淫羊藿破壁飲片的指紋圖譜共有模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥飲片的建立檢測方法，尤其是淫羊藿破壁飲片HPLC指紋圖譜共 有模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimediumbrevicornu Maxim、箭葉淫羊藿 Epimediumsagittatum(Sie. et Zucc.)、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或卓月鮮 淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉。本發(fā)明中的淫羊藿針對小檗科植物淫羊藿 Epimediumbrevicornu Maxim品種。
[0003] 主要成分為黃酮、木脂素、生物堿和多糖。黃酮類成分主要有：淫羊藿苷，朝藿定 A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、II，淫羊藿次苷I、II，大花淫羊藿苷A，鼠李糖基淫羊藿次 苷II，箭藿苷A、B、C和金絲桃苷等。
[0004]中藥破壁飲片是利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片進行破細胞壁粉碎成粒度分 布D90小于45ym的微細顆粒，再制成30~100目的顆粒。相對于傳統(tǒng)飲片具有色澤一致， 質(zhì)量均一，穩(wěn)定性好的特點為創(chuàng)新型中藥飲片。由于中藥破壁飲片不具傳統(tǒng)中藥飲片的形 態(tài)特征，破壁后會帶來有效成分或指標成分等化學成分的溶出度變化，使傳統(tǒng)飲片的鑒別、 質(zhì)量檢測方法不能完全適用。因此，必須針對中藥破壁飲片建立專屬性強，全面反映中藥破 壁飲片質(zhì)量狀況的檢測方法。而建立一項新的質(zhì)量檢測方法并非易事，例如檢測條件、對 照品的選擇和供試品的制備方法等均需要研宄考量并進行驗證。雖然現(xiàn)有技術(shù)中有涉及中 藥指紋圖譜的檢測方法，但并無針對形態(tài)特殊的中藥破壁飲片的方法，且存在專屬性、穩(wěn)定 性、重現(xiàn)性和精密度差缺陷，不能全面反應(yīng)飲片質(zhì)量的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種淫羊藿破壁飲片HPLC標準指紋圖譜的構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方 法。
[0006] 淫羊藿破壁飲片HPLC標準指紋圖譜的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0007] (1)供試品溶液的制備：精密稱定淫羊藿破壁飲片0. 200g，加入50%稀乙醇20mL， 超聲提取3〇111；[11，冷卻至室溫，12001'/111；[11離心5111；[11，上清液傾入201111量瓶中，加50%稀乙 醇稀釋并定容至20ml，搖勻，0.22um微孔濾膜過濾備用；
[0008] (2)對照品配制：精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇溶解配制成濃度分別為 0? 116mg/ml的混合對照品溶液；
[0009] (3)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜 柱，以乙腈為流動相A，水溶液為流動相B，梯度洗脫：0min-20min-28min-60min，流動相 A:20% -27% -27% -50%;柱溫為35°C ;檢測波長為272nm ;流速：0? 8mL/min ;
[0010] (4)測定法：精密吸取供試品溶液20yl，對照品10ul注入色譜儀，測定，記錄圖 譜，即得；
[0011] (5)按上述供試品溶液及對照品的制備方法及和色譜條件對10批以上的淫羊霍 破壁飲片樣品進行HPLC分析，得到相應(yīng)指紋圖譜；以淫羊藿苷峰為參照峰，計算各指紋圖 譜中主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積；輸入指紋圖譜分析軟件，對各批次樣品指 紋圖譜進行相似度比較，以平均譜圖為共有模式，計算相似度，建立淫羊藿破壁飲片指紋圖 譜共有模式標準圖譜如圖3所示，包括16個特征峰。
[0012] 淫羊藿破壁飲片的質(zhì)量檢測方法包括以下步驟：
[0013] (1)按上述標準圖譜構(gòu)建方法中步驟（1)和步驟（2)分別制備待測樣品供試品溶 液和對照品溶液，按步驟（3)的色譜條件，精密吸取待測樣品供試品溶液20yl，淫羊藿苷 對照品10ul，注入HPLC色譜儀，測定，記錄色譜，即得；
[0014] (2)合格指標的建立及指定圖譜、判斷方法：供試品色譜中，應(yīng)呈現(xiàn)16個與圖 3-淫羊藿破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式相對應(yīng)的特征峰。按中藥色譜指紋圖譜相似度 評價系統(tǒng)計算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不得低于〇. 90。以淫羊藿苷峰為 對照峰，其余15個共有指紋峰的相對保留時間分別為0. 248、0. 507、0. 691、0. 772、0. 829、 0? 875、0. 931、0. 966、1. 128、、1. 262、1. 458、1. 652、1. 667、1. 781、1. 832,各峰相對保留時間 RSD彡±5%，為合格品。
[0015] 本發(fā)明是首次針對淫羊藿破壁飲片質(zhì)量控制所構(gòu)建的HPLC指紋圖譜共有模式標 準圖譜及質(zhì)量檢測方法。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)不能完全適用淫羊藿破壁飲片質(zhì)量控制的 缺陷。該圖譜較全面涵蓋了淫羊藿飲片主要活性成分的圖譜信息，專屬性明顯優(yōu)于現(xiàn)有的 同類指紋圖譜方法。經(jīng)試驗驗證該方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和精密度均達到法定要求，且操作 簡單，檢測快速準確；并能有效控制淫羊藿藥材、破壁粉體、破壁飲片整體質(zhì)量。
【附圖說明】
[0016] 圖1是淫羊藿破壁飲片指紋圖譜柱子適用性考察譜圖。
[0017] 圖2是淫羊藿破壁飲片專屬性考察。
[0018] 圖3是本發(fā)明淫羊藿破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式標準圖譜。
【具體實施方式】
[0019] 一、淫羊藿破壁飲片HPLC標準指紋圖譜的構(gòu)建。
[0020] 本發(fā)明以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷B、淫羊藿次苷I、淫羊藿 次苷II、綠原酸8個主要活性成分為目標，建立能較全面反映淫羊藿破壁飲片成分信息，同 時能測定淫羊藿苷含量的標準指紋圖譜。
[0021] 1儀器與試藥
[0022] 1. 1 儀器
[0023] 安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀（配有G1315C型號DAD檢測器、G4218A的ELSD 蒸發(fā)光檢測器、G1312B二元泵、G1329B自動進樣器、G1322A脫氣機、G1316B柱溫箱，Agilent Chemstation色譜工作站）、萬分之一電子分析天平、十萬分之一電子分析天平、高功率數(shù) 控超聲清洗儀等
[0024] 1. 2 試藥
[0025]試劑：甲醇（瑞典進口Oceanpak色譜溶劑），乙腈（安徽時聯(lián)特種溶劑公司色譜 純），雙蒸水、磷酸、甲醇（分析純）。淫羊藿苷對照品（110737-201312)。
[0026] 供試品：淫羊藿破壁飲片、淫羊藿破壁粉體、淫羊藿原料藥材（均由中山中智藥業(yè) 集團提供）
[0027] 2實驗方法
[0028] 2. 1預試驗
[0029] 中智淫羊藿破壁飲片主要采用小檗科淫羊藿屬淫羊藿藥材經(jīng)過超微粉碎加工而 制成。本研宄在參考公司內(nèi)部非公開文獻的基礎(chǔ)上，專門針對淫羊藿破壁飲片，擬定以下幾 個方案進行預實驗。
[0030] 2. 1. 1 預實驗 1
[0031] 樣品制備：精確稱取0. 2001g淫羊藿破壁飲片（14040101批次），于50ml具塞錐 形瓶中，加入20ml70%的乙醇溶液，浸潤30min，稱定重量，超聲30min，取出，冷卻至室溫， 用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，粗濾，〇. 22um微孔濾膜過濾備用。
[0032] 色譜條件 1:agilentzorbaxSBC18 (4. 6mmX250mm，5um)色譜柱，柱溫 30°C， 流速lml/min，檢測波長268nm、270nm、272nm、280nm，流動相：乙腈-水，預梯度1洗脫： 0min-30min-60min,乙腈變化為：5% -100% -5%，進樣量為 10ul。
[0033] 色譜條件 2:agilentzorbaxSBC18 (4. 6mmX250mm，5um)色譜柱，柱溫 30°C， 流速lml/min，檢測波長268nm、270nm、272nm、280nm，流動相：乙腈-水，預梯度2洗脫： 0min_60min，乙腈變化為：5% -100%，進樣量為10ul。