功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料及其制備和在制備抗癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能材料負(fù)載藥物和基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和SiRNA的復(fù)合材料及其制備方法和在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來國內(nèi)抗癌市場呈日益增長的態(tài)勢，在醫(yī)院用藥中抗癌藥物已經(jīng)躍進(jìn)第二位，僅低于抗感染藥。目前，治療癌癥的手段主要包括外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療，但是這些治療方法在殺死癌細(xì)胞的同時又易損傷正常細(xì)胞和免疫細(xì)胞，缺乏選擇性，而且導(dǎo)致一系列的毒副作用，有些較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)還會威脅到患者的生命。
[0003]目前，局部和擴(kuò)散型癌癥的治療主要依賴化療。然而，治療癌癥所用化療藥物普遍存在如下局限:(I)缺少靶向性:通常使用的抗癌藥物具有普遍的細(xì)胞毒性，缺乏對癌細(xì)胞的選擇性和靶向性，導(dǎo)致正常細(xì)胞也存在非特異性內(nèi)吞，損壞正常細(xì)胞的增殖，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，因此藥物表現(xiàn)出治療指數(shù)低、療效不明顯等缺點(diǎn)；(2)多藥耐藥性:多藥耐藥性使進(jìn)入癌細(xì)胞中的抗癌藥物不斷地栗出細(xì)胞，增加了栗出量，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物減少，降低了抗癌藥物對癌細(xì)胞的作用；(3)生物利用率低:大部分抗癌藥物具有很好的抑制癌細(xì)胞的作用，但較低的生物利用率很大程度上影響了藥物的臨床效果。
[0004]由于載藥量高，生物作用強(qiáng)，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞從而避免多藥耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，近年來納米藥物輸送體系，尤其是納米靶向藥物輸送體系的發(fā)展為癌癥的治療提供了一種很有前景的途徑。理想的納米靶向藥物輸送體系應(yīng)具備:(I)材料表面易功能化；(2)高的細(xì)胞特異性和有效的細(xì)胞內(nèi)吞；(3)低的早期滲漏和持續(xù)可控釋放的能力；(4)載體自身低毒或生物相容性好；(5)藥物可裝載到載體中且受載體保護(hù)；(6)載體在生理介質(zhì)中具有好的分散性；(7)載體對蛋白吸附很少，不會影響靶向配體對靶向受體的作用；(8)載體不會在腎、肝等器官積聚，而會逐漸分解代謝。目前應(yīng)用于納米靶向藥物輸送體系的包括微乳、聚合物膠束、脂質(zhì)體及囊泡等，在溫度、PH等外部刺激下結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而實現(xiàn)藥物可控釋放。由于它們都屬于軟材料范疇，在水相媒介中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，無法阻止靶向前藥物滲漏，導(dǎo)致無法實現(xiàn)有效的輸送和可控釋放。因此近年人們在使用結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的材料用于藥物輸送和釋放方面開展了許多研究。在這些材料中，硅材料由于生物相容性好、結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)穩(wěn)定而被用于各種藥物的輸送和控釋研究。另外，硅也被用于增加磁性納米粒子、聚合物等其他輸送載體的生物相容性。在硅材料家族中，介孔二氧化硅已發(fā)展成為最重要和最有前景的一類藥物輸送載體。
[0005]siRNA是一段特定序列的核糖核苷酸，可以在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后沉默相應(yīng)基因的表達(dá)，達(dá)到基因干擾的效果(RNAi)。然而，以往的報道表明游離的siRNA無法進(jìn)入細(xì)胞中，需要進(jìn)行化學(xué)修飾或者納米顆粒負(fù)載才能有效進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。
[0006]阿霉素(Dox)是一種高效的殺死癌細(xì)胞的抗生素，目前廣泛用于癌癥的治療中。但由于不具有選擇性，在癌癥治療中較大的副作用抑制了其應(yīng)用。本發(fā)明利用介孔二氧化硅塑封Dox，并使用其他物質(zhì)進(jìn)行介孔封堵可以有效的將Dox負(fù)載，利用EPR效應(yīng)將載藥體系富集到癌區(qū)域引起細(xì)胞內(nèi)吞，在細(xì)胞內(nèi)藥物釋放達(dá)到最好的抗癌效果并最小化副作用。將Dox塑封到介孔二氧化硅中后，利用二硫鍵在介孔二氧化硅表面連接siRNA，利用空間效應(yīng)封堵介孔，形成功能介孔二氧化硅載藥體系。至今未發(fā)現(xiàn)有本發(fā)明的功能化介孔二氧化硅載藥體系用于癌癥治療的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料。
[0008]本發(fā)明另一目的在于提供一種上述功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料的制備方法。
[0009]本發(fā)明再一目的在于提供上述功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn):
[0011]—種功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料，由包括以下步驟的方法制備得到:
[0012]將介孔二氧化硅加入3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液中，加熱反應(yīng)，分離，得到巰基化介孔二氧化硅，將其分散到2，2- 二硫二吡啶溶液中，加熱反應(yīng)，得到二硫鍵修飾的介孔二氧化硅，將其加入阿霉素水溶液中，再加入巰基化的siRNA，分離，得到功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料。
[0013]所用3-巰丙基三甲氧基硅烷和介孔二氧化硅中硅元素的摩爾比優(yōu)選為2:1?4:10
[0014]所用2，2-二硫二吡啶與巰基化介孔二氧化硅中硫元素的摩爾比優(yōu)選為2:1?1:1。
[0015]所用siRNA與二硫鍵修飾的介孔二氧化硅中硫元素的摩爾比優(yōu)選為1:2?1:1。
[0016]所述阿霉素水溶液的濃度優(yōu)選為0.8?lg/L。
[0017]所述的介孔二氧化硅為采用標(biāo)準(zhǔn)法制備得到的介孔二氧化硅即可。
[0018]所述的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液的濃度優(yōu)選為I?1.2Mol/L0
[0019]所述的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液優(yōu)選為3-巰丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液。
[0020]所述2，2- 二硫二吡啶溶液的濃度優(yōu)選為0.1?0.12Mol/L0
[0021]所述的2，2- 二硫二吡啶溶液優(yōu)選為2，2- 二硫二吡啶乙醇溶液。
[0022]所述的加熱反應(yīng)均優(yōu)選在80?83°C下反應(yīng)12?24h。
[0023]所述分離得到的產(chǎn)物優(yōu)選使用去離子水洗滌并于真空50°C干燥。
[0024]上述本發(fā)明制備得到的功能化介孔二氧化娃負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料具有優(yōu)異的殺死癌細(xì)胞的生物活性，可應(yīng)用于制備抗癌藥物中。
[0025]本發(fā)明的機(jī)理為:
[0026]本發(fā)明的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料以負(fù)載藥物作用的介孔二氧化娃為核，表面通過二硫鍵連接siRNA進(jìn)行介孔封堵，同時起到負(fù)載藥物和siRNA的作用。本發(fā)明的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料能夠很好的將藥物負(fù)載進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，顯著提高藥物在細(xì)胞內(nèi)的富集量。并且，復(fù)合材料中共價鍵連接siRNA能夠很好起到封堵介孔作用并能在細(xì)胞內(nèi)釋放起到沉默基因的效果。本發(fā)明的制備方法簡單，得到的材料可直接保存和使用。
[0027]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0028](I)本發(fā)明的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料不僅具有殺死癌細(xì)胞的作用，而且具有引起癌細(xì)胞凋亡的作用，適用于制備抑制癌細(xì)胞藥物。
[0029](2)本發(fā)明的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料利用二硫鍵連接siRNA在介孔二氧化硅起到了封堵介孔的作用。在細(xì)胞攝取后可以對癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)谷胱甘肽響應(yīng)引起二硫鍵斷裂同時釋放出阿霉素和siRNA。
[0030](3)本發(fā)明的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料可以顯著提高阿霉素在細(xì)胞的累積，尤其是在細(xì)胞核區(qū)域的富集。共價結(jié)合siRNA可以顯著提高基因沉默效率，達(dá)到沉默靶向基因的效果。
【附圖說明】
[0031]圖1是實施例1的介孔二氧化硅的透視電鏡(TEM)圖。
[0032]圖2是實施例1的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料的透視電鏡(TEM)圖。
[0033]圖3是實施例3的功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料細(xì)胞毒性圖。其中，MSNs-SS-Py為功能化的介孔二氧化硅，DOX為阿霉素，MSNsODOX為負(fù)載阿霉素的功能化介孔二氧化硅，MSNs-SS-siRNAiDOX為負(fù)載阿霉素和siRNA的復(fù)合材料。
[0034]圖4是功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料在細(xì)胞內(nèi)藥物富集圖。其中，F(xiàn)ree DOX為游離阿霉素，MSNs-SS-s iRNAiDOX為負(fù)載阿霉素和siRNA的復(fù)合材料。
[0035]圖5是功能化介孔二氧化硅負(fù)載siRNA的復(fù)合材料沉默基因表達(dá)的效果圖。其中，MSNs為介孔二氧化硅，MSNs-SS-siRNA為介孔二氧化硅負(fù)載siRNA，MSNs-SS-NCsiRNA為介孔二氧化娃負(fù)載亂序siRNA，F(xiàn)ree siRNA為游離siRNA，Lipo2000+siRNA為商業(yè)用脂質(zhì)體2000負(fù)載siRNA，作為陽性對照。
【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0037]本發(fā)明所用原料的純度只要達(dá)到化學(xué)純以上即可，來源均可從市場購得。
[0038]實施例1:功能化介孔二氧化硅負(fù)載藥物和siRNA的復(fù)合材料的制備
[0039]介孔二氧化硅(MSNs)的制備:將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，500mg)溶解在蒸餾水(250mL)，然后加入NaOH水溶液(1.75mL，2Mol/L)，混合溶液在劇烈攪拌下加熱到80°C。當(dāng)溫度穩(wěn)定后，將正硅酸乙酯(TE0S，2mL)緩慢加入混合溶液。2h后納米粒子通過10000轉(zhuǎn)離心3分鐘收集，用乙醇和蒸餾水洗滌三遍。為除去模板劑，收集的