通過質譜法定量胰島素相關專利申請案本申請要求2010年12月28日提交的美國臨時申請No.61/427,749的權益，該臨時申請以引用的方式整體并入本文以用于所有用途。發(fā)明領域本發(fā)明涉及胰島素的定量測量。在具體方面，本發(fā)明涉及通過質譜法定量測量胰島素的方法。發(fā)明背景以下對發(fā)明背景的描述僅僅作為理解本發(fā)明的幫助而提供并不承認是描述或組成本發(fā)明的現(xiàn)有技術。胰島素是由表示為A鏈和B鏈，通過半胱氨酸殘基之間的二硫橋鍵連接的兩條鏈中的51個氨基酸組成的小肽。人胰島素的摩爾質量為約5607.4amu。A鏈具有21個氨基酸而B具鏈有30個氨基酸。胰島素是對于調節(jié)體內脂肪和類固醇代謝至關重要的激素。當餐后血糖水平升高時，胰島素釋放至血流中并允許葡萄糖從循環(huán)轉運至細胞中。胰島素生成或利用的缺陷導致糖尿病。常常施用胰島素治療糖尿病。糖尿病及其并發(fā)癥代表主要公共健康問題。因此，糖尿病和糖尿病前期患者樣品中胰島素的定量作為診斷工具和檢測患者治療均很重要。已將免疫學技術廣泛用于胰島素定量(參見例如，Manley等，ClinChem.,2007,53:922-32)，并且已經報道了若干種檢測和/或定量胰島素的質譜方法。參見例如，R.等，Diabetes1997,46:44-50(報道了通過免疫親和色譜法-固相萃取-HPLC-單一質譜法定量血清樣品中的胰島素)；Darby,S.M.等，J.AnalToxicol2001,25:8-14(報道了高生理水平下對血漿中胰島素的SPE-HPLC-MS定量)；Fierens,C.等，RapidCommun.MassSpectrom.2001,15:1433-41(報道了通過HPLC-(ESI)MS/MS檢測水溶液中的胰島素)；Magnes,C.等，2004年5月第52次ASMS會議(報道了通過高分辨率/高精度質譜法定量血清中的胰島素)；Thevis,M.等，Anal.Chem.,2005,77:3579-85(報道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測胰島素B鏈的免疫親和色譜法-固相萃取-HPLC-串聯(lián)質譜法)；Thevis,M.等，Anal.Chem.,2006,77:3579-85和Thomas,A.等，Anal.Chem.,2007,79:2518-24(報道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測胰島素B鏈的固相萃取-免疫親和色譜法-固相萃取-HPLC-串聯(lián)質譜法)；Uytfanghe,K.等，RapidCommMassSpectrom.,2007,21:819-821(報道了用于定量來自血清的胰島素的免疫親和色譜法-固相萃取-HPLC-串聯(lián)質譜法)；Rodríguez-Cabaleiro,D.等，ClinChem.,2007,53:1462-69(報道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測胰島素B鏈的免疫親和色譜法-固相萃取-HPLC-串聯(lián)質譜法)；Thevis,M.等，MassSpectrom.Reviews,2008,27:35-50(報道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測胰島素B鏈的免疫親和色譜法-固相萃取-HPLC-串聯(lián)質譜法)；和Guedes,S.,J.AmSocMassSpectrom,2009,20:1319-26。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種通過質譜法測定樣品中胰島素的量的方法。在一個方面，所述方法利用串聯(lián)質譜法。在一些串聯(lián)質譜法實施方案中，所述方法用于測定取自人類時的生物樣品中胰島素的量。在一些實施方案中，所述方法包括：(a)使樣品經受固相萃取(SPE)和高效液相色譜法(HPLC)以由樣品獲得富含胰島素的成分；(b)在適合生成可通過質譜法檢測的一種或多種胰島素離子的條件下使富集的胰島素經受電離源；(c)通過串聯(lián)質譜法測定一種或多種胰島素離子的量，其中所述樣品在電離之前未經受免疫純化。在這些實施方案中，使用步驟(c)中測定的所述一種或多種離子的量測定樣品中胰島素的量。在一些實施方案中，在正離子模式下電離之前使所述樣品經受酸性條件。在一些相關實施方案中，使所述樣品經受酸性條件包括使富集的胰島素經受甲酸。在一些相關實施方案中，步驟(c)中測定的一種或多種離子包括選自質荷比(m/z)為1162.5±0.5和968.9±0.5的離子的胰島素前體離子。在另外的相關實施方案中，步驟(c)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在其它相關實施方案中，一種或多種碎片離子包括來自m/z為1162.5±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為968.9±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子。在相關實施方案中，來自每種前體離子的一種或多種碎片離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些實施方案中，在正離子模式下電離之前使所述樣品經受堿性條件。在一些相關實施方案中，使所述樣品經受堿性條件包括使樣品經受氨。在一些相關實施方案中，步驟(c)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為1453.8±0.5和1163.0±0.5的離子的胰島素前體離子。在另外的相關實施方案中，步驟(c)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在其它相關實施方案中，一種或多種碎片離子包括來自m/z為1453.8的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子和來自質荷比為1163.0±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子。在利用串聯(lián)質譜法測定樣品中胰島素的量的一些實施方案中，所述方法包括：(a)通過萃取技術使樣品中的胰島素富集；(b)使來自步驟(a)的純化胰島素經受高效液相色譜法(HPLC)以從樣品獲得富含胰島素的成分；(c)在適合生成可通過質譜法檢測的胰島素前體離子的條件下使富集的胰島素經受電離源，其中胰島素前體離子的m/z為1162.5±0.5；(d)在約40-70eV范圍內的碰撞能下使胰島素前體離子經受碰撞誘導解離以生成可通過質譜法檢測的一種或多種碎片離子；以及(e)通過質譜法測定一種或多種所述碎片離子的量。在這些實施方案中，步驟(e)中測定的離子的量與所述樣品中胰島素的量有關。在一些實施方案中，萃取技術為固相萃取(SPE)。在一些實施方案中，在正離子模式下電離之前使所述樣品經受酸性條件。在一些相關實施方案中，使所述樣品經受酸性條件包括使樣品經受甲酸。在替代實施方案中，在電離之前使所述樣品經受堿性條件。在一些相關實施方案中，使所述樣品經受堿性條件包括氨。在一些實施方案中，碰撞能在約40-60eV范圍內，例如在約40-50eV范圍內。在一些實施方案中，步驟(d)中生成的一種或多種碎片離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種離子。在利用串聯(lián)質譜法測定取自人類時的生物樣品中胰島素的量的一些實施方案中，所述方法包括：(a)使樣品經受適合由胰島素生成胰島素A鏈的條件；(b)使來自步驟(a)的樣品經受固相萃取(SPE)和高效液相色譜法(HPLC)以獲得富含胰島素A鏈的成分；(c)在適合生成可通過質譜法檢測的一種或多種胰島素A鏈離子的條件下使富集的胰島素A鏈經受電離源；(d)通過串聯(lián)質譜法測定一種或多種胰島素A鏈離子的量。在這些實施方案中，步驟(d)中測定的離子的量與所述樣品中胰島素的量有關。在一些相關實施方案中，在正離子模式下電離之前使樣品經受酸性條件。在一些相關實施方案中，使樣品經受酸性條件包括使所述樣品經受甲酸。在一些實施方案中，在電離之前未經化學修飾步驟(a)中生成的胰島素A鏈。在一些相關實施方案中，步驟(d)中測定的所述一種或多種離子包括選自m/z為1192.9±0.5和795.4±0.5的離子的胰島素A鏈前體離子。在一些相關實施方案中，步驟(d)中測定的所述一種或多種離子包括選自m/z為513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些相關實施方案中，步驟(d)中測定的所述一種或多種離子包括來自m/z為1192.9±0.5的胰島素A鏈前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為795.4±0.5的胰島素A鏈前體離子的一種或多種碎片離子。在一些相關實施方案中，來自每種前體離子的所述一種或多種碎片離子包括選自m/z為513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在替代實施方案中，所述方法進一步包括在電離之前化學修飾步驟(a)中生成的胰島素A鏈。在一些實施方案中，化學修飾包括烷基化胰島素A鏈。在另外的相關實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為1306.0±0.5和871.0±0.5的離子的烷基化胰島素A鏈前體離子。在其它相關實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在其它相關實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括來自m/z為1306.0±0.5的烷基化胰島素A鏈前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為871.0±0.5的烷基化胰島素A鏈前體離子的一種或多種碎片離子。在一些相關實施方案中，來自每種烷基化前體離子的一種或多種碎片離子包括選自m/z為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些相關實施方案中，利用串聯(lián)質譜法測定生物樣品中胰島素的量。在這些實施方案中，所述方法包括：(a)使樣品經受適合由胰島素生成胰島素B鏈的條件；(b)處理來自步驟(a)的樣品以獲得富含胰島素B鏈的成分；(c)在適合生成可通過質譜法檢測的一種或多種胰島素B鏈離子的條件下使富集的胰島素B鏈經受電離源；(d)通過串聯(lián)質譜法測定一種或多種胰島素B鏈離子的量。在這些實施方案中，步驟(d)中測定的離子的量與樣品中胰島素的量有關。在一些實施方案中，步驟(b)的處理包括通過固相萃取(SPE)、高效液相色譜法(HPLC)或二者使胰島素B鏈富集。在使用SPE和HPLC的一些相關實施方案中，兩種富集技術可以在線方式進行。在一些實施方案中，生物樣品包括人血漿或血清樣品。在一些相關實施方案中，當取自人類時，測定的胰島素的量是樣品中存在的胰島素的量。在一些實施方案中，電離源是電噴霧電離(ESI)源，例如加熱ESI源。在一些實施方案中，在正離子模式下電離之前使樣品經受酸性條件。在一些相關實施方案中，使樣品經受酸性條件包括使所述樣品經受甲酸。在一些實施方案中，在電離之前未經化學修飾胰島素B鏈。在一些相關實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的胰島素B鏈前體離子。在一些相關實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為906.0±0.5、825.0±0.5、768.5±0.5、753.0±0.5、703.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子，例如m/z為768.5±0.5、753.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子，例如m/z為768.5±0.5和753.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自以下的兩種或更多種碎片離子：來自m/z為1144.2±0.5的胰島素B鏈前體離子的碎片離子，來自m/z為858.3±0.5的胰島素B鏈前體離子的碎片離子和來自m/z為686.8±0.5的胰島素B鏈前體離子的碎片離子。在一些實施方案中，串聯(lián)質譜法包括生成質荷比(m/z)為686.8±0.5的人胰島素B鏈前體離子并將前體離子破碎成選自m/z為906.0±0.5、825.0±0.5、768.5±0.5、753.0±0.5、703.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子，例如選自768.5±0.5和753.0±0.5的一種或多種碎片離子。在一些實施方案中，串聯(lián)質譜法包括以在10-25V范圍內且包括10V和25V的碰撞能破碎前體離子。在替代實施方案中，在電離之前化學修飾胰島素B鏈。在一些實施方案中，化學修飾包括烷基化所述胰島素B鏈。在一些實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的離子的烷基化胰島素B鏈前體離子。在一些實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自m/z為345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些實施方案中，步驟(d)中測定的一種或多種離子包括選自以下的兩種或更多種碎片離子：來自質荷比(m/z)為1181.9±0.5的烷基化胰島素B鏈前體離子的碎片離子，來自m/z為886.9±0.5的烷基化胰島素B鏈前體離子的碎片離子和來自m/z為709.8±0.5的烷基化胰島素B鏈前體離子的碎片離子。在一些相關實施方案中，來自每種前體離子的碎片離子包括選自m/z為345.0±0.5和226.2±0.5的離子的離子。在第二方面，本文提出的某些方法利用高分辨率/高精度質譜法來測定樣品中胰島素的量。在利用高分辨率/高精度質譜法的一些實施方案中，所述方法包括：(a)在適合生成多電荷胰島素離子的條件下，使來自樣品的胰島素經受電離源，其中可通過質譜法檢測胰島素離子；以及(b)通過高分辨率/高精度質譜法測定一種或多種多電荷胰島素離子的量。在這些實施方案中，步驟(b)中測定的一種或多種離子的量與樣品中胰島素的量有關。在一些實施方案中，在10,000或更高的FWHM和50ppm的質量精度下進行高分辨率/高精度質譜法。在一些實施方案中，用高分辨率/高精度飛行時間(TOF)質譜儀進行所述高分辨率/高精度質譜法。在一些實施方案中，電離條件包括在酸性條件下電離胰島素。在一些相關實施方案中，酸性條件包括在電離之前用甲酸處理所述樣品。在一些實施方案中，多電荷胰島素離子選自4+、5+和6+電荷胰島素離子。在一些實施方案中，一種或多種呈6+電荷態(tài)的胰島素離子包括m/z在約968.0±1.5范圍內的一種或多種離子。一種或多種呈6+電荷態(tài)的胰島素離子包括選自m/z為968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、969.12±0.1、969.28±0.1、969.45±0.1、969.61±0.1的離子的一種或多種離子；例如m/z為968.95±0.1的離子。在一些實施方案中，一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括m/z在約1162.5±1.0范圍內的一種或多種離子。在一些實施方案中，一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括選自m/z為1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1和1163.32±0.1的離子的一種或多種離子；例如m/z為1162.54±0.1的離子。在一些實施方案中，一種或多種呈4+電荷態(tài)的胰島素離子包括m/z在約1452.9±0.8范圍內的一種或多種離子。在本文所述任何方法中，樣品可包括生物樣品。在一些實施方案中，生物樣品可包括生物流體，例如尿、血漿或血清。在一些實施方案中，生物樣品可包括來自人類的樣品；例如來自成年男性或女性，或青少年男性或女性，其中青少年在18歲以下，15歲以下，12歲以下或10歲以下?？煞治鋈祟悩悠芬栽\斷或監(jiān)測疾病狀態(tài)或病狀，或監(jiān)測疾病狀態(tài)或病狀治療的療效。在一些相關實施方案中，本文所述方法可用于測定取自人類時的生物樣品中胰島素的量。在利用串聯(lián)質譜法的實施方案中，可通過本領域已知的任何方法進行串聯(lián)質譜法，包括例如多反應監(jiān)測、前體離子掃描或產物離子掃描。在一些實施方案中，串聯(lián)質譜法包括將前體離子破碎成一種或多種碎片離子。在測定兩種或更多種碎片離子的量的實施方案中，可使所述量進行本領域已知的任何數(shù)學運算以便使測量的離子量與樣品中胰島素的量相關。例如，可對兩種或更多種碎片離子的量求合以作為測定樣品中胰島素的量的一部分。在本文所述任何方法中，可在電離之前通過高效液相色譜法(HPLC)從樣品中純化目標分析物(例如，胰島素、經化學修飾或未經修飾的胰島素A鏈或經化學修飾或未經修飾的胰島素B鏈)。在本文所述任何方法中，可通過萃取技術，例如使樣品經由固相萃取(SPE)柱，從樣品中純化目標分析物。在一些實施方案中，萃取技術不是免疫純化技術。具體地，在一些實施方案中，SPE柱不是免疫親和柱。在一些實施方案中，在所述方法的任何時候都不適用免疫純化。在一些實施方案中，可以在線方式進行萃取技術和HPLC以允許自動化樣品處理和分析。在一些實施方案中，在大于或等于約10,000，例如大于或等于約15,000，例如大于或等于約20,000，例如大于或等于約25,000的分辨力(FWHM)下進行高分辨率/高精度質譜法。在一些實施方案中，在小于或等于約50ppm，例如小于或等于約20ppm，例如小于或等于約10ppm，例如小于或等于約5ppm，例如小于或等于約3ppm的精度下進行高分辨率/高精度質譜法。在一些實施方案中，在大于或等于約10,000的分辨力(FWHM)和小于或等于約50ppm的精度下進行高分辨率/高精度質譜法。在一些實施方案中，分辨力大于約15,000而精度小于或等于約20ppm。在一些實施方案中，分辨力大于或等于約20,000而精度小于或等于約10ppm；優(yōu)選分辨力大于或等于約20,000而精度小于或等于約5ppm，例如小于或等于約3ppm。在一些實施方案中，用軌道阱質譜儀、飛行時間(TOF)質譜儀或傅里葉變換離子回旋共振質譜儀(有時稱為傅里葉變換質譜儀)進行高分辨率/高精度質譜法。在一些實施方案中，可通過高分辨率/高精度質譜法檢測的所述一種或多種胰島素離子是選自m/z在約1452.9±0.8、1162.5±1和968.8±1.5范圍內的離子的一種或多種離子。這些范圍內的離子分別對應帶4+、5+和6+電荷的胰島素離子。帶這些電荷的單一同位素離子主要屬于所提及的m/z范圍。然而，低豐度天然同位素變體可能出現(xiàn)在這些范圍外。1162.5±1范圍內的胰島素離子優(yōu)選包括m/z為約1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1、1163.32±0.1的胰島素離子；例如m/z為1162.54±0.1的離子。968.8±1.5范圍內的胰島素離子優(yōu)選包括m/z為約968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、969.12±0.1、969.28±0.1、969.45±0.1、969.61±0.1的胰島素離子；例如m/z為968.95±0.1的離子。在一些實施方案中，將通過質譜法檢測的一種或多種胰島素離子的量與樣品中胰島素蛋白的量聯(lián)系起來包括與內標比較；例如人或非人類胰島素蛋白?？扇芜x地用同位素標記內標。在本文提出的任何方法中，樣品可包括生物樣品；優(yōu)選體液樣品，包括(例如)血漿或血清。可在正電子模式下進行質譜法(串聯(lián)或高分辨率/高精度)?；蛘?，可在負電子模式下進行質譜法。可使用各種電離源，包括(例如)大氣壓化學電離(APCI)或電噴霧電離(ESI)源電離胰島素。在一些實施方案中，在正電子模式下通過ESI電離胰島素和/或經化學修飾或未經修飾的胰島素A鏈或胰島素B鏈。在本文提出的任何方法中，可在樣品中提供可單獨檢測的內標，也測定了樣品中內標的量。在利用可單獨檢測的內標的實施方案中，電離樣品中存在的全部或部分目標分析物和內標以生成在質譜儀中可檢測的多種離子，并通過質譜法檢測各自生成的一種或多種離子。在這些實施方案中，可通過與檢測的內標離子的量作比較，使目標分析物生成的離子的存在或量與樣品中目標分析物的存在或量相關?；蛘?，可通過與一種或多種外部參考標準作比較測定樣品中胰島素的量。示例性外部參考標準包括用人或非人類胰島素、合成胰島素類似物或其同位素標記變體示蹤的空白血漿或血清。在一些實施方案中，所述方法能夠測定樣品中在約10μIU/mL至500μIU/mL(等于約60pmol/L至3000pmol/L，或約0.35ng/mL至17.4ng/mL)，包括10μIU/mL和500μIU/mL范圍內的水平的胰島素的量。如本文所使用，除非另有說明，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數(shù)個指示物。因此，例如，提到“一種蛋白質”包括多個蛋白質分子。如本文所使用，術語“純化”和“富集(enriching)”并不指從樣品中去除除目標分析物外的所有物質。相反，這些術語指使一種或多種目標分析物的量相對于樣品中可能干擾目標分析物的檢測的其它組分富集的過程。通過各種方式純化樣品可使一種或多種干擾物質，例如可能或可能不干擾通過質譜法檢測所選母離子或子離子的一種或多種物質相對減少。當使用該術語時，相對減少不需要通過純化完全去除待純化材料中與目標分析物一起存在的任何物質。如本文所使用，術語“免疫純化”指利用抗體，包括多克隆或單克隆抗體，使所述一種或多種目標分析物富集的純化過程?？墒褂帽绢I域眾所周知的免疫純化方法進行免疫純化。通常，免疫純化過程利用結合、偶聯(lián)或以其它方式附著于載體，例如柱、孔、管、凝膠、膠囊、顆粒等的抗體。如本文所使用的免疫純化包括但不限于本領域中常稱為免疫沉淀的過程，以及本領域中常稱為親和色譜法或免疫親和色譜法的過程。如本文所使用，術語“免疫顆?！敝赣锌贵w結合、偶聯(lián)或以其它方式附著于其表面(顆粒上和/或內)的膠囊、珠粒、凝膠顆粒等。在某些優(yōu)選實施方案中，免疫顆粒為瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠。在替代性優(yōu)選實施方案中，免疫顆粒包括玻璃珠、塑料珠或硅珠或硅膠。如本文所使用，術語“抗胰島素抗體”指對胰島素有親和力的任何多克隆或單克隆抗體。在各個實施方案中胰島素抗體對除胰島素外的化學物類的特異性可能不同；例如在某些優(yōu)選實施方案中抗胰島素抗體對胰島素有特異性，因此對除胰島素外的其它化學物類有很少或沒有親和力，而在其它優(yōu)選實施方案中抗胰島素抗體無特異性，因此結合除胰島素外的某些化學物類。如本文所使用，術語“樣品”指可能含有目標分析物的任何樣品。如本文所使用，術語“體液”指可從各個體內分離的任何流體。例如，“體液”可包括血液、血漿、血清、膽汁、唾液、尿、眼淚、汗等。在優(yōu)選實施方案中，樣品包括來自人類的體液樣品；優(yōu)選血漿或血清。如本文所使用，術語“固相萃取”或“SPE”指由于溶于或懸浮于溶液(即，流動相)中的組分對溶液通過或圍繞的固體(即，固相)的親和力，使化學混合物分離成組分的過程。在一些情況下，當流動相通過或圍繞固相時，固相可保留流動相不需要的組分，導致對流動相中分析物的純化。在其它情況下，固相可保留分析物，使流動相不需要的組分通過或圍繞固相。在這些情況下，然后使用第二流動相將保留的分析物從固相洗脫做進一步處理或分析。SPE，包括TFLC，可通過單一或混合模式機制操作?；旌夏Ｊ綑C制利用相同柱中的離子交換和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可表現(xiàn)出強的陰離子交換和疏水保留；或可表現(xiàn)出強的陽離子交換和疏水保留。通常，SPE柱填充材料對分析物的親和力可能是由于多種機制中的任一種，例如一種或多種化學相互作用或免疫親和性相互作用。在一些實施方案中，不使用免疫親和柱填充材料進行胰島素的SPE。即，在一些實施方案中，用不是免疫親和柱的SPE柱從樣品中純化胰島素。如本文所使用，術語“色譜法”指由于化學實體在固定液或固相周圍或上面流動時，化學實體的差異性分布，使液體或氣體攜帶的化學混合物分離成組分的過程。如本文所使用，術語“液相色譜法”或“LC”指流體均勻地滲過細碎物質柱或滲過毛細管通道時，選擇性阻滯流體溶液的一種或多種組分的過程。阻滯是由該流體相對于固定相移動時，混合物組分分布于(多個)固定相和體相流體(即，流動相)之間引起?！耙合嗌V法”的實例包括反相液相色譜法(RPLC)、高效液相色譜法(HPLC)和湍流液相色譜法(TFLC)(有時稱為高湍流液相色譜法(HTLC)或高通量液相色譜法)。如本文所使用，術語“高效液相色譜法”或“HPLC”(有時稱為“高壓液相色譜法”)指通過在壓力下迫使流動相通過固定相，通常為密集填充柱，提高分離程度的液相色譜法。如本文所使用，術語“湍流液相色譜法”或“TFLC”(有時稱為高湍流液相色譜法或高通量液相色譜法)指利用通過柱填充物的測定材料湍流作為進行分離的基礎的一種色譜法形式。已經應用TFLC在通過質譜法分析之前制備含有兩種不知名藥物的樣品。參見例如，Zimmer等，JChromatogrA854:23-35(1999)；同樣參見美國專利No.5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其進一步對TFLC進行了闡述。本領域的普通技術人員理解“湍流”。當流體緩慢平穩(wěn)地流動時，將所述流稱為“層流”例如，以低流速穿過HPLC柱的流體為層狀。在層流中，流體顆粒的運動有序配合通常呈大體直線移動的顆粒。在更快的速率下，水的慣性克服流體摩擦力并導致湍流。未接觸不規(guī)則邊界的流體“超過”因摩擦減緩或因粗糙表面偏離的流體。當流體湍急地流動時，流體呈旋轉渦流流動(漩渦)，“拖曳力”比所述流為層狀時更大。當流體流為層狀或湍流時，許多參考可用于幫助測定(例如，TurbulentFlowAnalysis:MeasurementandPrediction,P.S.Bernard&J.M.Wallace,JohnWiley&Sons,Inc.,(2000)；AnIntroductiontoTurbulentFlow,JeanMathieu&JulianScott,CambridgeUniversityPress(2001))。如本文所使用，術語“氣相色譜法”或“GC”指汽化樣品混合物并注入穿過含有由液體或固體微粒構成的固定相的柱的運載氣體流(如氮氣或氦氣)中，并且根據(jù)化合物對固定相的親和力分離成器組成化合物的色譜法。如本文所使用，術語“大顆粒柱”或“萃取柱”指含有平均粒徑大于約50μm的色譜法。如該上下文中所使用，術語“約”指±10%。如本文所使用，術語“分析柱”指具有足夠色譜板以實現(xiàn)樣品中從柱上洗脫的物質的分離，足以允許測定分析物的存在或量的色譜柱。常常將此類柱與“萃取柱”加以區(qū)別，“萃取柱”具有從非保留物質中分離或萃取保留物質以便獲得純化樣品做進一步分析的通用用途。如該上下文中所使用，術語“約”指±10%。在一個優(yōu)選實施方案中，分析柱含有直徑約5μm的顆粒。如本文所使用，如在“在線自動化形式”或“在線萃取”中使用的術語“在線(on-line)”和“在線(inline)”指不需要操作員干預而進行的過程。相反，如本文所使用的術語“離線(off-line)”指需要操作員人工干預的過程。因此，如果使樣品沉淀，然后將上清液手動加載至自動取樣器中，沉淀和加載步驟與后續(xù)步驟離線。在所述方法的各個實施方案中，可以在線自動化形式進行一個或多個步驟。如本文所使用，術語“質譜法”或“MS”指通過其質量鑒定化合物的分析技術。MS指基于其質荷比或“m/z”過濾、檢測和測量的方法。MS技術通常包括(1)電離化合物以形成帶電化合物；和(2)檢測帶電化合物的分子量并計算質荷比?？赏ㄟ^任何適合方式電離并檢測化合物?！百|譜儀”通常包括離子發(fā)生器、質量分析器和離子檢測器。一般而言，電離一個或多個目標分子，并且隨后將離子引入質譜儀中，其中由于磁場和電場的組合，離子在空間上跟隨取決于質量(“m”)和電荷(“z”)的途徑。參見例如，標題為“MassSpectrometryFromSurfaces”的美國專利No.6,204,500；標題為“MethodsandApparatusforTandemMassSpectrometry”的美國專利No.6,107,623；標題為“DNADiagnosticsBasedOnMassSpectrometry”的美國專利No.6,268,144；標題為“Surface-EnhancedPhotolabileAttachmentAndReleaseForDesorptionAndDetectionOfAnalytes”的美國專利No.6,124,137；Wright等，ProstateCancerandProstaticDiseases1999,2:264-76；和Merchant和Weinberger，Electrophoresis2000,21:1164-67。如本文所使用，“高分辨率/高精度質譜法”指用能夠以足夠精確性和精度測量帶電物類的質荷比以確認獨特化學離子的質量分析器進行的質譜法。當來自該離子的各個同位素峰易于辨別時，對于離子而言可能確認獨特化學離子。確認獨特化學離子所必需的特定分辨力和質量精度隨離子的質量和電荷態(tài)變化。如本文所使用，術語“分辨力”或“分辨力(FWHM)”(在本領域中也稱為“m/Δm50%”)指觀察到的質荷比除以50%最大高度的質量峰寬度(半峰全寬，“FWHM”)。圖1A-C中說明了分辨力差異的影響，其示出了m/z為約1093的離子的理論質譜。圖1A示出了來自分辨力為約3000(常規(guī)四極質量分析器的典型操作條件)的質量分析器的理論質譜。如圖1A所見，各個同位素峰不可辨別。通過比較，圖1B示出了來自分辨力為約10,000的質量分析器的理論質譜，各個同位素峰清晰可辨別。圖1C示出了來自分辨力為約12,000的質量分析器的理論質譜。在這個最高分辨力下，各個同位素峰包含小于1%的自基線的貢獻。如本文所使用，關于質譜法的“獨特化學離子”指具有單一原子構成的單離子。單離子可能帶單個或多個電荷。如本文所使用，關于質譜法的“精度”(或“質量精度”)指儀器響應與調查離子的真實m/z的可能偏差。通常將精度表示為百萬分之幾(ppm)。圖2A-D說明了質量精度差異的影響，其示出了對于m/z為1093.52094的理論峰值而言，測得m/z和實際m/z之間的可能差異界限。圖2A示出了120ppm精度下測得m/z的可能范圍。相反，圖2B示出了50ppm精度下測得m/z的可能范圍。圖2C和2D示出了20ppm和10ppm精度下測得m/z甚至更窄的可能范圍。可在能夠以大于10,000、15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更高的FWHM進行質量分析的儀器上進行本發(fā)明的高分辨率/高精度質譜法。同樣，可在能夠以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更低的精度進行質量分析的儀器上進行本發(fā)明的方法。有這些性能特征的儀器可并入某些軌道阱質量分析器、飛行時間(“TOF”)質量分析器或傅里葉變換離子回旋共振質量分析器。在優(yōu)選實施方案中，用包括軌道阱質量分析器或TOF質量分析器的儀器進行所述方法。術語“軌道阱”描述了由桶形外電極和同軸內電極組成的離子阱。將離子切線注入電極之間的電場中并且因為當離子沿同軸內電極軌道運行時，離子和電極之間的靜電相互作用被離心力平衡而捕獲離子。當離子沿同軸內電極軌道運行時，捕獲離子的軌跡在相對于離子質荷比的諧振頻率下沿中心電極的軸振蕩。檢測軌道振蕩頻率允許將軌道阱用作具有高精度(低至1-2ppm)和高分辨力(FWHM)(高達約200,000)的質量分析器。在以引用方式整體并入本文的美國專利No.6,995,364中詳細描述了基于軌道阱的質量分析器。已經報道使用軌道阱分析器進行各種分析物的定性和定量分析。參見例如，美國專利申請公布No.2008/0118932(2007年11月9日提交)；等，RapidCommun.MassSpectrom.，2008，22:477-485；LeBreton等，RapidCommun.MassSpectrom.，2008，22:3130-36；Thevis等，MassSpectrom.Reviews，2008，27:35-50；Thomas等，J.MassSpectrom.，2008，43:908-15；Schenk等，BMCMedicalGenomics，2008，1:41；和Olsen等，NatureMethods，2007，4:709-12。如本文所使用，術語“在負離子模式下操作”指生成并檢測負離子的那些質譜法。如本文所使用，術語“在正離子模式下操作”指生成并檢測正離子的那些質譜法。在優(yōu)選實施方案中，在正離子模式下進行質譜法。如本文所使用，術語“電離”指生成具有等于一個或多個電子單位的凈電荷的分析物離子的過程。負離子是具有一個或多個電子單位的凈負電荷的離子，而正離子是具有一個或多個電子單位的凈正電荷的離子。如本文所使用，術語“電子電離”或“EI”指氣相或汽相中的目標分析物與電子流相互作用的方法。電子與分析物的碰撞生成然后可進行質譜技術的分析物離子。如本文所使用，術語“化學電離”或“CI”指試劑氣體(例如氨)經受電子碰撞，并且通過試劑氣體離子和分析物分子的相互作用形成分析物離子的方法。如本文所使用，術語“快原子轟擊”或“FAB”指一束高能原子(常常為Xe或Ar)碰撞非揮發(fā)性樣品，解吸附并電離樣品中所含的分子的方法。將試樣溶于粘性液體基質，例如甘油、硫代甘油、間硝基芐醇、18-冠-6-冠醚、2-硝基苯基辛基醚、環(huán)丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。為化合物或樣品選擇適當?shù)幕|是經驗性過程。如本文所使用，術語“基質輔助激光解吸電離”或“MALDI”指將非揮發(fā)性樣品暴露于激光照射，通過各種電離途徑，包括光致電離、質子化、去質子化和集團衰變，解吸附并電離樣品中的分析物的方法。對于MALDI而言，將樣品與吸能基質混合，促進分析物分子的解吸附。如本文所使用，術語“表面增強激光”解吸電離”或“SELDI”指將非揮發(fā)性樣品暴露于激光照射，通過各種電離途徑，包括光致電離、質子化、去質子化和集團衰變，解吸附并電離樣品中的分析物的另一種方法。對于SELDI而言，通常使樣品與優(yōu)先保留一種或多種目標分析物的表面結合。與MALDI一樣，這個過程也可采用吸能材料促進電離。如本文所使用，術語“電噴霧電離”或“ESI”指使溶液沿末端施加了高正或負電位的長度較短的毛細管通過的方法。使到達管末端的溶液蒸發(fā)(霧化)成于溶劑蒸汽中非常小的溶液液滴射流或噴霧。這種霧滴流過蒸發(fā)室。當液滴變小時，電氣表面電荷密度增大，直至相同電荷之間的自然排斥引起離子以及中性分子被釋放。如本文所使用，術語“大氣壓化學電離”或“APCI”指類似于ESI的質譜法；然而，APCI通過在大氣壓下血漿內發(fā)生的離子-分子反應生成離子。通過噴霧毛細管和對電極之間的放電保持血漿。然后通常通過使用一組差動泵送撇渣器階段將離子萃取至質量分析器中?？墒褂媚媪鞯母稍镱A熱N2氣體提高溶劑的去除。APCI中的氣相電離可比ESI分析低極性物類更有效。如本文所使用，術語“大氣壓光致電離”或“APPI”指分子M電離的機制是光子吸收和電子發(fā)射以形成分子離子M+的質譜法形式。因為光子能量通常僅高于電離電位，所以分子離子不易受解離影響。在許多情況下，分析樣品可能不需要色譜法，從而節(jié)約了大量時間和費用。在水蒸汽或質子溶劑存在下，分子離子可吸取H形成MH+。這往往在M具有高質子親和力時發(fā)生。因為M+和MH+的總和為常數(shù)，所以這并不影響定量精度。通常觀察到質子溶劑中的藥物化合物為MH+，然而非極性化合物，例如萘或睪酮通常形成M+。參見例如，Robb等，Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。如本文所使用，術語“電感耦合等離子體”或“ICP”指在足夠高的溫度下，樣品與部分電離氣體相互作用，以致大部分元素分裂為原子并電離的方法。如本文所使用，術語“場解吸”指將非揮發(fā)性試樣置于電離表面，并使用強電場生成分析物離子的方法。如本文所使用，術語“解吸”指將分析物從分析物的表面和/或入口移至氣相中。激光解吸熱解吸是其中通過激光脈沖將含有分析物的樣品熱解吸至氣相中的技術。激光打中具有金屬底座的特制96孔板的背面。激光脈沖加熱底座并且熱量使樣品轉移至氣相中。然后將氣相樣品吸入質譜儀中。如本文所使用，術語“選擇性離子監(jiān)測”是質譜儀的一種檢測模式，其中僅檢測質量范圍相對狹窄，通常約一個質量單位的離子。如本文所使用，術語“多反應模式”，有時稱為“選擇反應監(jiān)測”，是質譜儀的一種檢測模式，其中選擇性檢測前體離子和一種或多種碎片離子。如本文所使用，術語“量化下限”、“定量下限”或“LLOQ”指測量在數(shù)量上變得有意義的點。在這個LOQ的分析物反應可識別、不連續(xù)并且可重現(xiàn)，相對標準偏差(RSD%)小于20%并且精度為85%-115%。如本文所使用，術語“檢測限”或“LOD”指測量值大于與之相關的不確定度的點。LOD是值超過與之測量相關的不準確度的點并且定義為零濃度下平均數(shù)RSD的3倍。如本文所使用，體液樣品中分析物的“量”通常指反映樣品體積中可檢測的分析物質量的絕對值。然而，量也涵蓋與另一分析物量相比的相對量。例如，樣品中分析物的量可為大于樣品中一般存在的分析物的對照或正常水平的量。如本文所使用，關于定量測量(不高考離子質量的測量)的術語“約”指指示值加上或減去10%。在測定指定分析物的質量中，質譜儀可稍有變化。在離子質量或離子質/荷比上下文中的術語“約”指+/-0.50個原子質量單位。上述本發(fā)明的概述是非限制性的，通過以下對本發(fā)明的詳細描述和權利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將顯而易見。附圖詳述圖1A-C示出了通過分辨力為約3000(圖1A)、約10,000(圖1B)和約12,000(圖1C)的質量分析器分析的m/z為約1093的離子的理論質譜。圖2A-D示出了在為1093.52094的m/z下，在120ppm質量精度(圖2A)、50ppm質量精度(圖2B)、20ppm質量精度(圖2C)和10ppm質量精度(圖2D)下，儀器反應與研究理論峰值的離子的真實m/z的可能偏差。圖3A和B分別示出了在酸性和堿性條件下，通過ESI離子正離子模式電離人胰島素收集的示例光譜。實施例3中描述了詳情。圖4A示出了用QTOF質譜儀生成的人胰島素約900-1200m/z范圍的示例光譜。圖4B示出了用QTOF質譜儀生成的來自反萃血清樣品基質的污染物峰。實施例4中描述了詳情。圖5A示出了用QTOF質譜儀生成的人胰島素約1154-1177m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。圖5B示出了約1159-1166m/z范圍的展開圖。實施例4中描述了詳情。圖6A示出了用QTOF質譜儀生成的人胰島素約964-973m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。圖6B示出了約967-971m/z范圍的展開圖。實施例4中描述了詳情。圖7示出了用胰島素高分辨率/高精度MS測量的示蹤模擬血清標準中人胰島素定量的線性圖線。實施例4中描述了詳情。圖8示出了用胰島素高分辨率/高精度MS測量的示蹤反萃血清標準中人胰島素定量的線性圖線。實施例4中描述了詳情。圖9示出了顯示生成呈5+和6+電荷態(tài)的人胰島素的串聯(lián)質譜Q1掃描。實施例5中描述了詳情。圖10示出了顯示來自破碎呈6+電荷態(tài)的人胰島素前體離子的產物離子掃描。實施例5中討論了詳情。圖11示出了顯示來自破碎呈5+電荷態(tài)的人胰島素前體離子的產物離子掃描。實施例5中討論了詳情。圖12示出了在不同碰撞能下破碎6+和5+人胰島素前體離子生成的選擇碎片離子的相對強度。實施例5中討論了詳情。圖13示出了顯示兩種可能的人胰島素A鏈前體離子(呈2+和3+電荷態(tài))和兩種可能的人胰島素B鏈前體離子(呈3+和4+電荷態(tài))的復合光譜。實施例6中討論了詳情。圖14示出了顯示生成呈3+、4+和5+電荷態(tài)的可能人胰島素B鏈前體離子的串聯(lián)質譜Q1掃描。實施例6中描述了詳情。圖15示出了在不同碰撞能下破碎3+人胰島素A鏈前體離子生成的選擇碎片離子的相對強度。實施例6中討論了詳情。圖16示出了來自破碎呈4+電荷態(tài)的人胰島素B鏈前體離子的產物離子掃描。實施例6中討論了詳情。圖17示出了來自破碎呈3+電荷態(tài)的人胰島素B鏈前體離子的產物離子掃描。實施例10中討論了詳情。圖18示出了在不同碰撞能下破碎3+人胰島素B鏈前體離子生成的選擇碎片離子的相對強度。實施例10中討論了詳情。圖19示出了用于通過人胰島素B鏈的串聯(lián)質譜法評估患者血清樣品中人胰島素的LLOQ的圖。實施例12中討論了詳情。圖20示出了用人胰島素B鏈的串聯(lián)質譜法測量的示蹤反萃血清樣品中人胰島素定量的線性圖線。實施例13中描述了詳情。發(fā)明詳述描述了測定樣品中胰島素的量的方法。更具體地，描述了檢測并量化樣品中的胰島素的質譜法。所述方法可利用固相萃取(SPE)和/或液相色譜法(LC)，進行所選分析物的純化，與質譜法(MS)相結合，從而通過檢測并量化樣品中的胰島素的測定系統(tǒng)。優(yōu)選實施方案特別適合應用于大型臨床實驗室進行自動化胰島素量化測定。適合用于本發(fā)明方法中的試樣包括可能含有目標分析物的任何試樣。在一些優(yōu)選實施方案中，樣品為生物樣品；即，從任何生物來源，例如動物、細胞培養(yǎng)物或器官培養(yǎng)物等獲得的樣品。在某些優(yōu)選實施方案中，從哺乳動物，例如狗、貓、馬等獲得樣品。特別優(yōu)選的哺乳動物為靈長類動物，最優(yōu)選男性或女性。優(yōu)選樣品包括體液，例如血液、血漿、血清、唾液、腦脊髓液或組織樣品；優(yōu)選血漿和血清。例如，此類樣品可從患者獲得；即，自身處于臨床環(huán)境下進行疾病或病狀的診斷、預后或治療的活著的男人或女人。在樣品包括生物樣品的實施方案中，當樣品從生物來源獲得時，可用所述方法測定樣品中胰島素的量。本發(fā)明還涵蓋用于胰島素定量測定的試劑盒。用于胰島素定量測定的試劑盒可包括包含本文提供的組合物的試劑盒。例如，試劑盒可包括包裝材料和測定量的同位素標記內標，量足以進行至少一次測定。通常，試劑盒還將包括以有形形式記錄(例如，含于紙或電子媒介上)的使用包裝試劑用于胰島素定量測定的說明書。用于本發(fā)明實施方案中的校準和QC混合血清優(yōu)選使用與預期樣品基質相似的基質制備，條件是基本上不存在胰島素。質譜分析的樣品制備在對質譜分析的準備中，可通過本領域已知的各種方法，包括(例如)液相色譜法、過濾、離心、薄層色譜法(TLC)、電泳(包括毛細管電泳)、親和分離(包括免疫親和分離)、萃取法(包括乙酸乙酯或甲醇萃取)和使用離液劑或以上的組合等使胰島素相對于樣品中的一種或多種其它組分富集?？稍谫|譜分析之前使用的一種樣品純化方法是在柱填充材料可逆性保留目標分析物被，而不保留一種或多種其它物質的條件下，將樣品施加到固相萃取(SPE)柱上。這種技術中，可采用柱保留目標分析物的第一流動相條件，并且隨后可采用第二流動相條件，以便一旦洗掉未保留的物質就將保留的物質從柱上去除。在一些實施方案中，樣品中的胰島素可被可逆性保留在具有包含烷基結合表面的填充材料的SPE柱上。例如，在一些實施方案中，在質譜分析之前可使用C-8在線SPE柱(例如來自Phenomenex,Inc.的OasisHLB在線SPE柱/盒(2.1mm×20mm)或等效物)富集胰島素。在一些實施方案中，用HPLC級0.2%含水甲酸作為洗滌液并使用0.2%于乙腈中的甲酸作為洗脫液進行SPE柱的使用。在一些實施方案中，不通過免疫親和技術純化胰島素。這些實施方案中的一些利用SPE柱。在這些實施方案中，SPE柱不是免疫親和柱。在其它實施方案中，所述方法包括在質譜分析之前免疫純化胰島素?？墒褂帽绢I域眾所周知的任何免疫純化方法進行免疫純化步驟。常常免疫純化過程利用結合、偶聯(lián)或附著于載體，例如柱、孔、管、膠囊、顆粒等的抗體。通常，免疫純化方法包括(1)用抗體培養(yǎng)含有目標分析物的樣品，以致分析物與抗體結合，(2)進行有一個或多個洗滌步驟，和(3)將分析物從抗體上洗脫。在某些實施方案中，用溶液中的游離抗體進行免疫純化的培養(yǎng)步驟，隨后抗體在洗滌步驟之前結合或附著于固體表面。在某些實施方案中，這可使用為抗胰島素抗體的一次抗體和附著于對一次抗胰島素抗體有親和力的固體表面的二次抗體完成。在替代實施方案中，在培養(yǎng)步驟之前，一次抗體與固體表面結合。適當?shù)妮d體包括但不限于管、載玻片、柱、珠粒、膠囊、顆粒、凝膠等。在一些優(yōu)選實施方案中，載體為多孔板，例如96孔板、384孔板等。在一些實施方案中，載體為瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠或凝膠。有許多本領域眾所周知的方法，通過所述方法抗體(例如，胰島素抗體或二次抗體)可結合、附著、固定或偶聯(lián)于載體上，例如，共價或非共價鍵吸附、親和結合、離子鍵等。在一些實施方案中，使用CNBr偶聯(lián)抗體，例如可使抗體與CNBr活化瓊脂糖凝膠偶聯(lián)。在其它實施方案中，通過抗體結合蛋白，例如蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或蛋白質L使抗體附著于載體上。免疫純化方法的洗滌步驟通常包括洗滌載體，以致胰島素保持與載體上的抗胰島素抗體結合。免疫純化的洗脫步驟通常包括添加破壞胰島素與抗胰島素抗體的結合的溶液。示例性洗脫液包括有機溶液、鹽溶液和高或低pH溶液?？稍谫|譜分析之前使用的另一種樣品純化方法是液相色譜法(LC)。在液相色譜技術中，可通過在流動性條件下將樣品施加到色譜分析柱上純化分析物，其中目標分析物在與一種或多種其它物質相比的差異速率下洗脫。此類過程可使所述量的一種或多種目標分析物相對于樣品的一種或多種其它組分富集。某些液相色譜法，包括HPLC，依賴于相對緩慢的層流技術。傳統(tǒng)HPLC分析依賴于柱填充物，其中通過柱的層流樣品是從樣品中分離目標分析物的基礎。技術人員將理解，在這種柱中的分離是分隔過程并且可選擇適合與C肽一起使用的LC(包括HPLC)儀器和柱。色譜分析柱通常包括促進化學組成部分的分離(即，分餾)的介質(即，填充材料)。介質可包括細微顆粒。顆粒通常包括與各種化學組成部分相互作用以促進化學組成部分的分離的結合表面。一種適合的結合表面為疏水性結合表面，例如烷基結合表面或氰基結合表面。烷基結合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18結合的烷基。在一些實施方案中，色譜分析柱為整體式C-18柱。色譜分析柱包括接收樣品的入口和排出包括分餾樣品的流出物的出口?？上蛉肟谥苯庸┙o樣品，或從SPE柱，例如在線SPE柱或TFLC柱供給。在一些實施方案中，可在SPE柱和或HPLC柱前面使用在線過濾器以在樣品到達SPE和/或TFLC和/或HPLC柱之前去除樣品中的微粒和磷脂。在一個實施方案中，可將樣品施加到LC柱的入口處，用溶劑或溶劑混合物洗脫，并且在出口處排出?？蛇x擇不同溶劑模式洗脫目標分析物。例如，可使用梯度模式、恒組成模式或多型(即混合)模式進行液相色譜法。色譜法期間，物質的分離受變量影響，例如洗脫液(也稱為“流動相”)、洗脫模式、梯度條件、溫度等的選擇。在一些實施方案中，用HPLC富集樣品中的胰島素?？捎谜w式C-18柱色譜系統(tǒng)，例如來自PhenomenexInc.的Onyx整體式C-18柱(50×2.0mm)或等效物進行這種HPLC。在某些實施方案中，使用作為溶劑A的HPLC級0.2%含水甲酸和作為溶劑B的于乙腈中的0.2%甲酸進行HPLC。通過精心選擇閥門和連接器管道，需要時可連接兩個或多個色譜柱，以使材料從一個柱轉到下一個柱，無需任何手動步驟。在優(yōu)選實施方案中，可通過預先編程為進行必需步驟的計算機控制閥門和管道的選擇。最優(yōu)選，還以這種在線方式將色譜系統(tǒng)連接到檢測器系統(tǒng)，例如MS系統(tǒng)。因此，操作員可將一盤樣品放在自動取樣器中，在計算機控制下進行剩余操作，導致純化并分析選擇的所有樣品。在一些實施方案中，TFLC可用于在質譜分析之前純化胰島素。在此類實施方案中，可使用捕獲分析物的TFLC柱萃取樣品。然后洗脫分析物并在線轉移到分析HPLC柱中。例如，可用具有大粒徑(50μm)填充物的TFLC萃取盒實現(xiàn)樣品萃取。然后在質譜分析之前，可將從這個柱上洗脫的樣品在線轉移至HPLC分析柱上進行進一步純化。因為可以自動化方式將這些色譜過程中牽涉的步驟連接起來，所以可將分析物純化期間對操作員牽涉的需要減到最少。這個特征可導致時間和成本的節(jié)約，并且消除操作員錯誤的機會。在一些實施方案中，可并行使用以上一種或多種純化技術純化胰島素以允許同時處理多種樣品。在一些實施方案中，采用的純化技術不包括免疫純化技術，例如免疫親和色譜法。通過質譜法檢測并定量胰島素使用包括用于電離分餾樣品并產生帶電分子做進一步分析的離子源的質譜儀進行質譜分析。在各個實施方案中，可通過技術人員已知的任何方法電離胰島素。例如，可通過電子電離、化學電離、電噴霧電離(ESI)、質子電離、大氣壓化學電離(APCI)、光致電離、大氣壓光致電離(APPI)、激光二極管熱解吸(LDTD)、快原子轟擊(FAB)、液態(tài)二次電離(LSI)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)、場電離、場解吸、熱噴霧/等離子噴霧電離、表面增強激光解吸電離(SELDI)、電感耦合等離子體(ICP)和粒子束電離進行胰島素的電離。技術人員將理解，可基于待測分析物、樣品類型、檢測器類型、正與負模式的選擇等確定電離方法的選擇，可在正或負模式下電離胰島素。在優(yōu)選實施方案中，可在正離子模式下通過ESI電離胰島素。通常在質譜技術中，在電離樣品之后，可分析由此產生的帶正電或負電的離子以測定質荷比(m/z)。測定m/z的各種分析器包括四極分析器、離子阱分析器、飛行時間分析器、傅里葉變換離子回旋共振質量分析器和軌道阱分析器。在Bartolucci等，RapidCommun.MassSpectrom.2000,14:967-73中描述了一些示例性離子阱方法?？墒褂脦追N檢測模式檢測離子。例如，即可使用選擇性離子監(jiān)測模式(SIM)檢測選擇離子，或可選地，可監(jiān)測由碰撞誘導解離或中性丟失引起的質量相變，例如，多反應監(jiān)測(MRM)或選擇反應監(jiān)測(SRM)。在一些實施方案中，使用四極分析器測定質荷比。在“四極”或“四極離子阱”儀器中，振蕩射頻場中的離子經歷與電極之間施加的DC電位、RF信號振幅和質/荷比成比例的力。可選擇電壓和振幅，以致僅僅具有特定質/荷比的離子沿四極長度移動，而使所有其它離子。因此，四極儀器可用作注入儀器中的離子的“濾質器”和“質量檢測器”。當離子與檢測器碰撞時，它們產生轉化為數(shù)字信號的電子脈沖。將所需數(shù)據(jù)轉發(fā)至計算機，計算機繪制收集離子計數(shù)與時間的圖。所得質量色譜圖與傳統(tǒng)HPLC-MS方法中生成的色譜圖類似?？蓽y量與特定離子相對應的峰下面積或此類峰值的振幅并且與目標分析物的量相關聯(lián)。在某些實施方案中，測量碎片離子和/或前體離子的曲線下面積或峰值振幅以測定胰島素的量?？墒褂眯蕵藴是€，基于內部或外部分子標準的一種或多種離子的峰值，將指定離子的相對豐度轉化為原始分析物的量?？赏ㄟ^“串聯(lián)質譜法”或“MS/MS”提高采用某些質譜分析器的MS技術的分辨率。在這種技術中，可在MS儀器中過濾由目標分子生成的前體離子(也稱為母離子)，隨后破碎驅離子以產生一個或多個碎片離子(也稱為子離子或產物離子)，然后在第二個MS過程中分析所述碎片離子。通過精心選擇前體離子，僅使某些分析物產生的離子通過到達破碎室，在那里與惰性氣體原子的碰撞產生碎片離子。因為在一系列指定電離/破碎條件下以可重現(xiàn)方式生成前體和碎片離子，所以MS/MS技術可提供極其強大的分析工具。例如，過濾/破碎的組合可用于消除干擾物質，并且可能在復合樣品，例如生物樣品中特別有用。在某些實施方案中，采用具有多個四極分析器的質譜儀(例如三級四極儀器)進行串聯(lián)質譜分析。在使用MS/MS技術的某些實施方案中，分離前體離子做進一步破碎，并且使用碰撞活化解離(CAD)由前體離子生成碎片離子做進一步檢測。在CAD中，前體離子通過與惰性氣體的碰撞獲得能量，隨后通過稱為“單分子分解”的過程破碎。必須在前體離子中存積足夠能量，以致由于振動能增大，可破壞離子中的某些鍵。在一些實施方案中，如下使用MS/MS檢測和/或量化樣品中的胰島素。通過首先使樣品經受SPE，然后經受液相色譜法，優(yōu)選HPLC使胰島素在樣品中富集；來自色譜分析柱的液體溶劑流進入MS/MS分析器的加熱噴霧器接口；并且在接口的加熱帶電管道內將溶劑/分析物混合物轉化為蒸汽。在這些過程期間，分析物(即，胰島素)電離。離子，例如前體離子，通過儀器口并且進入第一個四極。四極1和3(Q1和Q3)為濾質器，允許基于其質荷比(m/z)選擇離子(即，分別選擇Q1和Q3中的“前體”和“碎片”離子)。四極2(Q2)是碰撞室，在碰撞室內破碎離子。質譜儀的第一個四極(Q1)選擇具有胰島素離子的m/z的分子。使具有恰當m/z的前體離子進入碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的不合需要的離子與四極的側面碰撞并且被消除。進入Q2的前體離子與中性氣體分子(例如氬分子)碰撞并且破碎。使生成的碎片離子進入四極3(Q3)，在四極3中選擇碎片離子進行檢測。電離胰島素可產生多電荷前體離子(例如4+、5+、6+前體離子等)。電離條件，特別是電噴霧技術中利用的緩沖液的pH，嚴重影響生成的胰島素前體離子的同一性和量。例如，在酸性條件下，正電噴霧電離可能主要生成m/z分別為1162.5±0.5和968.5±0.5的5+和6+電荷胰島素前體離子。然而，在堿性條件下，正電噴霧電離可能主要生成m/z分別為1453.75±0.5和1162.94±0.5的4+和5+電荷胰島素前體離子。所述方法可利用酸性或堿性條件；優(yōu)選酸性條件。所述方法可包括在正或負離子模式下進行的MS/MS；優(yōu)選正離子模式。在某些實施方案中，電噴霧緩沖液為酸性并且Q1選擇用于m/z為約1162.5±0.5或968.5±0.5的胰島素前體離子。破碎這些胰島素前體離子中的任一種生成m/z為約226.21±0.5和/或135.6±0.5的碎片離子。因此，在Q1選擇用于選自m/z為約1162.5±0.5和968.5±0.5的離子的一種或多種胰島素前體離子的實施方案中，Q3可選擇選自m/z為約226.21±0.5和135.6±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實施方案中，可測量來自單個前體離子的單個碎片離子的相對豐度?；蛘?，可測量自單個前體離子的兩個或更多個碎片離子的相對豐度。在這些實施方案中，可使每個碎片離子的相對豐度受任何已知數(shù)學處理以定量評估最初樣品中的胰島素。在其它實施方案中，可測量來自兩個或更多個前體離子的一個或多個碎片離子并如以上用于定量評估最初樣品中的胰島素。操作可用于某些實施方案中的串聯(lián)質譜儀的替代模式包括產物離子掃描和前體離子掃描。這些操作模式的描述，參見例如，E.MichaelThurman等，Chromatographic-MassSpectrometricFoodAnalysisforTraceDeterminationofPesticideResidues，第8章(AmadeoR.Fernandez-Alba編輯，Elsevier2005)(387)。在其它實施方案中，高分辨率/高精度質量分析器可用于根據(jù)本發(fā)明的方法定量分析胰島素。為達到定量結果可接受的精確度，質譜儀必須能夠對目標離子表現(xiàn)出10,000或更大的分辨力(FWHM)，精度為約50ppm或更低；優(yōu)選質譜儀表現(xiàn)出18,000或更佳的分辨力(FWHM)，精度為約5ppm或更低；例如20,000或更佳的分辨力(FWHM)和約3ppm或更低的精度；例如25,000或更佳的分辨力(FWHM)和約3ppm或更低的精度。3種能夠對胰島素離子表現(xiàn)出必需性能水平的示例分析器為軌道阱質量分析器、某些TOF質量分析器和傅里葉變換離子回旋共振質量分析器。生物活性分子中發(fā)現(xiàn)的元素，例如碳、氧和氮，以許多不同同位素形式天然存在。例如，大多數(shù)碳以12C存在，但是所有天然存在的碳的約1%以13C存在。因此，一定分數(shù)的天然存在的含有至少一個碳原子的分子將含有至少一個13C原子。分子中包括天然存在的元素同位素產生多種分子同位素形式。分子同位素形式質量的差異為至少1個原子質量單位(amu)。這是因為元素同位素相差至少一個中子(一個中子的質量≈1amu)。當使分子同位素形式電離為多電荷態(tài)時，同位素形式之間的質量區(qū)別可變得難以辨別，因為質譜檢測基因質荷比(m/z)。例如，質量相差1amu，均電離為5+態(tài)的兩種同位素形式將在其m/z中表現(xiàn)出僅為0.2的差異。高分辨率/高精度質譜儀能夠辨別高度多電荷離子(例如帶±2、±3、±4、±5或更高電荷的離子)的同位素形式。由于天然存在的元素同位素，對于每種分子離子而言，通常存在多種同位素形式(每種同位素形式可產生如果用足夠靈敏的質譜儀分析，可單獨檢測的質譜峰)。多種同位素形式的m/z比和相對豐度共同包括分子離子的同位素特征。在一些實施方案中，可利用兩種或更多種分子同位素形式的m/z比和相對豐度確認研究的分子離子的同一性。在一些實施方案中，使用來自一種或多種同位素形式的質譜峰定量分子離子。在一些相關實施方案中，使用來自一種同位素形式的單個質譜峰定量分子離子。在其它相關實施方案中，使用多個同位素峰定量分子離子。在這些后者實施方案中，所述多個同位素峰可進行任何恰當數(shù)學處理。在本領域中已知幾種數(shù)學處理，包括但不限于求多個峰下面積的和，或平均來自多個峰的反應。在圖4-6中觀察到展示了5+和6+胰島素離子的多種同位素形式的示例光譜。如圖5A-B中所見，觀察到來自5+胰島素離子的各種同位素形式的峰值為約1161.72、1161.92、1162.12、1162.32、1162.52、1162.72、1162.92、1163.12和1163.32。如圖6A-B中所見，觀察到來自6+胰島素離子的各種同位素形式的峰值為約968.28、968.45、968.62、968.79、968.95、969.12、969.28、968.45和969.61。然而應注意，由于儀器變化，對任何離子的同位素變體觀察到的精確質量可能稍有改變。在一些實施方案中，用高分辨率/高精度質譜儀測量一種或多種離子的相對豐度以便定量評估樣品中胰島素的量。在一些實施方案中，通過高分辨率/高精度質譜法測量的所述一種或多種離子為多電荷胰島素離子。這些多電荷離子可包括m/z在約1453±0.8(即，來自4+離子的一個或多個單同位素峰)和/或1162±1(即，來自5+離子的一個或多個單同位素峰)和/或約968.8±1.5(即，來自6+離子的一個或多個單同位素峰)范圍內的一種或多種離子。已經報道使用高分辨率軌道阱分析器定性和定量分析各種分析物。參見例如，美國專利申請公布No.2008/0118932(2007年11月9日提交)；等，RapidCommun.MassSpectrom.,2008,22:477-485；LeBreton等，RapidCommun.MassSpectrom.,2008,22:3130-36；Thevis等，MassSpectrom.Reviews,2008,27:35-50；Thomas等，J.MassSpectrom.,2008,43:908-15；Schenk等，BMCMedicalGenomics,2008,1:41；和Olsen等，NatureMethods,2007,4:709-12?？赏ㄟ^本領域已知的許多方法將分析物測定的結果與原樣品中分析物的量聯(lián)系起來。例如，考慮到仔細控制取樣和分析參數(shù)，可將指定離子的相對豐度與將相對豐度轉化為原分子絕對量的表作比較?；蛘?，外標可與樣品一起進行，并且基于由那些標準生成的離子作標準曲線。使用這種標準曲線，可將指定離子的相對豐度轉化為原分子的絕對量。在某些優(yōu)選實施方案中，使用內標生成用于計算胰島素量的標準曲線。生成并且使用這種標準曲線的方法在本領域中眾所周知并且普通技術人員能夠選擇恰當內標。例如，在優(yōu)選實施方案中，可使用一種或多種形式的同位素標記胰島素作為內標。將離子的量與原分子的量聯(lián)系起來的許多其它方法將為本領域的普通技術人員眾所周知。如本文所使用，當通過質譜技術分析時，相對于未標記分子，“同位素標記”在標記分子中產生質量位移。適合標記的實例包括氘(2H)、13C和15N?？稍诜肿拥囊粋€或多個位置并入一個或多個同位素標記并且可在相同同位素標記分子上使用一種或多種同位素標記。通過用質譜法定量未修飾胰島素A和/或B鏈來定量胰島素在其它實施方案中，可在質譜分析之前使胰島素受化學處理以生成胰島素的組成鏈?？赏ㄟ^本領域已知的任何化學處理分離胰島素的A鏈和B鏈以引起二硫化物還原。例如，可用TCEP(三(2-羧乙基)膦處理胰島素以還原胰島素的二硫橋鍵并分離A鏈和B鏈。然后可使A鏈和B鏈進行上述純化胰島素的一個或多個純化步驟。在優(yōu)選實施方案中，在質譜分析之前使A鏈和/或B鏈通過HPLC純化。一經純化，就使A鏈和/或B鏈經受電離源。與胰島素一樣，技術人員將理解，可基于待測分析、樣品類型、檢測器類型、正與負模式的選擇等確定電離方法的選擇。可在正或負模式下電離胰島素A鏈和B鏈。在優(yōu)選實施方案中，在正模式下通過ESI電離胰島素A鏈和/或B鏈。電離胰島素A鏈可產生多電荷A鏈前體離子(例如2+、3+前體離子等)。例如，正電噴霧電離胰島素A鏈分子可生成m/z分別為1192.0±0.5和795.0±0.5的2+和3+電荷A鏈前體離子。與胰島素相似，電離胰島素A鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實施方案中，在酸性條件下電離胰島素A鏈。在使胰島素A鏈進行串聯(lián)質譜分析的實施方案中，Q1可選擇用于m/z為約1192.0±0.5和795.0±0.5的一種或多種胰島素A鏈前體離子。破碎這些胰島素A鏈前體離子的任一種可生成m/z為約513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的碎片離子。因此，在Q1選擇用于選自m/z為約1192.0±0.5和795.0±0.5的離子的一種或多種胰島素A鏈前體離子的實施方案中，Q3可選擇選自m/z為約513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實施方案中，可測量來自單個前體離子的單個碎片離子的相對豐度。或者，可測量自單個前體離子的兩個或更多個碎片離子的相對豐度。在這些實施方案中，可使每個碎片離子的相對豐度受任何已知數(shù)學處理以定量評估最初樣品中的胰島素。在其它實施方案中，可測量來自兩個或更多個前體離子的一個或多個碎片離子并如以上用于定量評估最初樣品中的胰島素。類似地，電離胰島素B鏈可產生多電荷B鏈前體離子(例如3+、4+、5+前體離子等)。例如，正電噴霧電離胰島素B鏈分子可生成m/z分別為1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的3+、4+和5+電荷B鏈前體離子。與胰島素相似，電離胰島素B鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實施方案中，在酸性條件下電離胰島素B鏈。在使胰島素B鏈進行串聯(lián)質譜分析的實施方案中，Q1可選擇用于m/z為約1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的一種或多種胰島素B鏈前體離子。破碎這3種胰島素B鏈前體離子可生成m/z為約825.4±0.5、768.5±0.5、753.2±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的碎片離子。因此，在Q1選擇用于選自m/z為約1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的一種或多種胰島素B鏈前體離子的實施方案中，Q3可選擇選自m/z為約825.4±0.5、768.5±0.5、753.2±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子；優(yōu)選選自m/z為約345.0±0.5和226.2±0.5的離子。在某些實施方案中，可測量來自單個前體離子的單個碎片離子的相對豐度。或者，可測量自單個前體離子的兩個或更多個碎片離子的相對豐度。在這些實施方案中，可使每個碎片離子的相對豐度受任何已知數(shù)學處理以定量評估最初樣品中的胰島素。在其它實施方案中，可測量來自兩個或更多個前體離子的一個或多個碎片離子并如以上用于定量評估最初樣品中的胰島素。通過用質譜法定量經化學修飾的胰島素A和/或B鏈來定量胰島素在替代實施方案中，可在電離和/或純化之前對單獨的胰島素A鏈和B鏈進行一個或多個化學修飾步驟。例如，一經分離，胰島素A鏈和B鏈分子就可經受脲甲基化以使組成型半胱氨酸完全烷基化。例如，在用DTT(1,4-二硫蘇糖醇)還原后，可通過使胰島素A鏈和/或B鏈與碘乙酰胺反應實現(xiàn)脲甲基化。脲甲基化胰島素A鏈導致4個半胱氨酸甲基化，導致質量增加約228.08amu(每個半胱氨酸約57.02)。脲甲基化胰島素B鏈導致2個半胱氨酸甲基化，導致質量增加約114.04amu(每個半胱氨酸約57.02)。一經純化，就使經化學修飾(例如，烷基化)的A鏈和/或B鏈經受電離源。與胰島素一樣，技術人員將理解，可基于待測分析、樣品類型、檢測器類型、正與負模式的選擇等確定電離方法的選擇?？稍谡蜇撃Ｊ较码婋x烷基化胰島素A鏈和B鏈。在優(yōu)選實施方案中，在正模式下通過ESI電離烷基化胰島素A鏈和/或B鏈。電離烷基化胰島素A鏈可產生多電荷烷基化A鏈前體離子(例如2+、3+等前體離子)。例如，正電噴霧電離烷基化胰島素A鏈分子可生成m/z分別為1306.0±0.5和871.0±0.5的2+和3+電荷烷基化A鏈前體離子。與胰島素相似，電離烷基化胰島素A鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實施方案中，在酸性條件下電離烷基化胰島素A鏈。在使烷基化胰島素A鏈進行串聯(lián)質譜分析的實施方案中，Q1可選擇用于m/z為約1306.0±0.5和871.0±0.5的一種或多種烷基化胰島素A鏈前體離子。破碎這些烷基化胰島素A鏈前體離子的任一種可生成m/z為約570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的碎片離子。因此，在Q1選擇用于選自m/z為約1192.0±0.5和795.0±0.5的離子的一種或多種烷基化胰島素A鏈前體離子的實施方案中，Q3可選擇選自m/z為約570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實施方案中，可測量來自單個前體離子的單個碎片離子的相對豐度?；蛘?，可測量自單個前體離子的兩個或更多個碎片離子的相對豐度。在這些實施方案中，可使每個碎片離子的相對豐度受任何已知數(shù)學處理以定量評估最初樣品中的胰島素。在其它實施方案中，可測量來自兩個或更多個前體離子的一個或多個碎片離子并如以上用于定量評估最初樣品中的胰島素。類似地，電離烷基化胰島素B鏈可產生多電荷烷基化B鏈前體離子(例如3+、4+、5+前體離子等)。例如，正電噴霧電離烷基化胰島素B鏈分子可生成m/z分別為1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的3+、4+和5+電荷烷基化B鏈前體離子。與胰島素相似，電離烷基化胰島素B鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實施方案中，在酸性條件下電離烷基化胰島素B鏈。在使烷基化胰島素B鏈進行串聯(lián)質譜分析的實施方案中，Q1可選擇m/z為約1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的一種或多種胰島素B鏈前體離子。破碎這3種烷基化胰島素B鏈前體離子可生成m/z為約345.0±0.5和226.2±0.5的碎片離子。因此，在Q1選擇用于選自m/z為約1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的一種或多種烷基化胰島素B鏈前體離子的實施方案中，Q3可選擇選自m/z為約345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實施方案中，可測量來自單個前體離子的單個碎片離子的相對豐度。或者，可測量自單個前體離子的兩個或更多個碎片離子的相對豐度。在這些實施方案中，可使每個碎片離子的相對豐度受任何已知數(shù)學處理以定量評估最初樣品中的胰島素。在其它實施方案中，可測量來自兩個或更多個前體離子的一個或多個碎片離子并如以上用于定量評估最初樣品中的胰島素?？墒褂米詣踊瘷C器進行上述任何方法的一個或多個步驟。在某些實施方案中，在線進行一個或多個純化步驟，并且更優(yōu)選以在線方式進行所有純化和質譜分析步驟。下列實施例用于說明本發(fā)明。這些實施例決非旨在限制所述方法的范圍。實施例實施例1：樣品制備通過在各種濃度下示蹤模擬血清中的人胰島素(40mg/mL牛血清白蛋白(BSA)于具有0.002%蛋白酶抑制劑的AEBSF磷酸鹽緩沖鹽(PBS)緩沖液中)制備含有不同量的胰島素的模擬血清樣品以評估線性響應(以下在實施例4中討論)。還在各種濃度下，在從GoldenWestBiologicals,Inc.獲得的雙重活性炭反萃血清中示蹤了人胰島素以評估響應線性度(以下在實施例4中討論)。實施例2：質譜分析之前富集胰島素用CohesiveTechnologiesAriaTX-420系統(tǒng)，使用AriaOSV1.6或更新軟件進行以上制備的人胰島素示蹤模擬和反萃血清的樣品注射。將75μL樣品引入WatersOasisHLB(25μm，2.1×20mm)、在線固相萃取(SPE)柱。SPE柱保留人胰島素，而使其它血清蛋白和大分子流過。用0.2%于40%乙腈的甲酸將胰島素從萃取柱上洗脫到分析柱上(來自PhenomenexInc.的整體式C18分析柱(粒徑5μm，50×2.1mm))。將HPLC梯度應用于分析柱，以將胰島素與樣品所含的其它分析物分開。流動相A是0.2%于水中的甲酸而流動相B是0.2%于乙腈中的甲酸。HPLC梯度從28.5%有機梯度開始，在約90s內提高到37%。然后使胰島素富集樣品進行高分辨率/高精度MS或MS/MS以定量胰島素。實施例3：pH對胰島素電離的影響在正離子模式下用ESI源進行胰島素的電離。在使用這種電離源生成正胰島素離子時，觀察到電噴霧載體溶液的pH影響生成的胰島素離子的量和特性。在酸性條件下，以968.5±0.50(對于6+離子而言)和1162.3±0.50(對于5+離子而言)的m/z觀察到多電荷胰島素離子。圖3A示出了從在酸性條件下電離胰島素收集的示例性光譜。在堿性條件下，以1163.0±0.50(對于5+離子而言)和1453.8±0.50(對于4+離子而言)的m/z觀察到多電荷胰島素離子。圖3B示出了從在堿性條件下電離胰島素收集的示例性光譜。在酸性和堿性條件下生成足夠信號，使得可在任一種條件下進行定量分析。實施例4：通過高分辨率/高精度MS檢測并定量胰島素使用AgilentTOFMS系統(tǒng)(AgilentTechnologies,Inc.)進行高分辨率/高精度MS。該系統(tǒng)采用能夠進行高分辨率/高精度MS的MS分析器。在測量胰島素的同時，儀器能夠表現(xiàn)出約25,000FWHM的分辨率和約1ppm的質量精度。在正離子模式下用ESI源進行電離。如實施例3中討論，電噴霧載體溶液的pH影響生成的胰島素離子的量和同一性。當用甲酸溶液從SEP柱上洗脫實施例1中制備的樣品時，在電離之前酸化樣品。如實施例3中所述，觀察到多電荷胰島素離子呈6+和5+電荷態(tài)。觀察污染物峰從反萃血清樣品洗脫。圖4A示出了用QTOF質譜儀生成的模擬血清樣品中胰島素在約900-1200m/z范圍的示例光譜。圖4B示出了用QTOF質譜儀生成的來自反萃血清樣品基質的污染物峰。觀察到污染物峰的來源在不同于胰島素峰的時間洗脫(數(shù)據(jù)未示出)。在圖5A中觀察到示出了5+離子的各個同位素峰，在約1155-1176m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。在圖5B中觀察到所述光譜在約1159和1166之間的部分的特寫。如光譜中所見，在約1161.72、1161.92、1162.12、1162.32、1162.52、1162.72、1162.92、1163.12和1163.34的m/z下觀察到各個示例性同位素峰。在圖6A中觀察到示出了6+離子的各個同位素峰，在約964-973m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。在圖6B中觀察到所述光譜在約967和971.4之間的部分的特寫。如光譜中所見，在約968.28、968.45、968.62、968.79、968.95、968.12、968.28、968.45和968.61的m/z下觀察到各個示例性同位素峰。收集m/z為1162.54±0.10的離子數(shù)據(jù)，以對示蹤模擬和反萃血清樣品中的胰島素進行定量以評估定量線性。兩種樣品類型在約1.22ng/mL-1250ng/mL的濃度范圍均展示出線性。圖7和8中分別示出了顯示示蹤模擬血清樣品和示蹤反萃血清樣品中胰島素檢測的數(shù)據(jù)的線性。測定通過高分辨率/高精度質譜定量胰島素的擬合優(yōu)度(R2)在示蹤模擬血清中為0.9981而在示蹤反萃血清中為0.9979。實施例5：通過串聯(lián)MS檢測并定量胰島素使用ThermoTSQVantageMS/MS系統(tǒng)(ThermoElectronCorporation)進行MS/MS。在本文所述實施例中使用全部來自ThermoElectron的下列軟件程序：TSQVantageV2.0.0或更新版本、XcaliburV2.0或更新版本和LCQuanV2.5或更新版本。離開分析柱的液體溶劑/分析物流到MS/MS分析器的ESI源接口。在接口的加熱管道內溶劑/分析物混合物轉化為蒸汽。在正離子模式下，在酸性條件下通過ESI電離分析物。離子進入第一個四極(Q1)。在Q1處觀察到幾種可能的胰島素前體離子。在圖9中觀察到示例性Q1光譜。對m/z為約1163.32±0.50(5+離子)和約969.56±0.50(6+離子)的多電荷胰島素前體離子進行破碎研究。圖10和11中分別示出了來自破碎每種前體離子的示例性產物離子掃描。研究了碰撞能對5+和6+前體離子的破碎模式的影響。在范圍從約7eV至約80eV的碰撞能下破碎每種前體離子，并監(jiān)測選擇的3種碎片離子(m/z為約135.9±0.50、226.2±0.50和345.3±0.50)的相對強度。圖12中展示了這些研究的結果。如圖12所見，碎片離子的相對強度根據(jù)碰撞能顯著變化。表1中示出了每個監(jiān)測相變的最佳碰撞能值。表1.對胰島素觀察到的示例性質量相變的最佳碰撞能(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)最佳碰撞能969.56±0.50(6+)135.9±0.5030eV226.2±0.5032eV345.4±0.5028eV1163.32±0.50(5+)135.9±0.5045eV226.2±0.5042eV345.4±0.5044eV對于通過破碎6+離子定量胰島素，進入四極2(Q2)的前體離子在30eV的碰撞能下與氬氣碰撞生成離子碎片，離子碎片進入四極3(Q3)作進一步選擇。破碎969.56±0.50前體離子觀察到下列質量相變。圖10中示出了從Q3掃描(產物離子掃描)收集的示例性破碎光譜。在MRM模式下監(jiān)測觀察到的其中兩個相變并且加和作定量分析：969.56±0.50-135.9±0.50和226.2±0.50的前體離子(見表2)。雖然通過監(jiān)測兩個質量相變完成了定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成定量。相反，可選擇另外的質量相變(包括，例如，圖10中觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。類似地，雖然在30eV的碰撞能下完成定量，但是可使用產生足夠離子信號的任何碰撞能并且可取決于監(jiān)測碎片離子的同一性。例如，對于上面所指出的兩種碎片離子而言，碰撞能可在約20至約50eV范圍內，例如在約25至約40eV范圍內，例如約28-32eV。為通過破碎5+離子定量胰島素，進入四極2(Q2)的前體離子在49eV的碰撞能下與氬氣碰撞生成離子碎片，離子碎片進入四極3(Q3)作進一步選擇。破碎1163.32±0.50前體離子觀察到下列質量相變。圖11中示出了從Q3掃描(產物離子掃描)收集的示例性破碎光譜。在MRM模式下監(jiān)測觀察到的其中兩個相變并且加和作定量分析：1163.32±0.50-135.9±0.50和226.2±0.50的前體離子(見表2)。雖然通過監(jiān)測兩個質量相變完成了定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成定量。相反，可選擇另外的質量相變(包括，例如，圖10中觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。類似地，雖然在49eV的碰撞能下完成定量，但是可使用產生足夠離子信號的任何碰撞能并且可取決于監(jiān)測碎片離子的同一性。例如，對于上面所指出的兩種碎片離子而言，碰撞能可在約25至約70eV范圍內，例如在約30至約60eV范圍內，例如約35-50eV。表2.為定量胰島素監(jiān)測的示例性質量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)碰撞能969.56±0.50(6+)135.9±0.50,226.2±0.5030eV1163.32±0.50(5+)135.9±0.50,226.2±0.5049eV實施例6：通過串聯(lián)MS檢測并定量胰島素A鏈和B鏈用TCEP(三(2-羧乙基)膦處理如實施例1中所述制備的胰島素示蹤模擬血清和反萃血清樣品以還原胰島素的二硫橋鍵并分離A鏈和B鏈。二硫化物還原后，使含有分離A鏈和B鏈的樣品進行實施例2中描述的相同純化過程。所得胰島素A鏈和B鏈進行如實施例5所述的MS/MS分析。在正模式下，在酸性條件下通過ESI電離兩種分析物。在Q1處觀察到幾種可能的胰島素A鏈和B鏈前體離子。圖13中示出了顯示兩種可能A鏈前體離子(呈2+和3+電荷態(tài))和可能B鏈前體離子(呈3+和4+電荷態(tài))的復合光譜。觀察到這兩種A鏈前體離子m/z為約1192.86±0.50(2+離子)和795.43±0.50(3+離子)。觀察到這兩種B鏈前體離子m/z為約1144.09±0.50(3+離子)和858.40±0.50(4+離子)。還觀察到第3種可能B鏈前體離子(圖14中所示)m/z為約686.83±0.50(5+離子)。對以上所有A鏈和B鏈前體離子進行破碎研究。研究了碰撞能對A鏈3+前體離子(m/z/為約795.43±0.50)的影響。在范圍從約7eV至約80eV的碰撞能下破碎前體離子，并檢測選擇的4種碎片離子(m/z為約513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50)的相對強度。圖15中展示了這些研究的結果。如圖15中所見，碎片離子的相對強度根據(jù)碰撞能顯著變化。表3中示出了每個監(jiān)測相變的最佳碰撞能值。表3.對胰島素A鏈3+前體離子觀察到的示例性質量相變的最佳碰撞能(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)最佳碰撞能795.4±0.50(3+)133.0±0.5028eV236.0±0.5023eV399.0±0.5016eV513.0±0.5012eV用m/z/為約1192.86±0.50(2+離子)和795.43±0.50(3+離子)的A鏈前體離子進行胰島素定量。用每種前體離子進行定量實驗。在這些定量實驗中，選擇2+離子(m/z/為約1192.86±0.50)或3+離子(m/z/為約795.43±0.50)作為前體離子并且在表3所示碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測下列碎片離子：513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50。雖然通過監(jiān)測4個質量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成定量。相反地，可選擇另外的質量相變(包括，例如，觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。表4.為定量胰島素A鏈監(jiān)測的示例性質量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)1192.86±0.50(2+離子)513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50795.43±0.50(3+離子)513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50還用m/z/為約1144.09±0.50(3+離子)、858.40±0.50(4+離子)和686.83±0.50(5+離子)的B鏈前體離子進行胰島素定量。用每種前體離子進行定量實驗。在這些定量實驗中，選擇3+離子(m/z/為約1144.09±0.50)、4+離子(m/z/為約795.43±0.50)或5+離子(m/z/為約686.83±0.50)作為前體離子并且在30eV碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測下列碎片離子：226.2±0.50和345.0±0.50。圖16中示出了在30eV碰撞能下破碎B鏈4+離子(即，產物離子掃描)的示例性光譜。雖然通過監(jiān)測2個質量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成定量。相反，可選擇另外的質量相變(包括，例如，圖16中觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。表5.為定量胰島素B鏈監(jiān)測的示例性質量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)1144.09±0.50(3+離子)226.2±0.50、345.0±0.50858.40±0.50(4+離子)226.2±0.50、345.0±0.50686.83±0.50(5+離子)226.2±0.50、345.0±0.50實施例7：通過串聯(lián)MS檢測并定量胰島素A鏈(烷基化)和B鏈(烷基化)用DTT(1,4-二硫蘇糖醇)處理胰島素示蹤模擬血清和反萃血清樣品以生成含有分離A鏈和B鏈的模擬和反萃血清樣品。在純化之前，使胰島素A鏈和B鏈分子進行脲甲基化以使分子中存在的每個組成型半胱氨酸完全烷基化。在A鏈中，通過這個過程使4個半胱氨酸烷基化，導致質量增加約228.08amu。在B鏈中，通過這個過程使2個半胱氨酸烷基化，導致質量增加約114.04amu。半胱氨酸烷基化后，使含有烷基化A鏈和烷基化B鏈的樣品進行實施例2中描述的相同純化過程。使所得烷基化A鏈和烷基化B鏈進行如實施例5所述的MS/MS分析。在正模式下，在酸性條件下通過ESI電離兩種分析物。在Q1處觀察到幾種可能的烷基化A鏈和烷基化B鏈前體離子。選擇m/z為約1306.0±0.50(2+離子)和871.0±0.50(3+離子)的2種可能A鏈前體離子進行破碎和定量。選擇m/z為約1181.9±0.50(3+離子)、886.40±0.50(4+離子)和709.80±0.50(5+離子)的3種可能烷基化B鏈前體離子進行破碎和定量。用m/z/為約1306.0±0.50(2+離子)和871.0±0.50(3+離子)的烷基化A鏈前體離子進行胰島素定量。用每種前體離子進行定量實驗。在這些定量實驗中，選擇2+離子(m/z/為約1306.0±0.50)或3+離子(m/z/為約871.0±0.50)作為前體離子并且在30eV碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測下列碎片離子：133.0±0.50,293.0±0.50,456.0±0.50和570.0±0.50。雖然通過監(jiān)測4個質量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成定量。相反地，可選擇另外的質量相變以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。表6.為定量烷基化胰島素A鏈監(jiān)測的示例性質量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)1306.0±0.50(2+離子)133.0±0.50,293.0±0.50,456.0±0.50和570.0±0.50871.0±0.50(3+離子)133.0±0.50,293.0±0.50,456.0±0.50和570.0±0.50還用約1181.9±0.50(3+離子)、886.9±0.50(4+離子)和709.8±0.50(5+離子)的烷基化B鏈前體離子進行胰島素定量。用每種前體離子進行定量實驗。在這些定量實驗中，選擇3+離子(m/z為約1181.9±0.50)、4+離子(m/z為約886.9±0.50)或5+離子(m/z為約709.8±0.50)作為前體離子并且在30eV碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測下列碎片離子：226.2±0.50和345.0±0.50。雖然通過監(jiān)測2個質量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成定量。相反地，可選擇另外的質量相變以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。表7.為定量烷基化胰島素B鏈監(jiān)測的示例性質量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)1144.09±0.50(3+離子)226.2±0.50、345.0±0.50858.40±0.50(4+離子)226.2±0.50、345.0±0.50686.83±0.50(5+離子)226.2±0.50、345.0±0.50實施例8：制備人類樣品以通過定量胰島素B鏈進行胰島素定量在人類樣品中胰島素的定量中使用兩種內標溶液。用溶于0.2%于水中的甲酸的牛胰島素制備濃度為10pmol/μL的第一內標溶液。然后用500mL含有比例為15:85的1.5MTris堿和乙醇的堿/萃取液稀釋30μL該溶液。用同位素標記的人胰島素B鏈(用具有5個13C和1個15N的脯氨酸標記)，通過將1mg肽溶于1mL0.2%于水中的甲酸中制備第二內標溶液。用1000μL水稀釋5μL這種濃溶液以制備第二內標溶液。解凍先前冷凍的人血清樣品，使其達到室溫并充分渦旋。一經解凍，就將各150μL樣品添加到350μL用牛胰島素示蹤的堿/萃取液中。在1000rpm速度下渦旋所得混合物2min，并在-20℃冷凍機中培育60±5min，使沉淀形成。培育之后，在5500rpm下離心樣品10min。然后將來自每種樣品的250μL上清液轉移到96-微量滴定板中。然后使2mLTCEP還原溶液(ThermoScientific目錄號#77720)與100μL第二內標溶液混合，并且將20μL這種混合物添加到96-微量滴定板中的每種樣品中。在1000rpm速度下再次渦旋樣品2min，并且在37℃培育箱中培育60±5min以使樣品中的胰島素發(fā)生還原，而使樣品中存在的任何完整胰島素分離成A鏈和B鏈。然后在-20℃冷凍機中培育10min，使沉淀形成。在5500rpm下再次離心沉淀的樣品10min。然后在MS/MS分析之前通過SPE和HPLC使來自每種樣品225上清液進行富集。實施例9：進行質譜法之前使胰島素B鏈從人類樣品中富集用CohesiveTechnologiesAriaTX-420系統(tǒng)，使用AriaOSV1.6或更新的軟件進行實施例8中制備的經處理血清樣品的樣品注射。將225μL樣品引入WatersOasisHLB(25μm，2.1×20mm)、在線固相萃取(SPE)柱。SPE柱保留胰島素B鏈，而使其它血清蛋白和大分子流過。用0.2%甲酸洗滌保留的胰島素B鏈。用35%于0.2%甲酸中的乙腈（含有0.025%異丙醇）將胰島素B鏈從萃取柱上洗脫到裝有保護盒的分析柱上(MichromBioresources300ArmstrongMagicC4(2.1×50mm，5μm粒徑)分析柱和Phenomenex安全保護柱盒(PhenomenexP/NAHO-4286))。將HPLC梯度應用于防護/分析柱，以將胰島素與樣品所含的其它分析物分開。流動相A是0.2%于水中的甲酸而流動相B是0.2%于乙腈中的甲酸（含有2.5%異丙醇）。HPLC梯度從12.0%有機梯度開始，在約90s內提高到42%。然后使胰島素富集樣品進行MS/MS以定量胰島素。實施例10：通過串聯(lián)MS檢測并定量來自人血清的胰島素B鏈使用ThermoTSQVantageMS/MS系統(tǒng)(ThermoElectronCorporation)進行MS/MS。在本文所述實施例中使用全部來自ThermoElectron的下列軟件程序：TSQVantageV2.0.0或更新版本、XcaliburV2.0或更新版本和LCQuanV2.5或更新版本。離開分析柱的液體溶劑/分析物流到MS/MS分析器的ESI源接口。在接口的加熱管道內溶劑/分析物混合物轉化為蒸汽。在正離子模式下，在酸性條件下通過ESI電離分析物。如以上實施例6中所述，在Q1處觀察到幾種可能的胰島素B鏈前體離子。選擇m/z為約686.83±0.50(5+離子)的胰島素B鏈前體離子進行破碎。破碎研究顯示許多胰島素B鏈碎片離子。圖17中示出了示例性破碎光譜。研究了碰撞能對人胰島素B鏈5+前體離子(m/z為約686.9±0.50)的破碎模式的影響。在范圍從約7V至約80V的碰撞能下破碎前體離子，并監(jiān)測選擇的5種碎片離子(m/z為約906.0±0.50、825.0±0.50、768.5±0.50、753.0±0.50和703.0±0.50)的相對強度。圖18中展示了這些研究的結果。如圖18所見，碎片離子的相對強度根據(jù)碰撞能顯著變化。表8中示出了每個監(jiān)測相變的近似最佳碰撞能值。表8.對人胰島素B鏈5+前體離子觀察到的示例性質量相變的最佳碰撞能(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產物離子(m/z)最佳碰撞能(近似)686.9±0.50(5+)703.0±0.5017V753.0±0.5016V768.5±0.5020V825.0±0.5016V906.0±0.5014V選擇m/z為約768.5±0.50和753.2±0.50的人胰島素B鏈碎片離子用于定量。用實施例8中均有描述的牛胰島素(內標1)和同位素標記胰島素B鏈(內標2)進行類似研究。表9中示出了對選擇用于進一步定量的每種類型的胰島素B鏈監(jiān)測到的質量相變。表9.為定量胰島素B鏈監(jiān)測的示例性質量相變(正極性-酸性條件)分析物前體離子(m/z)產物離子(m/z)人胰島素B鏈686.9±0.50(5+離子)768.5±0.50、753.2±0.50牛胰島素B鏈(內標1)680.8±0.50(5+離子)768.5±0.50、738.3±0.50同位素標記的人胰島素B鏈(內標2)688.1±0.50(5+離子)768.5±0.50、756.0±0.50雖然可通過監(jiān)測表8所示每條胰島素B鏈的2個質量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測單個質量相變完成任何所示分析物的定量。相反，可選擇另外的質量相變(包括，例如，圖17中觀察到的任何其它人胰島素B鏈碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測的任何相變。實施例11：測定內和測定間準確性、再現(xiàn)性和精度研究用由用8、12、20、40和80μIU/mL人胰島素示蹤的反萃血清(BiocellLaboratoriesInc.，1131-00，批次HHP03)制成的5種QC混合血清(pool)進行實施例8-10中所述測定的測定內和測定間準確性、再現(xiàn)性和精度研究，以覆蓋假定可報道測定范圍。在單次測定中分析了來自5種QC混合血清的每一種的8種復制品以確定測定中樣品的變異系數(shù)(CV)。表10中示出了由這些研究產生的數(shù)據(jù)。對結果進行的統(tǒng)計證明，5種QC混合血清的再現(xiàn)性(CV)范圍從3.0至7.9%，全部在可接受水平內(即，≤15%CV，除可接受≤20%CV的LOQ水平外)。對表10中提出的數(shù)據(jù)的進一步分析揭示每種混合血清的測定內精度在80-120%可接受范圍內。表10.測定內變異和精度為研究測定間變異，在不同的5天分析來自5種QC混合血清的每一種的8種復制品。表11中示出了由這些研究產生的數(shù)據(jù)。所述混合血清的測定間變異(%CV)范圍從7.1至14.0%。8、12、20、40和80μIU/mL靶向胰島素水平的總變異分別為14.0%、10.2%、10.0%、7.5%和7.1%。對所有混合血清的分析滿足可接受再現(xiàn)性≤15%CV的要求，除可接受≤20%CV的LOQ水平外。對表11中提出的數(shù)據(jù)的進一步分析揭示每種混合血清的測定間精度在80-120%可接受范圍內。表11.測定間變異和精度實施例12：分析靈敏度：空白限(LOB)、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)選擇性是分析方法在樣品中有其它組分存在時區(qū)分并量化分析物的能力。LOB和LOD均為測量值大于與之測量相關的不確定度的指標。將LOB定義為與零濃度的2個標準偏差。將LOD定義為與零濃度的4個標準偏差。對于選擇性試驗，獲得適當生物基質的空白樣品(反萃血清)，測試干擾，并通過實施例8-10中描述的方法分析。測量空白反萃血清樣品14次。統(tǒng)計分析這些研究的結果，給定LOB為1.4μIU/mL而LOD為1.8μIU/mL。LLOQ是測量在數(shù)量上變得有意義的點。在這個LLOQ的分析物反應可識別、不連續(xù)并且可重現(xiàn)，準確性為20%并且精度為80%-120%。通過在接近預期LLOQ的濃度下(1.25、2.5、5、10、15和25μIU/mL)，測定用人胰島素示蹤的6種反萃血清樣本測定LLOQ，然后估計7次的測定內再現(xiàn)性。分析這些研究的數(shù)據(jù)并繪圖(示于圖19中)并且由曲線確定LLOQ為3μIU/mL，獲得可接受性能的最低濃度，此時CV的95%置信區(qū)間仍低于20%。實施例13：測定可報道范圍和線性度為確定實施例8-10中所述測定的線性范圍，制備了8種示蹤反萃血清樣品(人胰島素濃度為5、10、15、25、50、100、200和300μIU/mL)并且在單獨的5天分析。連續(xù)5次的加權(1/X)線性回歸產生0.995或更高的相關系數(shù)，精度為±20%，揭示可量化范圍為5-300μIU/mL。圖20中示出了示例性校準曲線。實施例14：樣本類型研究可通過在6種不同類型的BDVacutainerTM管中收集10種人類患者混合血清(普通血清、SST、EDTA血漿、肝素鈉血漿、肝素鋰血漿和檸檬酸鈉血漿)估計基質特異性。然后根據(jù)實施例8-10中描述的方法萃取并分析來自每種混合血清的樣品的胰島素。這些研究表明，不可接受檸檬酸鈉血漿樣品進行分析，但是所有其它樣品類型可接受。實施例15：干擾研究通過示蹤低、中和高溶血性患者樣品中不同水平的胰島素估計溶血干擾對胰島素測定的影響。然后根據(jù)實施例8-10中描述的方法萃取并分析胰島素。這些研究的結果表明，對高和中等溶血樣品獲得可接受的結果(即，在80-120%精度內)。高溶血樣品不可接受。通過示蹤低、中和高脂血性患者樣品中不同水平的胰島素估計脂血干擾對胰島素測定的影響。然后根據(jù)實施例8-10中描述的方法萃取并分析胰島素。這些研究的結果表明，對于所有水平的脂血均獲得可接受的結果(即，在80-120%精度內)。通過示蹤低、中和高黃疸患者樣品中不同水平的胰島素估計膽紅素干擾對胰島素測定的影響。然后根據(jù)實施例8-10中描述的方法萃取并分析胰島素。這些研究的結果表明，對于所有水平的膽紅素均獲得可接受的結果(即，在80-120%精度內)。本文提及或引用的論文、專利和專利申請及所有其它文檔和以電子方式提供的信息均以引用方式整體并入，如同特別單獨地指出將每個單獨的公布以引用方式并入一樣。申請人保留將來自任何此類論文、專利、專利申請或其它物理和電子文檔的所有任何材料完全并入本申請的權利。本文說明性描述的方法可適合在不存在本文未特別公開的任何元素、限制的情況下實施。因此，例如，應從廣義上理解術語“包含”、“包括”、“含有”等并且不受限制。另外，已經將本文采用的術語和表達用作描述而非限制性術語，并且不打算使用不包括顯示并描述的特征的任何等效形式或其部分的此類術語和表達。應認識到，在要求保護的本發(fā)明范圍內可能有各種修改。因此，應理解，雖然已經通過優(yōu)選實施方案和任選特征特別公開了本發(fā)明，但是本領域的技術人員可采取本文公開的其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修改和變化，并且認為此類修改和變化在本發(fā)明范圍內。本文已對本發(fā)明進行了廣泛且一般性的描述。屬于一般公開內容的每一狹窄種類和下位分組也構成所述方法的一部分。這包括對所述方法的帶有限制型條款的一般描述，或對所述方法的帶有從種中除去任何主題的負面限定的一般描述，無論所除去的主題是否在本文中被具體引用。其它實施方案在下列權利要求的范圍之內。另外，當根據(jù)馬庫西群組(Markushgroup)描述所述方法的特征或方面時，本領域的技術人員將認識到，還據(jù)此根據(jù)馬庫西群組的任何單個成員或亞組成員來描述本發(fā)明。