專利名稱：新的肝癌高表達基因、其編碼的蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人HCCA1蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽及其特異性抗體的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的HCCA1蛋白是一種新的在肝癌中高表達的蛋白。
肝癌是一種嚴重危害人類的疾病。西方發(fā)達國家肝癌的發(fā)病率較低，國際上對肝癌的基礎研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，且發(fā)病年齡構成年輕化，每年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌成了嚴重危害我國人民生命財產安全的頭號敵人，并且是影響社會經濟發(fā)展的一個重要因素，加大力度進行我國肝癌的基礎研究具有戰(zhàn)略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關基因是目前肝癌基礎研究中的前沿課題。
到目前為止，已有不下20種的基因異常表達被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關，但已確定的肝癌相關基因在肝癌中的異常表達率并不高，肝癌的發(fā)病機制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術加化療以及近年來配合使用的多種基因治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關基因尤其是肝癌高表達基因對于探討肝癌的發(fā)病機制具有重要意義。
因此，為治療和診斷目的研究和開發(fā)在肝癌中高表達的基因和/或蛋白具有重要意義。本領域迫切需要新的在肝癌中高表達的基因和/或蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種新的、在肝癌中高表達的人HCCA1蛋白(protein ofhepatocellular carcinoma susceptible gene 1，簡稱為“HCCA1蛋白”)多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
本發(fā)明人應用差異顯示法從肝癌組織中獲得一基因片段，進而通過基因克隆技術獲得該基因的全長序列。令人感興趣的是該基因在肝癌中的表達高達90.8％，而癌旁肝組織不表達或表達極低。該基因編碼-719個氨基酸的蛋白質，位于胞內，而且含有多個蛋白質-蛋白質相互作用結構域以及磷酸化修飾位點，表明該基因參與細胞內信號傳導，這一發(fā)現(xiàn)使人們在探討肝癌的發(fā)病機制中又前進了一大步，同時為肝癌的診斷以及通過干預細胞內信號傳導的“信息治療”提供巨大的潛在應用價值。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的HCCA1蛋白多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼上述人HCCA1蛋白多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQID NO:1中320-2479位的序列；和(b)具有SEQ ID NO:1中1-2702位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人HCCA1蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人HCCA1蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人HCCA1蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人HCCA1多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-2702個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人HCCA1多肽活性的化合物，以及抑制人HCCA1多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人HCCA1多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在HCCA1蛋白的方法，它包括將樣品與HCCA1蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HCCA1蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人HCCA1多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人HCCA1多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人HCCA1多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人HCCA1蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人HCCA1多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本


圖1顯示了本發(fā)明人HCCA1蛋白的氨基酸序列及其編碼序列。其中氨基酸效率采用標準的氨基酸單字母縮寫。全長蛋白是719個氨基酸(不包括終止密碼子)。
圖2顯示了Northern雜交分析HCCA1 mRNA在肝癌中的表達情況。其中，在各L泳道為癌旁肝組織；各K泳道為肝癌組織。
圖3顯示了用免疫組織化學分析HCCA1蛋白在肝癌中的表達情況。其中，陽性信號為做左下方的棕黃色區(qū)域(彩色照片)或灰色區(qū)域(黑白照片)。
在本發(fā)明中，術語“HCCA1蛋白”、“HCCA1多肽”或“肝癌高表達蛋白HCCA1”等可互換使用，都指具有人肝癌高表達蛋白HCCA1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。該術語包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌高表達蛋白HCCA1。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的HCCA1蛋白或多肽”是指HCCA1多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化HCCA1蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。HCCA1多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人HCCA1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人HCCA1蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“人HCCA1多肽”指具有人HCCA1蛋白活性的SFQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人HCCA1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人HCCA1蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人HCCA1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人HCCA1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人HCCA1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人HCCA1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人HCCA1多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人HCCA1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HCCA1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人HCCA1蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸所編碼的多肽與SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼HCCA1蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的人HCCA1核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或HCCA1蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science,1984；224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的HCCA1多肽。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人HCCA1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3)．從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，人HCCA1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人HCCA1編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring HarborLaboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人HCCA1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療HCCA1蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗HCCA1蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人HCCA1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人HCCA1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人HCCA1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人HCCA1基因產物或片段。較佳地，指那些能與人HCCA1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人HCCA1蛋白的分子，也包括那些并不影響人HCCA1蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人HCCA1基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人HCCA1基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人HCCA1蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol..6∶511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人HCCA1蛋白功能的抗體以及不影響人HCCA1蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人HCCA1基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人HCCA1基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人HCCA1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人HCCA1蛋白。此外，與人HCCA1蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人HCCA1蛋白相關的疾病。由于HCCA1為胞內蛋白，富含脯氨酸，含有蛋白質-蛋白質相互作用結構域和磷酸化修飾位點，HCCA1很可能是細胞信號傳導鏈中的重要一環(huán)，給予適當劑量的抗體可以阻斷人HCCA1蛋白的活性及其信號傳導而達到治療目的，這就是新型的癌癥治療方法——“信息治療”。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人HCCA1蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人HCCA1蛋白陽性的細胞(例如肝癌細胞等)。由于本發(fā)明的HCCA1蛋白在肝癌細胞中是特異性高表達的，這種雜交抗體可用于定向地殺滅肝癌細胞。本發(fā)明的研究表明，HCCA1是一胞內蛋白，由于它在正常腦、肺和肌肉等組織表達，表明它是一個正常細胞基因，但HCCA1蛋白在這些組織中表達的意義仍有待探討。這些組織中HCCA1的表達低下可能導致某些疾病，應用本發(fā)明分離到的HCCA1的多核苷酸和蛋白可以治療在這些組織中因HCCA1不表達或低下而導致的疾病。此外，HCCA1在正常肝臟中不表達，但在胚胎肝中表達，肝癌發(fā)生后HCCA1有很高的表達，這表明它在出生后處于關閉狀態(tài)，而肝癌發(fā)生時重新開放，該基因在肝癌發(fā)生時極有可能已發(fā)生了突變。已發(fā)現(xiàn)HCCA1在肝癌中高表達，但又發(fā)現(xiàn)它弱表達于其他的腫瘤細胞系如乳腺癌、胃癌和大腸癌等，所以HCCA1在肝癌中的表達可能并不特異，HCCA1有可能是許多癌癥發(fā)病中的一個共同的環(huán)節(jié)。因此，可用雜交抗體進行局部介入治療的方式治療癌癥。
多克隆抗體的生產可用人HCCA1蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白及其抗體，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與HCCA1蛋白發(fā)生相互作用的物質，如與其功能密切相關的相互作用蛋白、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或其作用蛋白等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，如那些在腦和肺等組織中表達低下而導致某些疾病狀態(tài)的治療，而該多肽的拮抗劑可用于腫瘤尤其是肝癌方面的治療。在使用本發(fā)明HCCA1蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明HCCA1多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的HCCA1蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
人HCCA1蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于HCCA1蛋白的無表達或異常/無活性的HCCA1蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的HCCA1蛋白(尤其是改變其蛋白質-蛋白質相互作用結構域和磷酸化修飾位點)，以抑制(或競爭性抑制)內源性的HCCA1蛋白活性而阻止HCCA1的細胞內信號傳導。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將HCCA1基因轉移至細胞內。構建攜帶HCCA1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et al.“分子克隆”)。另外重組人HCCA1基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制人HCCA1 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人HCCA1蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人HCCA1蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人HCCA1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人HCCA1蛋白水平，可以用作解釋人HCCA1蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷HCCA1蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在HCCA1蛋白的方法是利用HCCA1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與HCCA1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HCCA1蛋白。
HCCA1蛋白的多聚核苷酸可用于HCCA1基因相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，HCCA1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測HCCA1基因的表達與否或在疾病狀態(tài)下HCCA1基因的異常表達。如HCCA1 DNA序列可制備成特異性探針用于對活檢標本的雜交以判斷HCCA1基因的表達異常。雜交技術包括Southem印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用HCCA1蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測HCCA1蛋白的轉錄產物。
檢測HCCA1基因的突變也可用于診斷HCCA1蛋白相關的疾病。HCCA1蛋白突變的形式包括與正常野生型HCCA1 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR(SSCP)和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明HCCA1蛋白的cDNA(位于3′-UTR序列)設計并合成PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人源胎盤cDNA文庫(該文庫可從有關公司購得)中分離出的。其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為2702個堿基，其開放讀框位于320-2479位，編碼全長為719個氨基酸的人HCCA1蛋白(SEQID NO:2)。該HCCA1蛋白是一種肝癌高表達蛋白，HCCA1在肝癌中的表達率高達90.8％，而在癌旁肝組織的表達率和表達水平極低。由于HCCA1在肝癌中的很高表達率，明顯高于目前用于肝癌診斷的AFP(其檢出率約50-60％)，因此HCCA1多核苷酸、HCCA1蛋白及其抗體，以及HCCA1蛋白相關的拮抗劑、激動劑等可為治療包括肝癌等多種疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1．人肝癌組織中高表達基因片段的獲得和克隆新鮮肝癌組織、癌旁肝組織以及正常肝組織標本采用異硫氰酸胍(Sigma公司)法提取總RNA，經RNA變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實所獲得的總RNA未被降解而且具有較高的純度，以此RNA作為模板合成cDNA第一鏈和第二鏈(采用Clontech公司cDNA合成試劑盒)，3′-端錨定引物為0ligo dT11MC,5′-端隨機引物為5′-AATCGGGCTG-3′(AP2)。
逆轉錄(RT)反應管組成(總20μl)含1μg總RNA和2.5μOligo dT11MC引物，70℃反應10min；冰浴2min后，加入1μM DTT,0.2mM dNTP混合物，1×逆轉錄反應緩沖液，5U逆轉錄酶，20U RNA酶抑制劑，在37℃反應1h，最后在70℃加熱15min終止反應分裝后保存于-80℃。
PCR擴增反應管組成(總20μl)含取1μl逆轉錄反應產物，2.5μMoligo dT MC和AP2,0.2mM dNTP混合物，10μCiα-32P-dATP,1.25mM MgCl2和2.5U Taq酶。PCR擴增的循環(huán)參數(shù)和程序為94℃,5min→94℃,1min,40℃,2min,72℃,1min 20s,40循環(huán)→72℃,8min。PCR產物經6％測序膠電泳分離，放射自顯影顯示差異表達的基因片段，與測序膠嚴格對位后扣出含目的基因片段的凝膠，加100μl ddH2O煮沸15min，離心，上清用等體積酚/氯仿各抽提一次，加2.5倍體積無水乙醇和1/10體積3M NaAc，混合后置-20℃1h,13000×g離心15min，用預冷70％7乙醇洗2次，沉淀物重懸于10μl ddH2O,-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 為了進一步進行基因克隆的需要，將首輪PCR產物進行二次PCR擴增，擴增反應除了模板為首輪PCR擴增并經分離純化的產物以及反應體系中未加α-32P-ATP外，其他條件同首輪PCR反應相同。二次PCR擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其大小被確定與測序膠顯示的目標片段大小相同，即成功進行了二次PCR擴增。
將此片段用QIAEXⅡ kit(GIAGEN公司)進行純化，純化產物克隆到pGEM-T easyvector(Promega公司)。
連接反應管的組成
混合，4℃反應過夜。
連接產物轉化大腸桿菌JM-109，氨芐青霉素和X-Gal篩選，白色菌落可能為成功轉化了重組質粒的菌株，選取多個白色菌落(設立藍色菌落為對照)直接或抽提質粒后進行PCR擴增和鑒定，引物為根據(jù)載體兩側SP6和T7序列合成。用于鑒定的PCR反應管的組成如下
PCR擴增的循環(huán)參數(shù)和程序為94℃,5min→94℃,40s,56℃,50 s,72℃,1min，共40循環(huán)→72℃,8min。
獲得的重組陽性克隆經PstⅠ和XhoⅠ酶切重新獲得該基因片段，純化后用隨機引物(Prime-a-Gene kit,Promega公司)法制備成特異性探針，用Northern雜交進一步確證其在肝癌及癌旁組織中的差異表達。
實施例2．從人源胎盤cDNA文庫釣取全長基因、測序和序列分析篩選表達文庫人胎盤cDNA文庫(λZAP噬粒)按每盤3×104鋪盤20盤(宿主菌為SOLR細胞)，噬菌斑轉于NC膜，經堿變性后用上述制備的特異性探針進行雜交、洗膜、放射自顯影，對陽性噬斑進行第二輪和第三輪篩選，然后用輔助噬菌體M13進行刪切釋放pBluescript質粒，宿主菌更換成JM-109再轉化一次。具體如下(1)宿主菌(XL-1 blue)復蘇挑取XL-1 blue單菌落↓50ml LB+500μl麥芽糖(20％)+500μl MaSO4(1M)↓37℃,250rpm，培養(yǎng)過夜↓4℃,4000 rpm,10min↓棄上清↓10ml MgSO4(10mM)+100μl Maltose(20％)重懸↓測定OD600，分裝，4℃保存(1OD600=8×108)(2)噬菌體滴度測定[1]用PSB稀釋噬菌體1∶10,1∶100,1∶1000置4℃?zhèn)溆?M Tris-HCl pH7.510ml 10mMNaCl5.8g 0.1MMgCl22.0g 10mMGelatin 0.5g 1.67mMPSB 1000ml(終體積)[2]鋪LB瓊脂盤(1.5％,Φ90mm,30ml/盤×4個)[3]滴度測定200μl XL-blue菌液(0.5OD600)+10μl各稀釋度的噬菌體↓
37℃水浴搖床孵育15-30min↓加3ml頂層瓊脂(0.6％,50℃保溫)↓鋪于底層LB瓊脂上↓37℃溫箱孵育5小時↓計算培養(yǎng)皿中單個噬菌斑的數(shù)量(3)鋪盤擴增文庫[1]準備LB瓊脂(1.5％,Φ150mm,80ml/盤×20個)[2]擴增(×20管)800μl XL-blue(0.7OD600)+10μl噬菌體(3×104pfu/盤)↓37℃溫浴15-30min↓9ml Top-agar(0.6％,～50℃)↓鋪于底層瓊脂上，培RT5-20min,37℃培養(yǎng)過夜↓次日置4℃平衡2h(4)轉膜NC膜編號↓NC膜置頂層瓊脂1min，帶墨水針頭三點定位↓[1]變性1.5M NaCl+0.5M NaOH,250ml,1-5min[2]中和1.5M NaCl+0.5M Tris-HCl(pH7.5),250ml,5min[3]漂洗2×SSC,250ml,10-30min→DNA面朝上涼干[4]烤膜覆以濾紙，80℃,2小時(5)探針標記(隨機引物法)、預雜交、雜交(36h)同Northern印跡(6)壓片與曝光將洗好的膜晾干后用蓋革氏記數(shù)器檢測，記數(shù)應在5-10cpm之間。將膜固定于濾紙上，用保鮮膜包裹再固定于增感屏上并貼上熒光尺，壓X光片于-70℃曝光48小時。(7)扣取含陽性噬菌斑的瓊脂(設陰性對照)↓1ml PSB+20μl氯仿，振蕩30min，置4℃12h
↓滴度測定↓(8)第二輪(1000噬菌體/盤)、第三輪篩選(50-100噬菌體/盤)↓(9)質粒刪切800μl XL-blue(0.7OD)+100μl噬菌體(5×105pfu)+1μl輔助噬菌體(＞106)↓37℃溫浴15-30min↓70℃加熱20min以滅菌↓離心4000g×15min，上清轉入新管，4℃保存?zhèn)溆谩删w10μl(1×105)+新鮮SOLR細胞(OD 1.0)200μl,37℃,15min↓鋪LB-氨芐青霉素平板，37℃培養(yǎng)過夜↓氨芐青霉素篩選獲得陽性質粒經過三輪篩選后，獲得8個陽性克隆，純化質粒用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳分離、Southern轉膜、雜交進行確證。
測序、同源性比較和蛋白質序列分析用T3、T7以及合成的內側引物，采用3700型全自動測序儀(PE Biosystems公司)進行測序。分析cDNA序列以確定其是否為全長基因，用PcGene軟件分析開放讀框，核酸和蛋白質序列進入EMBL/Genbank/DDBJ數(shù)據(jù)庫檢索進行同源性比較，用DNATools 5.1、Tmpred、ScanProsite、NetPhos 2.0、Smart、Prodom和eMotif等軟件分析蛋白質的結構域。
8個陽性克隆(經Southern雜交確證)均進行測序，測序結果表明其中最長的克隆其大小與Northern分析獲得的轉錄子大小相同，該質粒為HCCA1/pBluescript SK，基因序列如SEQ ID NO:1所示，其長度為2702 bp,3′-UTR含226 bp，有一個含22bp poly(A)尾，其上游18bp處有一加尾信號(AATAAA核心序列)，5′-UTR含319bp，從320bp至2476bp為一開放讀框，編碼719氨基酸，起始子上游-1,-3,-6和-9 nt為嘧啶堿基，上游有3個終止子，符合典型的Kozak標準，這證明所獲得的基因為一全長eDNA，該基因命名為HCCA1。核酸和氨基酸序列進入EMBL/Genbank/DDBJ基因數(shù)據(jù)庫檢索，檢索結果未發(fā)現(xiàn)已知同源基因。綜上所述，證明本研究所獲得的基因為一全長序列的新基因，該基因送入EMBL/Genbank/DDBJ基因數(shù)據(jù)庫，登錄號為AF203474，因申請保密，基因序列在本申請之前未公開。
該基因編碼的蛋白質具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(
圖1)，分子量為79.5kDa，pI值為8.22，含45.5％疏水性氨基酸，31.0％親水氨基酸，13.4％堿性氨基酸和10.2％酸性氨基酸。該基因富含脯氨酸，脯氨酸總含量達11.0％，顯著高于一般基因4.6％的脯氨酸含量，尤其重要的是在C-端含有2個典型的SH3結合結構域，其核心序列為PXPXXP，如下所示為P1(PHPIQP)和P2(PIPST*P)，后者的T*(蘇氨酸)又可能是CK-Ⅱ的磷酸化修飾位點。另外，該基因含有多個修飾位點包括糖基化、豆蔻?；土姿峄?。HCCA1氨基酸序列和結構分析(ScanProsite和NetPhos 2.0)報告如下修飾位點核心序列糖基化 N323NMTG豆蔻?；?G322GNMTGTG439GVSGGEG537GGGCNMG589GNSVNLPKC磷酸化S60KKPSAKQT179PHKTVKKT200ILATSKKVT245ARQLTVRIKS500RRPSKRRT630VPATTVKIVPKA磷酸化T245RQLTVRIS379KRSSVLKS462RTSFPLS500RRPSKRRT670RWTVVKPKG磷酸化S60KKPSAKQS379KRSSVLKS500RRRPSKRRCKⅠ磷酸化 T179SPHKTVKKS306SLPSIQES345SELGSETRS405TPAQSTHSS445SGGESFESS466SFPLSESQS488SPASSMFRS637SPLSATVS665SENSAYR
T674TVVKTEEGS695SLNNSSPGS716TEEISGFLCKⅡ磷酸化 S306ASLPSIQEET406PAQSTHSEAS441PLGVSGGESS696NNSSPGDGSK3磷酸化 T131ELGTFAQSS167EDFSTHVSS171THVSIDCS7328TGTTEINSS341KDNSELGSS391PSPSLQPST401PGKTPAQSS441LGVSGGESS462ARTSFPLST470ESQTLLSSS484MMPSPASSS691IQESLNNST712EDATEEISp34cdc2磷酸化S175IDCSPHKCaMⅡ磷酸化 T245RQLTVRIS500RRPSKRR酪氨酸磷酸化Y234KAEDNKYLTCY349SETRYPLLL實施例3．可經RT-PCR從肝癌組織中獲得HCCA1編碼序列的多核苷酸1．引物引物1:5′-GCGAATTCATGGGATTCTCCAACATGG-3′(SEQ ID NO:7)引物2:5′-CGCTCGAGCAGACTCTTATTCTCCTAG-3′(SEQ ID NO:6)在兩頭分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ接頭。2．RT逆轉錄(RT)反應管組成(總20μ1)含1μg總RNA和2.5μM引物2,70℃反應10min；冰浴2min后，加入1μMDTT,0.2mM dNTP混合物，1×逆轉錄反應緩沖液，5U逆轉錄酶，20U RNA酶抑制劑，在37℃反應1h，最后在70℃加熱15min終止反應分裝后保存于-80℃。3．PCR擴增、克隆及測序擴增反應管組成(總100μl)含取5μl逆轉錄反應產物，2.5μM引物1和引物2,0.2mM dNTP混合物，1.25mM MgCl2和2.5U Taq酶。PCR擴增的循環(huán)參數(shù)和程序為94℃,5min→94℃,1min,56℃,1min,72℃,1min 20s,35循環(huán)→72℃,8min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAEXⅡ kit(GIAGEN公司)進行純化，純化產物構建于克隆載體pBluescript SK，或表達載體pGEX-5X-1或pcDNA3等，重組體進行測序確證。
實施例4．Northern雜交分析研究HCCA1在人正常組織中的分布以及在肝癌和一系列肝腫瘤細胞系及一胚胎肝細胞系中表達的變化Northem雜交分析用隨機引物法(Prime-a-gene,Promega公司產品，標記反應按說明書進行)制備全長HCCA1 cDNA探針。組織和細胞RNA樣品(40μg/泳道)進行甲醛變性膠電泳、轉膜、雜交，嚴謹洗膜后進行放射自顯影。用PhospherImager分析系統(tǒng)對雜交結果進行分析，雜交信號強度用RNA上樣18s的相對灰度值進行校正。
結果表明，HCCA1 mRNA正常分布于腦、肺和肌肉，胃腸道僅微弱表達于小腸，正常肝和胰不表達。65例原發(fā)性肝癌細胞癌(HCC)患者，91.5％HCCA1在肝癌組織中高表達，12.3％癌旁組織弱表達(如圖2所示，各L泳道為癌旁肝組織；各K泳道為肝癌組織)。與病理指標關系的研究表明，肝癌組織及癌旁組織均有表達的患者，癌組織HCCA1的表達水平明顯高于癌旁組織不表達的患者，該基因與癌栓形成有關，表明可能與肝癌的浸潤有關。另外，HCCA1 mRNA在多種肝癌腫瘤細胞系(Hep G2,Huh-7和SK-Hepl等)均呈高表達。
實施例5．原核表達載體的構建和融合蛋白的制備1．表達載體pGEX-5X-1pGEX-5X-1為一種可市售的GST融合載體(Pharmacia公司)，其結構特點為在緊挨多克隆位點前的一段短的DNA編碼GST融合蛋白，其前端含有tac啟動子可被IPTG誘導，表達產物含有凝血因子Xa的識別序列，經Xa因子酶切可獲得所表達的目的蛋白。2．HCCA1蛋白編碼區(qū)多核苷酸的獲得與亞克隆HCCA1 N-端174氨基酸的基因片段用PCR擴增，5′-端和3′-端引物分別為P1:5-′GCGAATTCATGGGATTCTCCAACATG-3′(SEQ ID NO:3)P2:5-′CGCTCGAGGCAGTCAATGCTGACATG-3′(SEQ ID NO:4)HCCA1 C-端199氨基酸的基因片段用PCR擴增，5′-端和3′-端引物分別為P3:5-′GCGAATTCGTTATCTTCACTGTTCCTG-3′(SEQ ID NO:5)P4:5′-CGCTCGAGCAGACTCTTATTCTCCTAG-3′(SEQ ID NO:6)HCCA1蛋白氨基酸全部編碼區(qū)多核苷酸用PCR擴增，5′-端和3′-端引物分別為P5:5′-GCGAATTCATGGGATTCTCCAACATGG-3′(SEQ ID NO:7)P6:5′-CGCTCGAGCAGACTCTTATTCTCCTAG-3′(SEQ ID NO:6)在兩頭分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ接頭。PCR反應管的組成如下
PCR擴增的循環(huán)參數(shù)和程序為94℃,5min→94℃,50s,56℃,1min,72℃,1min20s，共30個循環(huán)→72℃,8min。
PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAEXⅡkit(GIAGEN公司)進行純化，純化產物亞克隆于pGEX-5X-1，重組體進行測序確證。
3．融合蛋白的表達、鑒定與純化上述重組質粒轉化大腸桿菌BL-21，陽性克隆在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，1mM IPTG于30℃誘導4h。表達產物經8％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色鑒定。高表達菌株進行大量培養(yǎng)，用同樣的條件進行誘導，收集細胞，冰上裂解30min(裂解液50mM Tri-HCl,pH8.0；150mM NaCl；1mg/ml溶菌酶；5mM EDTA；0.5mM PMSF；0.2μg抑蛋白酶肽(aprotinin))，超聲處理5min(80％強度，0.8頻率)，加1％Triton X-100，冰浴15min,15,000 rpm離心1h，取上清加2ml GST-bead，冰浴并間斷振搖混勻2h，上親和層析柱洗脫(洗脫液50mM Tris-HCl,pH8.0；1mM DTT；10mM谷胱苷肽)。得到純化的HCCA1-GST融合蛋白。
實施例6．特異性抗體的制備抗體制備、純化和鑒定將實施例4中獲得的經GST親和層析純化的蛋白質，皮下注射免疫成年雄性新西蘭兔，按1mg,0.5mg,0.25mg和0.1mg遞減的劑量，每2周加強1次，8周后取血，免疫前取血1次作為對照。首次免疫1周后可見局部反應明顯，有硬結和潰瘍，8周后取股動脈血，分離血清，1％瓊脂糖雙向凝膠擴散試驗可見反應后的沉淀線，抗血清滴度為1∶16,Western雜交證明其有較好的特異性。
實施例7．真核表達載體的構建、細胞轉染、表達與鑒定(1)人源胚胎腎纖維細胞系K293細胞瞬時轉染和過表達全長HCCA1 cDNA克隆(HCCA1/pBluesript)用EcoRⅠ和XhoⅠ，純化后構建于pcDNA3表達載體，轉化大腸桿菌XLl-blue或JM109，常規(guī)抽提質粒(用Promega公司提供的試劑盒)。K293細胞培養(yǎng)于10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基(37℃,5％CO2培養(yǎng)箱)，細胞生長至70％進行轉染，加純化質粒2μg用FuGENETM6(Boehringer Mannheim公司)轉染試劑轉染，空載體作為對照。轉染后繼續(xù)培養(yǎng)30 h以獲得蛋白過表達，棄培養(yǎng)液用PBS洗1次，于冰上進行細胞裂解(裂解液50mM HEPES,pH7.5；150mM NaCl；1mMEDTA；10mM NaF；10mM焦磷酸鈉；40μM過釩酸鈉；1μg/ml aprotinin；0.5mM PMSF；10％甘油；1％Triton-X 100)，裂解物分裝后儲于-80℃以備進一步檢測。
(3)Western雜交細胞裂解物用8％SDS-PAGE電泳，轉印于NC膜(轉移緩沖液39mM甘氨酸，48mM Tris,0.037％SDS,20％甲醇)，麗春紅染色1min標記蛋白Marker的位置，用封阻劑(50mM Tris,pH7.5；150mM NaCl；5mM EDTA；0.05％Triton-X100；0.25％gelatin)預雜交30min，制備的一抗按1∶1000加入，室溫雜交1h，封阻劑漂洗兩次(15min/次)，辣根過氧化酶抗兔二抗按1∶10000室溫雜交1h，封阻劑再漂洗兩次(15min/次)后，用ECL反應1min,Kodak X曝光15s至2min進行放射自顯影。
結果是構建的真核表達載體HCCA1/pcDNA3轉染了K293細胞后，成功獲得了蛋白表達，其分子大小與理論上推測的分子量相符。
實施例8．HCCA1 Ab的應用研究免疫組化肝癌標本石蠟切片(厚5mm)或培養(yǎng)于蓋玻片上的多種肝癌細胞系以及一來源于正常胚胎肝細胞系WRL68，用實施例5中制備的抗HCCA1的特異性抗體，按ABC法(華美公司ABC試劑盒，操作按說明進行)檢測蛋白水平的表達和細胞定位。
免疫組化證實HCCA1表達于肝癌組織，癌旁肝組織不表達(圖3)。在多種肝癌細胞系以及一來源于正常胚胎肝細胞系WRL68也可見HCCA1蛋白表達，HCCA1蛋白定位于胞漿。
實施例9．原位雜交對多種肝癌細胞系以及一來源于正常胚胎肝細胞系WRL68進行了原位雜交檢測HCCA1 mRNA的表達。應用HCCA1 cDNA 3′-端500bp經SP6 RNA聚合酶逆轉錄合成的反義cRNA探針，經T7 RNA聚合酶逆轉錄合成的正義cRNA探針作為對照。研究方案如下1．用于體外轉錄cRNA的線性化DNA模板的制備HCCA1/pGEM T↓ApaⅠ酶切↓純化↓溶于DEPC處理水(0.5μg/μl)2．地高辛cRNA探針的制備轉錄緩沖液 1×DTT 10mMRNasin 20UNTPATP 1mMCTP 1mMGTP 1mMUTP 0.65mMDIG-16-UTP 0.35mMBSA成分V3μg線性化HCCA1 cDNA模板0.5μgSP6或T7 RNA聚合酶 20U總體積 20μl↓40℃水浴2h↓DNase消化10min(37℃)↓探針純化↓溶于100μl重蒸水(DEPC處理)+20U RNasin↓取1μl1％瓊脂糖凝膠鑒定，其余-20℃保存?zhèn)溆?．原位雜交細胞爬片經0.1MPBS(pH 7.2,DEPC處理)洗3次↓4％PFA/PBS固定20min↓PBS(pH 7.2,DEPC處理)，5min×3次↓0.1M甘氨酸/PBS×5min↓0.4％ Triton X-100/PBS×15min↓1μg/ml蛋白酶K,37℃,30min↓
4％PFA/PBS固定5min↓PBS(pH7.2,DEPC處理)，5min×2次↓0.25％乙酸酐處理10min↓2×SSC沖洗10min4．雜交及顯色↓加入雜交液(含探針0.5μg/ml)去離子甲酰胺 50％硫酸葡聚糖 10％Denhardt1×Tris-HCl(pH8.0) 10mMNaCl 0.3MEDTA(pH8.0) 1mMssDNA 10mM↓43℃,12-16h(濕盒)↓4×SSC,37℃洗15min↓2×SSC,20μg/ml RNaseA,37℃,30min↓1×SSC,37℃洗15min↓0.5×SSC,37℃洗15min×2次↓0.05M PBS,5min×3次↓地高辛抗體(1∶1000)1％BSA0.4％Triton X-1000.05M PBS↓室溫，4h↓0.05M PBS,5min×2次
↓TSM1,5min×2次Tris-HCl(pH8.0)0.1MNaCl 0.1MMgCl2 10mM↓TSM2,5min×2次Tris-HCl(pH9.5)0.1MNaCl 0.1MMgCl2 50mM↓顯色反應(用TSM2配)NBT 0.4mg/mlBCIP0.2mg/ml↓室溫顯色3h↓0.05M PBS,5min×2次↓100％乙醇，15min×2次↓二甲苯，15min×3次↓中性樹膠封片結果HCCA1 mRNA在多種肝癌細胞系以及一來源于正常胚胎肝細胞系表達，可見藍色陽性信號位于細胞胞漿。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的肝癌高表達基因、其編碼的蛋白及其應用(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO:l的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2702bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GGCACGAGAA CGATCCCAGT GTCGGTTGCG GGATCCGCCT CCTCTCAGTT TGCCCCTTTA 60GCCCTCCACC TTTCCCTTCT CCTCTCTCGC ATTTCCGCCA GTCGGCTTAC CCGCTGGCCG 120CCTCCTGACA AGCGGGAGGG ATCCGCGGTG GACCCAGGGA AGCGGAGGAG CCTGGCGGCC 180ACCCCCTCTT CCTCACTTCC CTGTACTCTC ATCGCTCTCG GCCTCCGACA CGAAAAGGAA 240GCAAATGAGC TGATGGAAGA TCTGTTTGAA ACTGTGAGTA ATGATCCTCA AGTGAGAACA 300TGGGATTTTC CAAGATGAGA TGGGATTCTC CAACATGGAA GATGATGGCC CAGAAGAGGA 360GGAGCGTGTG GCTGAGCCTC AAGCTAACTT TAACACCCCT CAAGCTCTAC GGTTTGAGGA 420ACTACTGGCC AACCTACTAA ATGAACAACA TCAGATAGCG AAGGAACTAT TTGAACAGCT 480GAAGATGAAG AAACCTTCAG CCAAACAGCA GAAGGAGGTA GAGAAGGTTA AACCCCAGTG 540TAAGGAAGTT CATCAGACCC TGATTCTGGA CCCAGCACAA AGGAAGAGAC TCCAGCAGCA 600GATGCAGCAG CATGTTCAGC TCTTGACACA AATCCACCTT CTTGCCACCT GCAACCCCAA 660TCTCAATCCG GAGGCCAGTA GCACCAGGAT ATGTCTTAAA GAGCTGGGAA CCTTTGCTCA 720AAGCTCCATC GCCCTTCACC ATCAGTACAA CCCCAAGTTT CAGACCCTGT TCCAACCCTG 780TAACTTGATG GGAGCTATGC AGCTGATTGA AGACTTCAGC ACACATGTCA GCATTGACTG 840CAGCCCTCAT AAAACTGTCA AGAAGACTGC CAATGAATTT CCCTGTTTGC CAAAGCAAGT 900GGCTTGGATC CTGGCCACAA GCAAGGTTTT CATGTATCCA GAGTTACTTC CAGTGTGTTC 960CCTGAAGGCA AAGAATCCCC AGGATAAGAT CCTCTTCACC AAGGCTGAGG ACAACAAGTA 1020CCTTCTAACC TGCAAGACTG CCCGCCAACT GACAGTGAGA ATCAAGAACC TCAACATGAA 1080CAGAGCTCCT GACAACATCA TTAAATTTTA TAAGAAGACC AAACAGCTGC CAGTCCTAGG 1140AAAATGCTGT GAAGAGATCC AGCCACATCA GTGGAAGCCA CCTATAGAGA GAGAAGAACA 1200CCGGCTCCCA TTCTGGTTAA AGGCCAGTCT GCCATCCATC CAGGAAGAAC TGCGGCACAT 1260GGCTGATGGT GCTAGAGAGG TAGGAAATAT GACTGGAACC ACTGAGATCA ACTCAGATCA 1320AGGCCTAGAA AAAGACAACT CAGAGTTGGG GAGTGAAACT CGGTACCCAC TGCTATTGCC 1380TAAGGGTGTA GTCCTGAAAC TGAAGCCAGT TGCCGACCGT TTCCCCAAGA AGGCTTGGAG 1440ACAGAAGCGT TCATCAGTCC TGAAACCCCT CCTTATCCAA CCCAGCCCCT CTCTCCAGCC 1500CAGCTTCAAC CCTGGGAAAA CACCAGCCCA ATCAACTCAT TCAGAAGCCC CTCCGAGCAA 1560AATGGTGCTC CGGATTCCTC ACCCAATACA GCCAGCCACT GTTTTACAGA CAGTTCCAGG 1620TGTCCCTCCA CTGGGGGTCA GTGGAGGTGA GAGTTTTGAG TCTCCTGCAG CACTGCCTGC 1680TATGCCCCCT GAGGCCAGGA CAAGCTTCCC TCTGTCTGAG TCCCAGACTT TGCTCTCTTC 1740TGCCCCTGTG CCCAAGGTAA TGATGCCCTC CCCTGCCTCT TCCATGTTTC GAAAGCCATA 1800TGTGAGACGG AGACCCTCAA AAAGAAGGGG AGCCAGGGCC TTTCGCTGTA TCAAACCTGC 1860CCCTGTTATC CACCCTGCAT CTGTTATCTT CACTGTTCCT GCTACCACTG TGAAGATTGT1920GAGCCTTGGC GGTGGCTGTA ACATGATCCA GCCTGTCAAT GCGGCTGTGG CCCAGAGTCC1980CCAGACTATT CCCATCGCCA CCCTCTTGGT TAACCCTACT TCCTTCCCCT GTCCATTGAA2040CCAGCCCCTT GTGGCCTCCT CTGTCTCACC CTTAATTGTT TCTGGCAATT CTGTGAATCT2100TCCTATACCA TCCACCCCTG AAGATAAGGC CCACATGAAT GTGGACATTG CTTGTGCTGT2160GGCTGATGGG GAAAATGCCT TTCAGGGCCT AGAACCCAAA TTAGAGCCCC AGGAACTATC2220TCCTCTCTCT GCTACTGTTT TCCCCAAAGT GGAACATAGC CCAGGGCCTC CACCAGTCGA2280TAAACAGTGC CAAGAAGGAT TGTCAGAGAA CAGTGCCTAT CGCTGGACCG TTGTGAAAAC2340AGAGGAGGGA AGGCAAGCTC TGGAGCCGCT CCCTCAGGGC ATCCAGGAGT CTCTAAACAA2400CTCTTCCCCT GGGGATTTAG AGGAAGTTGT CAAGATGGAA CCTGAAGATG CTACAGAGGA2460AATCAGTGGA TTTCTTTGAG CTAGGAGAAT AAGAGTCTGG AGACTGGGAG CCTTCACTTC2520GGCCTCCGAT TGGTGGCGCA TAGGGTGTAA CCAATAGGAA ACCCCTAAAG GGTACTTAAA2580CCCCAGATTT TGCAACTGGG GCTCTTGAGC AGCTTGCTTT AGCCTGCTCC CACTCTGTGG2640AATATACTTT TGCTTCAATA AATCTGTGCT TTTATTGCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA2700AA2702(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度719個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:MGFSNMEDDG PEEEERVAEP QANFNTPQAL RFEELLANLL NEQHQIAKEL50FEQLKMKKPS AKQQKEVEKV KPQCKEVHQT LILDPAQRKR LQQQMQQHVQ100LLTQIHLLAT CNPNLNPEAS STRICLKELG TFAQSSIALH HQYNPKFQTL150FQPCNLMGAM QLIEDFSTHV SIDCSPHKTV KKTANEFPCL PKQVAWILAT200SKVFMYPELL PVCSLKAKNP QDKILFTKAE DNKYLLTCKT ARQLTVRIKN250LNMNRAPDNI IKFYKKTKQL PVLGKCCEEI QPHQWKPPIE REEHRLPFWL300KASLPSIQEE LRHMADGARE VGNMTGTTEI NSDQGLEKDN SELGSETRYP350LLLPKGVVLK LKPVADRFPK KAWRQKRSSV LKPLLIQPSP SLQPSFNPGK400TPAQSTHSEA PPSKMVLRIP HPIQPATVLQ TVPGVPPLGV SGGESFESPA450ALPAMPPEAR TSFPLSESQT LLSSAPVPKV MMPSPASSMF RKPYVRRRPS500KRRGARAFRC IKPAPVIHPA SVIFTVPATT VKIVSLGGGC NMIQPVNAAV550AQSPQTIPIA TLLVNPTSFP CPLNQPLVAS SVSPLIVSGN SVNLPIPSTP600EDKAHMNVDI ACAVADGENA FQGLEPKLEP QELSPLSATV FPKVEHSPGP650PPVDKQCQEG LSENSAYRWT VVKTEEGRQA LEPLPQGIQE SLNNSSPGDL700EEVVKMEPED ATEEISGFL 719(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GCGAATTCAT GGGATTCTCC AACATG 26(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CGCTCGAGGC AGTCAATGCT GACATG 26(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GCGAATTCGT TATCTTCACT GTTCCTG 27(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CGCTCGAGCA GACTCTTATT CTCCTAG 27(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GCGAATTCAT GGGATTCTCC AACATGG 2權利要求
1．一種分離的人HCCA1蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
3．一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4．如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5．如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中320-2479位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-2702位的序列。
6．一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7．一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權利要求6所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求3所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
8．一種具有人HCCA1蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達人HCCA1蛋白的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人HCCA1蛋白活性的多肽。
9．一種能與權利要求1所述的人HCCA1蛋白特異性結合的抗體。
10．一種核酸分子，它含有權利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-800個核苷酸。
11．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的人HCCA1蛋白,編碼此多肽的多核苷酸和經重組技術產生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽的藥物組合物用于治療肝癌等多種疾病的方法。本發(fā)明還公開了HCCA1蛋白特異性抗體的制備方法以及該抗體用于疾病診斷和治療等多種用途。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人HCCA1蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/63GK1322732SQ0011559
公開日2001年11月21日 申請日期2000年5月8日 優(yōu)先權日2000年5月8日
發(fā)明者王紅陽, 曾錦章, 吳孟超, 陳正軍 申請人:上海東方肝膽外科醫(yī)院