明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。
[0038]當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
[0039]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Samb10k等 MOLEC μ LAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edit1n，Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edit1n,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLEC μ LAR B1LOGY, John ffiley&Sons, New York,1987and per1dic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCT1N, Third edit1n， Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSIN ENZYM0L0GY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.)，AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLEC μ LAR B1LOGY, Vol.119, ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0040]實施例lmiR_148b在腎癌組織和腎癌細胞中均呈低表達
[0041]我們首先分析了 miR_148b在腎癌組織和兩種腎癌細胞中的表達情況。如圖1，在12個病人的腎癌組織中相對于相鄰的癌旁組織中miR-148b的表達是下調(diào)的。如圖2，在786-0和0S-RC-2兩種腎癌細胞中相對于人胚腎293T細胞，miR_148b的表達也是下調(diào)的。
[0042]實施例2在腎癌細胞中miR-148b通過調(diào)控MAP3K9下調(diào)MAPK/JNK信號通路
[0043]同時作為陰性對照，我們也轉(zhuǎn)染了 negative control mimics。
[0044]為了找出腎細胞癌中miR_148b相關(guān)的信號通路，我們利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測了 miR-148b對腫瘤相關(guān)信號通路(包括Wnt，TGF-f3，MAPK)的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b下調(diào)了 MAPK信號通路最為明顯(圖3)。為進一步探索miR_148b調(diào)控MAPK信號通路的機制，我們通過TargetScan，Microrna網(wǎng)站預(yù)測到MAPK/JNK信號通路的上游激活因子MAP3K9與miR-148b有潛在的靶向作用，且MAP3K93’ UTR與miR_148b作用的靶位點不同物種間高度保守(圖4)。我們利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測該靶位點是否具有功能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR_148b可以通過結(jié)合MAP3K93’UTR下調(diào)Luciferase的表達(圖5)。通過在腎癌細胞中轉(zhuǎn)hsa-miR-148b_3p mimics來過表達miR_148b，我們發(fā)現(xiàn)miR_148b不影響MAP3K9mRNA水平的轉(zhuǎn)錄，只能下調(diào)MAP3K9蛋白水平的表達(圖6和圖7)。接著，為驗證miR-148b是否靶向MAP3K9調(diào)控其下游的JNK信號通路，我們過表達miR_148b檢測MAPK/JNK信號通路中的激活因子——磷酸化JNK(pJNK)的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-148b過表達后PJNK表達下調(diào)(圖8)，提示miR-148b可能通過直接調(diào)控MAP3K9而下調(diào)MAPK/JNK信號通路來影響細胞的增殖與凋亡，使腎癌細胞達到一個平衡的狀態(tài)。
[0045]實施例3檢測腎癌組織中miR-148b調(diào)控的MAP3K9以及pJNK的表達情況
[0046]為了檢測在腎癌病人的組織標本中miR-148b與靶基因MAP3K9，MAPK/JNK信號通路中是否存在負相關(guān)，我們收集了 5個腎細胞癌病人的腎癌組織和癌旁組織，檢測組織標本中MAP3K9和MAPK/JNK信號通路中的激活因子pJNK的蛋白水平變化。如圖9，與癌旁組織相比，病人腎癌組織中的MAP3K9的表達量有三例是增高的，pJNK的表達有四例是增高的。這些結(jié)果提示在病人標本中的miR-148b與MAP3K9，pJNK可能存在著和腎癌細胞中相同的負相關(guān)。
[0047]以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應(yīng)當理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.分離的miR-148b基因在制備或篩選抑制MAPK/JNK信號通路的藥物或制劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述MAPK/JNK信號通路是腎癌細胞或腎癌組織中的MAPK/JNK信號通路。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物或制劑通過過表達miR-148b而起到抑制MAPK/JNK信號通路的作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述miR-148b通過靶向作用于MAP3K9而起到抑制MAPK/JNK信號通路的作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述miR-148b通過與MAP3K93’UTR結(jié)合而靶向作用于MAP3K9。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述miR-148b通過下調(diào)MAP3K9蛋白表達水平而起到抑制MAPK/JNK信號通路的作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述miR-148b通過下調(diào)磷酸化JNK表達水平而起到抑制MAPK/JNK信號通路的作用。
8.一種抑制MAPK/JNK信號通路的藥物或制劑，其特征在于，所述藥物或制劑通過分離的miR-148b基因制備或篩選獲得，所述藥物或制劑含有有效量的過表達miR-148b的藥效成分。
9.一種抑制腎癌組織或腎癌細胞中MAPK/JNK信號通路的方法，為向腎癌組織或腎癌細胞中過表達miR-148b。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法在腎癌治療藥物研宄中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及miR-148b的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明首次揭示了miR-148b在腎細胞癌中低表達，在腎癌組織或腎癌細胞中過表達miR-148b能夠通過抑制MAP3K9而有效下調(diào)MAPK/JNK信號通路，為進一步研究腎癌的發(fā)病機制以及miR-148b基因的功能提供了新的手段。
【IPC分類】A61P35-00, C12Q1-68, A61K45-00
【公開號】CN104826112
【申請?zhí)枴緾N201510273861
【發(fā)明人】陳婷梅, 周欽, 聶芳
【申請人】重慶醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月26日