專利名稱:一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術領域：
，特別涉及一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，該方法將菊花的莖段外植體培養(yǎng)成為無菌苗后，再取葉盤外植體于誘導培養(yǎng)基，進行體細胞胚誘導培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚。
背景技術：
菊花是中國的傳統(tǒng)名花之一，在中國已有兩千多年的栽培歷史；同時也是世界重要的四大鮮切花之一。切花菊‘神馬’ iChrysanthemum morifolium Tzvel.)是1987年在日本靜R縣濱松市特種園藝所培育成功的白色秋菊品種，從每年10月到次年5月一直在日本白菊市場上占有主導地位(邱美歡等，2008)?！耨R’的再生頻率比較低，徐清燏(2005)用‘神馬’葉片做外植體，不定芽誘導率為18.5%。孫慶春(2009)研究‘神馬’葉片再生頻率達到61.7%，再生頻率依然不高。
植物體細胞胚發(fā)生是植物界存在的一種普遍現(xiàn)象。植物體細胞胚發(fā)生(somaticembryogenesis)是指體細胞在特定條件下,未經(jīng)性細胞融合而通過與合子胚類似的發(fā)育途徑形成新個體的形態(tài)發(fā)生過程。經(jīng)體細胞胚發(fā)生過程形成的類似合子胚的結構稱為胚狀體或體細胞胚。近年來關于觀賞花的體細胞胚的研究比較多，在牡丹(周仁超等2001 ;周秀梅等2008 ；Bouza等1994)，月季(郭麗娟等2007 ；Dohm等2001 ；Kim等2003)，仙客來(卞?；?2008 ；Takejiro 等 1995 ；Traud 等 2005)，梅花(寧國貴等 2010 ；Cheong 等 2004 ；Tanaka等2000)，地被菊(蔣細旺等2007 ;蔣細旺等2008)等花卉品種已有報道。但是，國內外文獻中尚無關于切花菊‘神馬’體細胞胚的研究的報道。高效‘神馬’體細胞胚再生技術的建立是通過轉基因技術改良‘神馬’花卉品質的基礎。
中國專利申請《一種誘導菊花體細胞胚間接發(fā)生的方法》(申請?zhí)?201010267217.0,公開號:CN101983555A)公開了一種誘導菊花體細胞胚間接發(fā)生的方法，該方法包括從外植體中誘導出胚性愈傷組織，再將其連續(xù)轉接到兩種不同的培養(yǎng)基中誘導體細胞胚的間接分化，得到菊花穩(wěn)定的再生植株；該方法應用的菊花品種為“玉人面”、“鋪地金”、“紫研”。該方法采用兩種不同的培養(yǎng)基誘導體細胞胚的間接分化，步驟較繁瑣，體細胞胚再生效率有限，且容易影響再生植株的遺傳穩(wěn)定性；該方法的胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基中添加有價格昂貴的激動素(KT)，配制培養(yǎng)基的成本高，不利于開展大規(guī)模的組織培養(yǎng)工作。
所以，在改良花卉品質的科研工作中需要一種直接誘導體細胞胚生長的、提高體細胞胚再生效率、成本低廉的“神馬”菊花組織培養(yǎng)方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，該方法將菊花的莖段外植體培養(yǎng)成為無菌苗后，再取葉盤外植體于誘導培養(yǎng)基，進行體細胞胚誘導培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞 胚。[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的。
一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括以下步驟:
1、消毒處理:
A、選取菊花的莖段外植體，進行表面消毒處理；該表面消毒處理為:先將所述的莖段外植體用自來水沖洗，再放入吐溫溶液中浸泡，得到表面消毒的莖段外植體；
B、將所述的表面消毒的莖段外植體轉入超凈臺中，用酒精溶液浸泡，再用NaClO溶液浸泡，最后用滅菌的蒸餾水沖洗，得到滅菌后的莖段外植體；
I1、無菌苗培養(yǎng):
將所述的滅菌后的莖段外植體轉入生根培養(yǎng)基，進行無菌苗培養(yǎng)，得到無菌苗；
II1、體細胞胚誘導培養(yǎng):
將所述的無菌苗的葉片剪成葉盤外植體，轉入誘導培養(yǎng)基，進行體細胞胚誘導培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚。
優(yōu)選地，步驟II中，所述的生根培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基成分中的大量元素減為原來的1/2、其他成分不變，得到的1/2MS培養(yǎng)基為基礎，添加α -萘乙酸(NAA) 0.lmg/L ；
優(yōu)選地，步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 2-3.5mg/L。
優(yōu)選地，步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為8-12天。
優(yōu)選地，步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)的溫度為25。C，光/暗周期為16h/8h，光照強度為 2000-25001x。
優(yōu)選地，所述的葉盤外植體源于苗齡18-20天無菌苗頂部第1-5片葉片。
優(yōu)選地，所述的菊花的品種為“神馬”。
本發(fā)明與已有技術相比具有如下優(yōu)點:
本發(fā)明僅采用一種誘導培養(yǎng)基直接誘導葉盤外植體得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚，菊花體細胞胚再生效率高，遺傳穩(wěn)定，操作簡便；本發(fā)明在體細胞胚誘導培養(yǎng)中先進行暗培養(yǎng)再進行光照培養(yǎng)，明顯提高再生效率；本發(fā)明避免使用激動素(KT)配制培養(yǎng)基，降低了培養(yǎng)成本。


圖1:葉盤外植體的生成體細胞的胚的過程中倒置顯微鏡下的體細胞胚切片的相片。
圖2:葉盤外植體的生成體細胞胚的過程中外部形態(tài)變化的相片。
圖3:葉盤外植體生成體細胞胚的過程中內部細胞形態(tài)變化的相片。
具體實施方式
實施例1:
一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括以下步驟:
1、消毒處理:
A、選取菊花的莖段外植體，進行表面消毒處理；該表面消毒處理為:先將所述的莖段外植體用自來水沖洗，再放入體積比為0.1%的吐溫溶液中浸泡20 min，得到表面消毒的莖段外植體；
所述的菊花的品種為市售的“神馬”；
所述的莖段外植體的選取方式為:選取菊花未開花植株上部幼嫩枝段，將該枝段剪掉葉片，以兩個節(jié)間為一個單位截取長度為2-3cm，優(yōu)選為2.5cm，作為所述的莖段外植體；
B、將所述的表面消毒的莖段外植體轉入超凈臺中，用體積比為70%的酒精溶液浸泡1-3 min，再用體積比為10%的NaClO溶液浸泡15-20 min，最后用滅菌的蒸餾水沖洗干凈，得到滅菌后的莖段外植體；在上述用NaClO溶液浸泡過程中，可以進行震蕩，以便NaClO溶液與所述的表面消 毒的莖段外植體充分接觸；
I1、無菌苗培養(yǎng):
將所述的滅菌后的莖段外植體轉入生根培養(yǎng)基，進行無菌苗培養(yǎng)，得到無菌苗；滅菌后的莖段外植體需要在轉入之前將兩端經(jīng)消毒處理后變褐色的部位剪掉；所述的無菌苗培的養(yǎng)溫度為25° C，光/暗周期為16h/8h，光照強度為2000-25001x ；
所述的生根培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基成分中的大量元素減為原來的1/2、其他成分不變，得到的1/2MS培養(yǎng)基為基礎，添加α -萘乙酸NAA 0.lmg/L ；
II1、體細胞胚誘導培養(yǎng):
將所述的無菌苗的葉片剪成葉盤外植體，轉入誘導培養(yǎng)基，進行體細胞胚誘導培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚。
所述的葉盤外植體源于苗齡18-20天的所述的無菌苗頂部第1-5片葉片；
所述的葉盤外植體的規(guī)格為1-10 mmX 1-1Omm ,優(yōu)選為5 mmX5 mm,所述的葉盤外植體的背面葉脈處被解剖刀輕輕劃有2-3道切口 ；所述的葉盤外植體將其近軸面接觸所述的誘導培養(yǎng)基；
所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 2-3.5mg/L (簡寫為:MS+2, 4-D 3.0 mg/L+6-BA2_3.5mg/L)。
所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為8-12天。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)的溫度為25° C ;所述的光照培養(yǎng)的光/暗周期為16h/8h，光照強度為2000-25001x。
本實施例中，體細胞胚發(fā)生率為81%_92%，每個葉盤外植體產(chǎn)生的體細胞胚平均數(shù)為8-11個。
計算方法為:
體細胞胚發(fā)生率=形成體細胞胚的葉盤數(shù)量/葉盤總數(shù)量X 100% ；
體細胞胚平均數(shù)=體細胞胚總數(shù)量/形成體細胞胚的葉盤數(shù)量；
本實施例所述的MS基本培養(yǎng)基組成為:
大量元素:
硝酸鉀(KN03):190mg/L，硝酸銨(NH4NO3):1650 mg/L，硫酸鎂(MgSO4.7H20):370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2P04):170 mg/L，氯化鈣(CaCl2.2H20):440 mg/L ；
微量元素:[0052]硫酸錳(MnSO4.H2O): 16.9 mg/L，硫酸鋅(ZnSO4.7Η20):8.6 mg/L，硼酸(Η3Β03):6.2mg/L，碘化鉀(ΚΙ):0.83 mg/L，鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20):0.25 mg/L，硫酸銅(CuSO4.5H20):0.025 mg/L,
氯化鈷(CoCl2.6H20):0.025 mg/L ；
鐵鹽:
二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA):37.3 mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4.4H20):27.8mg/L ；
有機:
甘氨酸:2.0 mg/L,鹽酸批卩多醇:0.5 mg/L,鹽酸硫胺素:0.1 mg/L,
煙酸:0.5mg/L,肌酸:100 mg/L ；
糖類:蔗糖:30g/L ；
瓊脂:6.4g/L ；
所述的MS基本培養(yǎng)基的pH值為5.8。
本實施例中的生根培養(yǎng)基和誘導培養(yǎng)基，均需要于117° C進行高壓滅菌17 min。
本實施例中，選取所述的菊花體細胞胚進行鑒定:
選取步驟III中不同發(fā)育階段的所述的胚性愈傷組織和菊花體細胞胚，切成2 mm3的塊狀，再進行FAA固定處理、注射器抽氣處理、梯度酒精脫水處理，石蠟浸透包埋處理，得到厚度約8-10μπι的切片，再將所述的切片進行染色和脫蠟處理、封片處理，得到切片標本成品，再進行觀察鑒定體細胞胚。
具體步驟如下:
Α、取材:選取不同發(fā)育階段的胚性愈傷組織，將其切成2mm3的塊狀的材料；
B、固定:將上述切好的材料立即放入盛有FAA固定液(福爾馬林5ml，乙酸5ml，70%乙醇90ml)的小玻璃瓶中，注射器抽氣約30min，固定24h，得到固定后的材料；
C、脫水:用70%、85%、95%的酒精溶液、無水酒精逐級脫水，每次2h，無水酒精置換兩次，以上脫水用酒精用量為所述的固定后的材料的4-5倍，得到脫水后的材料；
D、透明:透明劑選用二甲苯，步驟如下:2/3純酒精+1/3 二甲苯(2h)，l/3純酒精+2/3 二甲苯(2h )，二甲苯(2h，兩次)，得到透明的材料；
E、浸蠟:將所述的透明的材料倒去一部分二甲苯，向盛有材料的小坩堝中加滿蠟屑，I小時后再添加新的蠟屑，然后將盛有所述的透明的材料和蠟屑的小坩堝放入37°C的恒溫箱中過夜，至石蠟不再繼續(xù)熔化為止，調節(jié)恒溫箱溫度為58°C，待石蠟完全熔化后倒去，換三次新鮮的純蠟，每次停留2-5h，使停留在組織內的二甲苯被石蠟完全取代，得到浸蠟的材料；
F、包埋:準備一把鑷子，一個解剖針，一個酒精燈及打火機，放在恒溫箱的旁邊，準備好包埋用的紙盒(用較硬而光滑的紙折成)；包埋時將融化的石蠟連同所述的浸蠟的材料一并傾入紙盒內，再將紙盒加滿融化的石蠟，然后將鑷子在酒精燈上燒熱，趁熱迅速把材料按需要的切面及材料之間的間隔排列好，待石蠟稍微凝固后，將紙盒平放入冷水中，使其很快能凝固(若有氣泡，可用鑷子把氣泡燙去)；待石蠟凝固后將其取出晾干，得到包埋的材料備用。
G、切片:用鏟式切片機將所述的包埋的材料進行切片處理，得到厚度約為9μπι的石蠟切片；
H、粘片:將徹底洗凈的載玻片涂上一小滴蛋白貼劑用手指將粘貼劑均勻涂抹在載玻片上，加幾滴蒸餾水，用針或解剖刀將所述的石蠟切片輕輕放在液面上，所述的石蠟切片的光面朝下，然后將載玻片放在36_40°C的燙片箱上，待所述的石蠟切片受熱完全展平后用吸水紙吸取多余水分，經(jīng)烤干后，再放入36-40°C的溫箱中繼續(xù)烘烤l-2d，得到已干的玻片標本；
1、脫蠟和染色:將所述的已干的玻片標本，插入盛有二甲苯的染色缸中，先脫蠟10-15min，得到脫蠟的玻片標本；然后進行染色處理，得到染色的玻片標本；
所述的染色處理，采用番紅一固綠二重染色法:
a.染色液配方:番紅:番紅lg，70%酒精:IOOml ；
固綠:固綠Ig, 95% 酒精 100ml;
b.二重染色步驟:將所述的脫蠟的玻片標本依次在以下溶液中浸泡:1/2 二甲苯+1/2 純酒精(3-5min)、純酒精(3-5min)、95% 酒精(3_5min)、85% 酒精(3_5min)、70% 酒精(3-5min)、番紅(2_24h)、85% 酒精(0.5_lmin)、95% 酒精(0.5-lmin)、固綠(0.5-lmin)、無水酒精(約lmin)、1/2無水酒精+1/2 二甲苯(約2min)、二甲苯(約3min)、二甲苯(5-30min)，得到染色的玻片；
G、封片:把所述的染色的玻片標本從二甲苯中取出，用干凈的紗布擦去切片材料四周多余的二甲苯，然后滴上一小滴中性樹膠，蓋上載玻片，得到封好的玻片標本；
K、貼標簽、干封與保存: 在所述的封好的玻片標本的左端貼上標簽，注明材料名稱和制作日期，然后平放于50°C左右的溫箱中烤數(shù)天即可干固，得到玻片標本成品。
L、照相:在光學顯微鏡下觀察各個時期的切片，并照相。
IV、將所述的菊花體細胞胚分化成的芽轉入所述的生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，得到的“神馬”菊花小植株；所述的芽高度為2-3 cm,苗齡為葉盤外植體培養(yǎng)后的60-70天；本實施例中，95-98%的芽均能培養(yǎng)成為完整的“神馬”菊花再生植株；
在植物細胞學的研究中，傳統(tǒng)的器官發(fā)生要經(jīng)過脫分化過程，并且很多品種脫分化后的愈傷組織不能正常再分化，而體胚的發(fā)生與合子胚發(fā)生相類似的過程，通過與合子胚發(fā)生相似的途徑(經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉期胚階段)形成胚狀體從而發(fā)育成完整植株，保證了遺傳穩(wěn)定性，同時體胚的直接發(fā)生比間接發(fā)生需要時間短，細胞發(fā)生無性系變異的可能性較小，遺傳會更加穩(wěn)定。單個外植體上可以產(chǎn)生多個體胚，同時還有次級體胚的出現(xiàn)，不僅增加體胚的數(shù)量，同時能為種植保存提供有利條件。以體細胞胚為基因轉化受體可以發(fā)揮其單細胞起源，高產(chǎn)、遺傳穩(wěn)定的優(yōu)勢，能夠滿足轉基因花卉的商業(yè)化生產(chǎn)，具有很高的應用前景。
本實施例中，僅采用一種誘導培養(yǎng)基即可直接誘導葉盤外植體得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚，菊花體細胞胚再生效率高，遺傳穩(wěn)定。
中國專利申請201010267217.0記載的，菊花體細胞胚間接發(fā)生的方法中，胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基中添加有激動素(KT) l-2mg/L，得到體細胞胚。但是，激動素(KT)價格較昂貴，為降低培養(yǎng)成本，在實際的生產(chǎn)過程中需要代之以其他的較廉價的植物激素。而且，“神馬”菊花的生理特性與“玉人面”、“鋪地金”、“紫研”不同，需要針對性更強的誘導培養(yǎng)基產(chǎn)生體細胞胚。在本實施例的對比試驗中，誘導培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基為基礎，分別添加 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D):1.0mg/L、2.0 mg/L>3.0 mg/L、4.0 mg/L,激動素(KT):
1.0mg/L、2.0 mg/L,3.0 mg/L，觀察不同濃度的2，4-D與KT激素配比對體細胞胚發(fā)生的影響時發(fā)現(xiàn)，外植體形成愈傷組織后誘導出大量的根產(chǎn)生，不能產(chǎn)生體菊花細胞胚。所以，激動素(KT)不適用于“神馬”菊花體細胞胚的誘導，本實施例中采用MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA
2-3mg/L的誘導培養(yǎng)基能夠提高體細胞胚的發(fā)生率。
實施例2:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA)3mg/L (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6_BA3mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為10天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為92.22%，體細胞胚平均數(shù)為10.55個。
III步驟中，將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，結果如下:
1、觀察切片標本成品的結果:如圖1所示，在倒置顯微鏡下觀察上述切片標本成品表明，所述的葉盤外植體培養(yǎng)7天后，表面細胞小且緊密排列(圖1-A)，觀察表明，從葉片愈傷組織中可以明顯看到兩種不同的細胞，一種是細胞小，細胞質濃，細胞核大，在切片中染色較深(圖Ι-Β-b)，這些細胞多分布在愈傷組織的外層及內部鄰近組織中，具有旺盛的分裂能力。根據(jù)邱瑾等(1997)將該類細胞質濃，細胞核大，染色深，就有旺盛分裂能力的細胞定義為胚性細胞；另一種細胞較大，細胞質稀，切片中染色較淺(圖Ι-Β-a)，此類細胞稱為非胚性細胞。胚性細胞與非胚性細胞共同存在于胚性愈傷組織中。胚性細胞在分裂的過程中，有的是單個胚性細胞經(jīng)多次分裂形成細胞較小、胞質濃厚的胚性細胞團(圖ι-c)，有的是多個胚性細胞組合在一起發(fā)生不均等分裂，一個大的細胞團中可以發(fā)現(xiàn)幾個小的細胞團(圖1-D)，最終發(fā)育成合生體植株。外植體培養(yǎng)30天后，胚性細胞團繼續(xù)發(fā)育形成早期的球形胚(圖1-E，1-F)，球形胚具有清晰的輪廓，細胞具有分生組織狀態(tài)，與母體維管束聯(lián)系逐漸減少。進一步培養(yǎng)后球形胚進行橫向與縱向分裂形成心形胚(圖1-G)和魚雷胚。魚雷胚繼續(xù)發(fā)育成子葉胚(圖1-H)，子葉胚與周圍其他組織的聯(lián)系越來越疏松，可以看到明顯的“Y”型微管組織。
(圖1中，A為愈傷組織邊緣；B為愈傷組織內部；C為愈傷組織表面；D為多個胚性細胞形成的細胞團；E為愈傷組織表面的球形胚；F為內源生球形胚；G為內源生心形胚；H為成熟胚狀體。)
2、外部形態(tài)特征的變化:
如圖2、圖3所示，所述的葉盤外植體接種到培養(yǎng)基2天后，有輕微卷曲；接種10天后葉片膨大，切口邊緣有薄壁細胞形成(圖2-A);15天后，愈傷組織繼續(xù)增大(圖2-B)，40天后在體式顯微鏡下可以明顯觀察到球形胚(圖3-A)、心形胚(圖3-B) ；50天后可以用肉眼觀察到成熟的體細胞胚(圖2-C)，在體式顯微鏡下可以觀察到成熟的子葉胚(圖3-D)，同時還能觀察到一些合生體細胞胚(圖3-C)。60天后成熟體細胞胚可以生長出高度為2 cm的芽(圖2-D)，當芽高2-3 cm時可以轉入生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)為完整植株(圖2中，A為葉盤外植體培養(yǎng)10天后，B為葉盤外植體培養(yǎng)15天后，C為葉盤外植體培養(yǎng)50天后，D為葉盤外植體培養(yǎng)60天后)。
實施例3:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA)2mg/L(簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA2mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為10天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為81.11%，體細胞胚平均數(shù)為8.31個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
實施例4:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 2.2mg/L (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA2.2mg/L)。
`[0105]步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為12天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為61.82%，體細胞胚平均數(shù)為6.63個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
實施例5:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-0)311^/1，6-芐基腺嘌呤(6-84)2.411^/1 (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA2.4mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為8天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為60.19%，體細胞胚平均數(shù)為6.40個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
實施例6:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。[0114]本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-0)311^/1，6-芐基腺嘌呤(6-84)2.611^/1 (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA 2.6mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為9天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為75.15%，體細胞胚平均數(shù)為8.13個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
實施例7:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-0)311^/1，6-芐基腺嘌呤(6-84)2.811^/1 (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA 2.8mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為11天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為79.03%，體細胞胚平均數(shù)為8.67個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
實施例8:·[0123]本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 3.2mg/L (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA 3.2mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為10天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為89.12%，體細胞胚平均數(shù)為9.58個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
實施例9:
本實施例是在實施例1基礎上的優(yōu)選方案；本實施例的外植體材料、培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件均同實施例1。
本實施例的步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-0)311^/1，6-芐基腺嘌呤(6-84)3.011^/1 (簡寫為:MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA 3.0mg/L)。
步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為12天。
本實施例中，共選用了 300個葉盤外植體進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，體細胞胚發(fā)生率為68.24%,體細胞胚平均數(shù)為8.44個。IV步驟中，按照實施例1中的方法將所述的愈傷組織和菊花 體細胞胚進行鑒定，可以得到與實施例2中相似的結果。
權利要求
1.一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，其特征在于:該培養(yǎng)方法包括以下步驟: 1.消毒處理: A、選取菊花的莖段外植體，進行表面消毒處理；該表面消毒處理為:先將所述的莖段外植體用自來水沖洗，再放入體積比為0.1%的吐溫溶液中浸泡20 min，得到表面消毒的莖段外植體； 所述的菊花的品種為市售的“神馬”； 所述的莖段外植體的選取方式為:選取菊花未開花植株上部幼嫩枝段，將該枝段剪掉葉片，以兩個節(jié)間為一個單位截取長度為2-3cm，作為所述的莖段外植體； B、將所述的表面消毒的莖段外植體轉入超凈臺中，用體積比為70%的酒精溶液浸泡1-3 min，再用體積比為10%的NaClO溶液浸泡15-20 min，最后用滅菌的蒸餾水沖洗干凈，得到滅菌后的莖段外植體； I1、無菌苗培養(yǎng): 將所述的滅菌后的莖段外植體轉入生根培養(yǎng)基，進行無菌苗培養(yǎng)，得到無菌苗；滅菌后的莖段外植體需要在轉入之前將兩端經(jīng)消毒處理后變褐色的部位剪掉；所述的無菌苗培養(yǎng)溫度為25。C，光/暗周期為16h/8h，光照強度為2000-25001X ； 所述的生根培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基成分中的大量元素減為原來的1/2、其他成分不變，得到的1/2MS 培養(yǎng)基為基礎，添加α -萘乙酸NAA 0.lmg/L ； II1、體細胞胚誘導培養(yǎng): 將所述的無菌苗的葉片剪成葉盤外植體，轉入誘導培養(yǎng)基，進行體細胞胚誘導培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚； 所述的葉盤外植體源于苗齡18-20天的所述的無菌苗頂部第1-5片葉片； 所述的葉盤外植體的規(guī)格為1-10 mmX 1-1Omm ,所述的葉盤外植體的背面葉脈處被解剖刀輕輕劃有2-3道切口 ；所述的葉盤外植體將其近軸面接觸所述的誘導培養(yǎng)基； 所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 2-3.5mg/L ； 所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)中，先進行暗培養(yǎng)，再進行光照培養(yǎng)；所述的暗培養(yǎng)的時間為8-12 天； 步驟III中，所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)的溫度為25° C ;所述的光照培養(yǎng)的光/暗周期為16h/8h，光照強度為 2000-25001x。
2.根據(jù)權利要求
1所述的提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，其特征在于: 步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 2.8mg/L。
3.根據(jù)權利要求
1所述的提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，其特征在于: 步驟III中，所述的誘導培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 3mg/L，6-芐基腺嘌呤(6-BA) 3.2mg/L。
專利摘要
本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術領域：
，特別涉及一種提高菊花體細胞胚再生效率的培養(yǎng)方法，該方法將菊花的莖段外植體培養(yǎng)成為無菌苗后，再取葉盤外植體于誘導培養(yǎng)基，進行體細胞胚誘導培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚。本發(fā)明僅采用一種誘導培養(yǎng)基即可直接誘導葉盤外植體得到胚性愈傷組織和所述的菊花體細胞胚，菊花體細胞胚再生效率高，遺傳穩(wěn)定，操作簡便；在體細胞胚誘導培養(yǎng)中先進行暗培養(yǎng)再進行光照培養(yǎng)，明顯提高再生效率；避免使用激動素(KT)配制培養(yǎng)基，降低了培養(yǎng)成本。
文檔編號A01H4/00GKCN102524080 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201210070183
公開日2013年8月14日 申請日期2012年3月16日
發(fā)明者黃叢林, 張秀海, 吳忠義, 羅昌, 程曦, 梁宏霞, 于子婷, 李春華 申請人:北京農業(yè)生物技術研究中心導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan