SH) (60mg)重新分散在5mL甲醇(含0.1g 2，2- 二硫代二吡啶)中，混合物在室溫下攪拌24h，納米粒子通過離心收集，用乙醇和水洗滌三遍，在50°C下真空干燥過夜，得到二硫鍵修飾的介孔二氧化娃納米粒子。
[0041]配制lg/L的阿霉素水溶液，將上述二硫鍵修飾的介孔二氧化硅納米粒子(50mg)分散到溶液中，超聲12h，顆粒通過離心收集(10000轉(zhuǎn)，5min)。同時(shí)，將巰基修飾的siRNA (上海吉馬生物有限公司)與二硫蘇糖醇(DTT)孵育2h，斷掉siRNA之間形成的二硫鍵，然后過量的DTT采用葡聚糖柱脫去。將負(fù)載阿霉素的納米粒子重新懸浮在PBS緩沖液(pH 7.4)，在4°C孵育2倍當(dāng)量siRNA-SH 48h，在10000轉(zhuǎn)離心5分鐘收集，得到功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料。其形貌通過TEANA1-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖2所示。其粒徑在10nm左右，仍保持介孔二氧化硅的一些特征，例如孔狀結(jié)構(gòu)和球形形貌。
[0042]實(shí)施例2:功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料作為抗癌藥物的體外實(shí)驗(yàn)
[0043]本實(shí)驗(yàn)選擇人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7，賽齊(上海)生物工程有限公司)作為功能化介孔二氧化硅載藥體系抗癌實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
[0044]MTT測(cè)試方法:用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞5分鐘，用吸管輕輕吹打細(xì)胞成懸浮液裝置離心管中細(xì)胞懸液，取10 μ L細(xì)胞懸浮液用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞濃度為5 XlOVmL加于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ L，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度實(shí)施例1制備得到的復(fù)合材料，置于37°C，體積分?jǐn)?shù)為5 % 0)2培養(yǎng)24小時(shí)。在結(jié)束前4個(gè)小時(shí)加入MTT 20 μ L/孔，4小時(shí)后棄去上清液，加入DMSO 100 μ L/孔，振蕩15分鐘左右，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為450nm。按下列公式計(jì)算存活率，評(píng)價(jià)藥物殺死癌細(xì)胞效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
[0045]存活率% =加藥孔平均OD值/對(duì)照孔平均OD值X 100 %
[0046]實(shí)施例3:功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料在細(xì)胞內(nèi)藥物富集作用
[0047]將處于對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞用0.25 %的胰酶消化細(xì)胞3?5min后，離心分離后，用培養(yǎng)基將其混勻，接種IX 14個(gè)細(xì)胞于激光共聚焦皿的小凹槽中，Ih后再加入2mL的培養(yǎng)液，5% CO2, 370C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。分別加入實(shí)施例1制備得到的復(fù)合材料10 μ g/mL和相當(dāng)量的阿霉素處理細(xì)胞Ih和3h。隨后吸去皿中的培養(yǎng)基，然后用PBS沖洗三遍后，再加入ImL的PBS浸潤(rùn)細(xì)胞，采用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。如圖4所示，相較于游離的阿霉素，本發(fā)明復(fù)合材料中的阿霉素能夠明顯提尚阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的富集量，同時(shí)在細(xì)胞核區(qū)域的富集量也明顯提高，這正是阿霉素發(fā)揮藥效的區(qū)域。
[0048]實(shí)施例4:功能化介孔二氧化硅負(fù)載siRNA的復(fù)合材料沉默基因表達(dá)的效率
[0049]將處于對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞用0.25 %的胰酶消化細(xì)胞3?5min后，離心分離后，用培養(yǎng)基將其混勻，調(diào)整活細(xì)胞濃度為5X 103/mL加于6孔板中，5% CO2, 37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入各種藥物孵育24h后，直接在冰上用RIPA裂解液(含PMSF)將細(xì)胞裂解，冰上放置30min后，12000rpm，4°C，1min離心后吸取上清?？偟鞍子肂CA試劑盒進(jìn)行定量后，取1.5mL總蛋白與上樣緩沖液一起煮沸5min，然后凍存于-80°C，用于western blot。Western blot簡(jiǎn)要如下:將蛋白上樣至SDS聚丙稀酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白。其中分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%。然后將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，轉(zhuǎn)膜條件為恒流250mA，2h。進(jìn)而將膜在TBST中清洗3次，每次5min。然后加入5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉lh。將膜與一抗4°C解育過夜，經(jīng)過TBST清洗3次，每次lOmin。然后將膜與HRP標(biāo)記二抗室溫孵育lh，經(jīng)過TBST洗漆3次，每次1min后，進(jìn)行ECL顯色。如圖5所示，功能化介孔二氧化硅負(fù)載的siRNA能使得siRNA進(jìn)入癌細(xì)胞，克服siRNA治療的缺點(diǎn)。相較于其他對(duì)照組，納米負(fù)載的siRNA具有更好的沉默目的基因Bcl-2表達(dá)的效果；同時(shí)，Bcl-2表達(dá)通路的相關(guān)蛋白pro-caspase-9的表達(dá)也受到影響，進(jìn)一步表明功能化介孔二氧化娃載藥體系具有很好的沉默靶向基因的效果。
[0050]其中，MSNs-SS-NCsiRNA為介孔二氧化硅負(fù)載亂序siRNA，其制備方法為:將亂序的siRNA (上海吉馬生物有限公司)與二硫蘇糖醇(DTT)孵育2h，斷掉siRNA之間形成的二硫鍵，然后過量的DTT采用葡聚糖柱脫去。將實(shí)施例1制備得到的二硫鍵修飾的介孔二氧化硅納米粒子(50mg)懸浮在PBS緩沖液(pH 7.4)，在4°C孵育2倍當(dāng)量上述處理后的siRNA48h，在10000轉(zhuǎn)離心5分鐘收集，得到介孔二氧化硅負(fù)載亂序siRNA。由于該siRNA為亂序的，其不能對(duì)靶向沉默相應(yīng)基因，因此不具備活性。
[0051]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和SiRNA的復(fù)合材料，其特征在于由包括以下步驟的方法制備得到: 將介孔二氧化硅加入3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液中，加熱反應(yīng)，分離，得到巰基化介孔二氧化硅，將其分散到2，2- 二硫二吡啶溶液中，加熱反應(yīng)，得到二硫鍵修飾的介孔二氧化硅，將其加入阿霉素水溶液中，再加入巰基化的siRNA，分離，得到功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所用3-巰丙基三甲氧基硅烷和介孔二氧化硅中硅元素的摩爾比為2:1?4:1。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所用2，2- 二硫二吡啶與巰基化介孔二氧化硅中硫元素的摩爾比為2:1?1:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所用siRNA與二硫鍵修飾的介孔二氧化硅中硫元素的摩爾比為1:2?1:1。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所述阿霉素水溶液的濃度為0.8?lg/L。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所述的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液的濃度為I?1.2Mol/L07.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所述2，2- 二硫二吡啶溶液的濃度為0.1?0.12Mol/L08.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所述的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液為3-巰丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液；所述的2，2- 二硫二吡啶溶液為2，2- 二硫二吡啶乙醇溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，其特征在于:所述的加熱反應(yīng)均在80?83°C下反應(yīng)12?24h。10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項(xiàng)所述的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和SiRNA的復(fù)合材料在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于功能材料負(fù)載藥物和基因技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料及其制備方法和在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。該復(fù)合材料由包括以下步驟的方法制備得到：將介孔二氧化硅加入3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液中，加熱反應(yīng)，分離，得到巰基化介孔二氧化硅，將其分散到2,2-二硫二吡啶溶液中，加熱反應(yīng)，得到二硫鍵修飾的介孔二氧化硅，將其加入阿霉素水溶液中，再加入巰基化的siRNA，分離，得到功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料。本發(fā)明的復(fù)合材料應(yīng)用于制備抗癌藥物中，能將藥物負(fù)載到細(xì)胞內(nèi)，顯著提高藥物在細(xì)胞內(nèi)的富集量，并起到很好封堵介孔作用，在細(xì)胞內(nèi)釋放起到沉默基因的效果。
【IPC分類】A61K47/04, A61K47/48, A61K31/704, A61K48/00, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105056239
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510477650
【發(fā)明人】劉杰, 曹成文, 趙爽
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月6日