專利名稱：一種用于制備hiv－1病毒載量測(cè)定外參照的質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于制備HIV-1病毒載量測(cè)定用外參照的質(zhì)粒及其在HIV-1病毒載量測(cè)定上的應(yīng)用。具體的說，本發(fā)明涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建一種用于制備HIV-1病毒載量測(cè)定用外參照的質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及利用上述質(zhì)粒建立HIV-1病毒載量測(cè)定外參照。本發(fā)明還涉及利用上述外參照在HIV-1病毒載量測(cè)定上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)的致死疾病。自1985年我國(guó)發(fā)現(xiàn)首例艾滋病人以來，該病在全國(guó)迅速蔓延，現(xiàn)已進(jìn)入高速增長(zhǎng)期，艾滋病的防治已成為關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的大事。
艾滋病的臨床治療，及抗艾滋病新藥和疫苗的發(fā)現(xiàn)與研究，需要一客觀、可靠的指標(biāo)來評(píng)判HIV感染者的病程和預(yù)后。已有的血清p24抗原水平檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定、病毒分離培養(yǎng)等方法也能在一定程度上反映患者體內(nèi)病毒數(shù)量的變化，但以上方法干擾因素多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且靈敏度較低。大量研究表明，HIV-1病毒載量的變化是HIV-1感染者病程和預(yù)后判斷的最客觀依據(jù)，已商品化的定量檢測(cè)HIV-1的技術(shù)有PCR(Amplicor HIV-1 Monitor test；Roche)、NASBA和b-DNA，但是這些商品化的檢測(cè)試劑價(jià)格十分昂貴，技術(shù)要求高，有的方法只能在極少數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展，因此難以廣泛應(yīng)用于臨床和科學(xué)研究。為此，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，特異性好，靈敏度高，同時(shí)有較好的可重復(fù)性，將為HIV的檢測(cè)以及艾滋病的診斷、防治和科學(xué)研究提供有力工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于制備HIV-1病毒量測(cè)定用外參照的質(zhì)粒；本發(fā)明的另一目的是提供了一種制備HIV-1病毒量定量測(cè)定外參照的方法；本發(fā)明的再一目的是將此外參照應(yīng)用于HIV-1病毒量測(cè)定。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于制備HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照的重組質(zhì)粒載體，其包含用引物F/R以HIV-1基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增而獲得的核酸片段，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
優(yōu)選其中HIV-1基因組是HIV-1IIIB病毒基因組。其中所述的賀歲片段可以克隆在任何已知的能進(jìn)行專利的質(zhì)粒載體上從而形成本發(fā)明的重組質(zhì)粒載體。優(yōu)選能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒載體為pGEM-T vector，優(yōu)選本發(fā)明的重組質(zhì)粒載體為pZhcT-550。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建用于制備HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照的重組質(zhì)粒載體的引物對(duì)，其是外圍引物F/R，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
引物對(duì)中的兩個(gè)引物可以以任何已知的方式形成引物對(duì)，如可以通過將兩個(gè)引物簡(jiǎn)單混合而形成引物對(duì)；也可以形成一種試劑盒，其中包括以上兩種引物，但是這兩種引物并不存在物理上的接觸。優(yōu)選通過將兩個(gè)引物以1∶1的摩爾比簡(jiǎn)單混合來形成引物對(duì)。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于制備HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)由本發(fā)明第二個(gè)方面的引物對(duì)，以HIV-1IIIB病毒的RNA為模板，獲得所需的HIV-1cDNA片段；(2)導(dǎo)入含有Sp6和T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體pGEM-T vector中，得到包含靶片段并且能夠?qū)υ摪衅芜M(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒pZhcT-550。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種由本發(fā)明第一個(gè)方面所述的重組質(zhì)粒制備HIV-1病毒量測(cè)定用外參照的方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)將本發(fā)明第一個(gè)方面所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌，獲得重組受體菌；
(2)培養(yǎng)重組受體菌，并收集本發(fā)明第一個(gè)方面所述的重組質(zhì)粒載體；(3)對(duì)本發(fā)明第一個(gè)方面所述的重組質(zhì)粒載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，從而獲得HIV-1病毒載量定量測(cè)定的RNA外參照。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種HIV-1寡聚核苷酸LUX引物HIV-LUX/HIV-RP對(duì)，其中所述引物序列為HIV-LUX5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CT*AAG-3’HIV-RP5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’，其中T*為標(biāo)記有6-羧基熒光素(FAM)的堿基T。
引物對(duì)中的兩個(gè)引物可以以任何已知的方式形成引物對(duì)，如可以通過將兩個(gè)引物簡(jiǎn)單混合而形成引物對(duì)；也可以形成一種試劑盒，其中包括以上兩種引物，但是這兩種引物并不存在物理上的接觸。優(yōu)選通過將兩個(gè)引物以1∶1的摩爾比簡(jiǎn)單混合來形成引物對(duì)。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)樣品中HIV-1病毒量的測(cè)定方法，其包括以下步驟(1)進(jìn)行本發(fā)明第四個(gè)方面的方法，獲得HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照；(2)用本發(fā)明第五個(gè)方面的引物對(duì)分別對(duì)樣品和步驟(1)得到的RNA外參照進(jìn)行擴(kuò)增；(3)參照RNA外參照擴(kuò)增的結(jié)果，確定樣品中的HIV-1病毒量。
優(yōu)選在上述方法中，樣品是HIV感染者和艾滋病患者的血漿。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定樣品中HIV-1病毒量的試劑盒，其包括1)，權(quán)力要求1或2所述的重組質(zhì)粒載體；和2)，權(quán)利要求6所述的引物對(duì)。
在以上試劑盒中還可以進(jìn)一步包括用于對(duì)重組質(zhì)粒載體進(jìn)行體外專利的試劑，如SP6RNA聚合酶。
另外，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于制備HIV-1病毒載量測(cè)定用外參照的質(zhì)粒，它包括的步驟是(1)由設(shè)計(jì)的HIV-1引物F/R，以HIV-1IIIB病毒的RNA為模板，獲得所需的HIV-1cDNA片段；
(2)經(jīng)T-A克隆導(dǎo)入含有Sp6和T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體中，得到能夠針對(duì)目的片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒pZhcT-550。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種制備HIV-1病毒載量定量測(cè)定用外參照的方法，它包括的步驟是(1)將重組質(zhì)粒pZhcT-550轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；(2)經(jīng)PCR鑒定，篩選出陽性克隆子，獲得大量重組質(zhì)粒pZhcT-550；(3)體外轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒pZhcT-550，獲得病毒載量定量測(cè)定的RNA外參照。
本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式將由以上方法得到的外參照應(yīng)用于HIV-1病毒載量測(cè)定，它包括的步驟是(1)對(duì)引物F/R擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定，確定其分子量；(2)在波長(zhǎng)260nm和280nm處測(cè)定RNA外參照的光吸收值，確定其純度和濃度，進(jìn)而確定其質(zhì)量；(3)確定獲得的RNA外參照的分子數(shù)，即拷貝數(shù)，據(jù)此將RNA外參照稀釋成10倍濃度梯度，從而制備成定量用外參照標(biāo)準(zhǔn)品；(4)設(shè)計(jì)HIV LUX引物，該引物擴(kuò)增片段位于外圍引物F/R擴(kuò)增片段內(nèi)；(5)利用HIV LUX引物可以在熒光定量PCR儀上對(duì)構(gòu)建的外參照標(biāo)準(zhǔn)品以及HIV感染者和艾滋病人血漿中的HIV RNA進(jìn)行RT-PCR，并且獲得有效的熒光信號(hào)。利用外參照標(biāo)準(zhǔn)品的RNA拷貝數(shù)與擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以定量測(cè)定未知樣品中所含有的HIV RNA拷貝數(shù)。
附圖的簡(jiǎn)要說明附

圖1為pZhcT-550質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
附圖2F/R為引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜。圖中1DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2擴(kuò)增產(chǎn)物(HIV-1IIIB病毒的RNA為模板)。
附圖3為重組質(zhì)粒的電泳分析圖譜。圖中1DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2重組質(zhì)粒pZhcT-550。
附圖4是重組質(zhì)粒為模板，F(xiàn)/R為引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜。圖中1DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2陰性對(duì)照；3重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果(559bp)。
附圖5重組質(zhì)粒為模板，以LUX引物進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR圖譜。
附圖6HIV-1外圍引物F/R擴(kuò)增獲得的cDNA序列測(cè)定結(jié)果，黑體表示引物F/R序列。
附圖7-A至圖7-B定量用外參照體系標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R為0.99825。
附圖8-A、圖8-B、圖8-C對(duì)未知樣品的熒光定量PCR檢測(cè)。
發(fā)明的詳細(xì)描述可以認(rèn)為，不需進(jìn)一步的解釋，本領(lǐng)域的人員就可以根據(jù)前面的描述，充分利用本發(fā)明。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或彭秀玲等人，基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)(科學(xué)技術(shù)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例①重組質(zhì)粒載體pZhcT-550的制備引物F/R是根據(jù)HIV-1IIIB病毒基因組核苷酸序列(Genebank登錄號(hào)A04321)設(shè)計(jì)而獲得，由中國(guó)大連寶生物工程公司合成。引物序列為引物F5’-CGACT CATGG AGCATCCTGC CTAAG-3’)；引物R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
從本實(shí)驗(yàn)室利用C8166細(xì)胞培養(yǎng)獲得的200μl HIV-1IIIB病毒培養(yǎng)上清中用High PureViral Nucleic Acid Kit(Roche，Penzberg，Germany)提取RNA，用50μl Tris·HCl(pH8.0)懸浮，10μl的樣品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
通過引物F/R，利用AMV One Step RT-PCR Kit(大連寶生物工程公司，中國(guó))對(duì)HIV-1IIIB病毒的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為逆轉(zhuǎn)錄50℃，30分鐘；預(yù)變性94℃，2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括94℃，30秒變性，58℃，30秒退火和72℃，1分鐘延伸，最后72℃，5分鐘擴(kuò)增產(chǎn)物。
經(jīng)1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物(如圖2)，然后用Agrose gel purificationKit(大連寶生物工程公司，中國(guó))純化DNA(序列如圖6所示，該序列也可以通過人工合成核酸片段來連接而成)。純化片段與質(zhì)粒載體pGEM-T vector(Promega Company，USA)進(jìn)行T-A克隆，從而構(gòu)建成新的重組質(zhì)粒載體pZhcT-550(如圖1)，實(shí)驗(yàn)步驟詳見pGEM-Tvector說明書。
實(shí)施例②重組質(zhì)粒pZhcT-550的擴(kuò)增及鑒定制備宿主大腸桿菌JM109(Promega Company，USA)感受態(tài)細(xì)胞，完成重組質(zhì)粒pZhcT-550對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，利用氨卞抗性和藍(lán)白斑雙篩選獲得陽性克隆。提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖3)。以重組質(zhì)粒pZhcT-550作為模板，分別用F/R引物和LUX引物(Invitrogen Company，Canada)進(jìn)一步作PCR擴(kuò)增鑒定(如圖4)和熒光實(shí)時(shí)PCR鑒定(如圖5)。LUX引物序列如下HIV-LUX5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC C TAAG-3’HIV-RP5’ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’其中引物HIV-LUX近3’端的堿基T上標(biāo)記有6-羧基熒光素(FAM)。
(1)F/R引物擴(kuò)增獲得的克隆片斷的PCR電泳結(jié)果表明用F/R引物擴(kuò)增HIV-1IIIB病毒基因組保守序列產(chǎn)生特異條帶(圖4)，條帶大小(559bp)與預(yù)期結(jié)果一致。
(2)以pZhcT-550質(zhì)粒為模板，用LUX引物進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR鑒定，結(jié)果表明能夠產(chǎn)生有效的熒光信號(hào)(圖5)。進(jìn)一步說明質(zhì)粒構(gòu)建成功，其中含有特異克隆片段。
實(shí)施例③制備HIV-1病毒量定量測(cè)定的外參照以重組質(zhì)粒pZhcT-550作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，該實(shí)驗(yàn)采用SP6 RNA聚合酶(大連寶生物工程公司，中國(guó))完成，具體方法參照SP6 RNA聚合酶說明書。RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)定量，以十倍系列稀釋，其中最小濃度為稀釋至10拷貝/ml，從而獲得一系列稀釋度的含有由pZhcT-550轉(zhuǎn)錄的mRNA的樣品，以這些樣品作為HIV-1病毒量定量測(cè)定的外參照。以十倍系列稀釋的HIV-1病毒外參照為模板，用LUX引物進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。
實(shí)施例④未知樣品HIV-1病毒量(Viral load)的測(cè)定分別取十倍系列稀釋的外參照RNA(10～107拷貝/ml)和未知樣品RNA作為模板，利用LUX引物，依SuperScriptTMIII PlatinumOne-Step Quantitative RT-PCR System(Invitrogen Company，Canada)操作說明書在熒光PCR儀RotorGene3000(CorbettResearch，Australia)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，根據(jù)不同拷貝數(shù)的外參照，其熒光強(qiáng)度(Norm.fluoro.)不同，達(dá)到某一熒光強(qiáng)度所需的PCR循環(huán)數(shù)(CT值)也不同的原理，以CT值為縱坐標(biāo)，拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知樣品在擴(kuò)增中獲得的熒光信號(hào)強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到未知樣品中HIV RNA的初始拷貝數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出單位體積血漿中HIV的病毒量。
如上述熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果(圖8)所顯示外參照的CT值(Value)隨濃度(concentration)的增大而遞減。獲得的工作曲線有好的線性關(guān)系(R＝0.99848)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出六病人的病毒量分別為4.09×10-2拷貝/ml、1.30×10-2拷貝/ml、9.43×10-3拷貝/ml、1.36×103拷貝/ml、1.54×104Copies/ml、1.87×104Copies/ml，結(jié)果表明本發(fā)明對(duì)高、中和低拷貝數(shù)樣品都能夠準(zhǔn)確定量并有效區(qū)分。
本發(fā)明的結(jié)果表明，當(dāng)以重組質(zhì)粒pZhcT-550轉(zhuǎn)錄的RNA作為測(cè)定病毒量的外參照時(shí)，RNA外參照包含有HIV-1 LUX引物擴(kuò)增的靶序列。它的檢測(cè)靈敏度高，一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)初始拷貝數(shù)低至10拷貝/μl甚至1拷貝/μl的RNA時(shí)都能很好地?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增效果和特異性都好。
目前商品化的試劑Amplicor Monitor test(Roche Diagnostics，UK)的檢測(cè)范圍是50-50,000拷貝/毫升(臨床樣本)。本研究建立的定量PCR方法檢測(cè)范圍是10-107拷貝/毫升(臨床樣本)。如果采用高速離心濃縮樣品內(nèi)的病毒核酸，檢測(cè)下限將能進(jìn)一步提高。經(jīng)對(duì)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的二～三次重復(fù)測(cè)定，方法本身造成的變異系數(shù)基本低于30％。

目前，檢測(cè)HIV-1病毒載量的商品化的技術(shù)中，Roche公司的Amplicor Monitortest(PCR)是FDA批準(zhǔn)的唯一用于臨床檢測(cè)HIV-1的試劑盒?，F(xiàn)有的商品化檢測(cè)試劑盒價(jià)格十分昂貴(每個(gè)樣品的檢測(cè)費(fèi)用在200至500美元之間)[12]，而我們?cè)诒疚闹薪榻B的方法的成本則低得多，檢測(cè)一個(gè)樣品的試劑成本在50元人民幣左右，除熒光定量PCR儀之外再不需要其他大型設(shè)備，一般臨床和研究機(jī)構(gòu)都可以購買得起，而且操作比較簡(jiǎn)易。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，特異性好，靈敏度高，同時(shí)有較好的可重復(fù)性，將為HIV的檢測(cè)以及艾滋病的診斷、防治和科學(xué)研究提供有力工具。
權(quán)利要求
1.一種用于制備HIV-1病毒測(cè)定的RNA外參照的重組質(zhì)粒載體，其包含用引物F/R以HIV-1基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增而獲得的核酸片段，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
2.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其中HIV-1基因組是HIV-1IIIB病毒基因組。
3.一種構(gòu)建用于制備HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照的重組質(zhì)粒載體的引物對(duì)，其是外圍引物F/R，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
4.一種用于制備HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)由權(quán)利要求3所述的引物對(duì)，以HIV-1IIIB病毒的RNA為模板，獲得所需的HIV-1cDNA片段；(2)導(dǎo)入含有Sp6和T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體pGEM-T vector中，得到包含靶片段并且能夠?qū)υ摪衅芜M(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒pZhcT-550。
5.一種由權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒制備HIV-1病毒量測(cè)定用外參照的方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1或2所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌，獲得重組受體菌；(2)培養(yǎng)重組受體菌，并收集權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒載體；(3)對(duì)權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，從而獲得HIV-1病毒載量定量測(cè)定的RNA外參照。
6.一種HIV-1寡聚核苷酸LUX引物HIV-LUX/HIV-RP對(duì)，其中所述引物序列為HIV-LUX5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CT*AAG-3’HIV-RP5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’，其中T*為標(biāo)記有6-羧基熒光素(FAM)的堿基T。
7.一種對(duì)樣品中HIV-1病毒量的測(cè)定方法，其包括以下步驟(1)進(jìn)行權(quán)利要求5的方法，獲得HIV-1病毒量定量測(cè)定的RNA外參照；(2)用權(quán)力要求6的引物對(duì)分別對(duì)樣品和步驟(1)得到的RNA外參照進(jìn)行擴(kuò)增；(3)參照RNA外參照擴(kuò)增的結(jié)果，確定樣品中的HIV-1病毒量。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中樣品是HIV感染者和艾滋病患者的血漿。
9.一種用于測(cè)定樣品中HIV-1病毒量的試劑盒，其包括1)，權(quán)力要求1或2所述的重組質(zhì)粒載體；和2)，權(quán)利要求6所述的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備HIV－1病毒量測(cè)定用外參照的質(zhì)粒，建立HIV－1感染者和艾滋病人血漿中HIV病毒量定量測(cè)定用外參照的方法以及該外參照在HIV病毒量測(cè)定中的應(yīng)用。其制備方法為利用HIV外圍引物HF/HR從HIV－文檔編號(hào)C12N15/63GK1814800SQ20051009018
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者任若通, 賁昆龍, 李衛(wèi)云, 陳韻, 陳震球, 陶劍 申請(qǐng)人:李衛(wèi)云, 李燕琴