專利名稱：：一種基于中藥有效成分群的中藥組方設計技術的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明針對中藥方劑現(xiàn)代研究的關鍵瓶頸問題，通過信息整合、數(shù)據(jù)挖掘、系統(tǒng)建模、層次分析、有效辨識、優(yōu)化設計、整體評價，建立適宜于中醫(yī)藥整體作用特點的中藥組方設計技術，為中藥及其復方現(xiàn)代化的研究，同時也為中藥的二次開發(fā)和創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供技術支撐。
背景技術：
：中藥及其方劑(復方)是中醫(yī)臨床用藥的主要形式。目前，中藥的研究有兩種基本思路一種是將中藥當成植物或天然藥物，按傳統(tǒng)經(jīng)典式的方法進行研究，提取其活性部位，分離化學成分，定結構，乃至人工合成，然后進行藥效學、藥動學、毒理學的研究，最后過渡到臨床試驗。這種研究思路，目前仍占相當?shù)牡匚?，他們主要研究單味中藥，然后從中找到單體，應用于臨床。另一種思路是近30多年來逐步形成的，即是中醫(yī)藥的觀點，確切地說按中西醫(yī)結合的觀點對中藥及其復方進行研究，其研究的特點是遵循中醫(yī)藥理論，密切結合中醫(yī)臨床療效，運用現(xiàn)代科學的研究手段開展中藥和復方的研究，其主要目的是闡明中醫(yī)藥理論，闡明組方規(guī)律和開發(fā)新藥、研制新藥，促進中藥現(xiàn)代化。本發(fā)明的基本思路是以中醫(yī)藥配伍理論為指導，以臨床有效方劑為研究對象，以已有中藥有效物質(zhì)基礎和作用機理研究成果為基礎，以化學信息學、生物信息學、分子生物學、分子藥理學、數(shù)理統(tǒng)計學為理論支持，以系統(tǒng)建模和優(yōu)化設計為主線，建立基于中藥有效成分群的中藥組方設計技術。即遴選一種臨床常見且發(fā)病機制相對清楚的疾病為研究病種，優(yōu)選藥效物質(zhì)基礎研究較深入的臨床有效方劑為研究對象，建立分子、細胞、整體三個水平的既相互補充又相互映證的系統(tǒng)藥效篩選與驗證模型，創(chuàng)建君、臣、佐、使四個層次的中藥有效成分群辨識及其關聯(lián)研究方法，集成信息學、現(xiàn)代生物學、計算機科學、現(xiàn)代藥理學、數(shù)學藥理學等五項主要技術，針對中藥方劑現(xiàn)代研究的關鍵瓶頸問題，通過信息整合、數(shù)據(jù)挖掘、系統(tǒng)建模、層次分析、有效辨識、優(yōu)化設計、整體評價，建立適宜于中醫(yī)藥整體作用特點的中藥組方設計技術，為中藥復方現(xiàn)代化的研究，同時也為中藥的二次開發(fā)和創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供技術支撐。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是在中醫(yī)配伍理論的指導下，應用計算機輔助藥物設計技術，現(xiàn)代生物學技術和數(shù)理統(tǒng)計方法，通過系統(tǒng)建模和優(yōu)化技術，明確中藥有效成分群與方劑配伍的關系，建立基于有效成分群的中藥組方設計技術，為中藥復方的二次開發(fā)和創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供技術支撐。目前，中藥方劑的研究主要集中在基于藥材或飲片(宏觀層面)和基于有效部位(中觀層面)的研究，缺少基于有效成分群(微觀層面)的研究，制約了中藥復方的二次開發(fā)和創(chuàng)新藥物的研發(fā)。本發(fā)明提出的基于中藥有效成分群的中藥組方設計技術正是解決上述問題的有益嘗試，對推進中藥復方的現(xiàn)代化具有積極的意義，本發(fā)明以黃連解毒湯為研究對象，綜合并集成信息整合(化學、生物學信息數(shù)據(jù)庫建立)、數(shù)據(jù)挖掘(方劑巳有藥理作用和分子機制的知識庫建立)、系統(tǒng)建模(基于膿毒癥發(fā)病機制的分子病理模型和細胞、整體水平的藥效模型構建)、層次分析(基于中醫(yī)配伍理論、現(xiàn)代分子生物學和藥理學的有效成分群分類和基于膿毒癥分子、細胞、整體水平藥效模型的癥侯分類)、有效辨識(計算機輔助藥物設計技術和體內(nèi)外藥效模型驗證)、優(yōu)化設計(基于膿毒癥發(fā)病機制的病理模型和計算機輔助藥物設計技術的應用)、整體評價(多指標膿毒癥整體動物模型和多指標綜合指數(shù)評價法)等多項技術，用于黃連解毒湯中藥有效成分群組方設計，最終確定黃連解毒湯中藥有效成分群組方。中藥有效成分群復方或中藥分子復方與以飲片或有效部位配伍的中藥復方相比較，具有化學成分清楚，藥理作用明確、分子機制明了，質(zhì)量標準可控，藥物制劑簡單，臨床應用方便等諸多優(yōu)點。黃連解毒湯中藥有效成分群組方設計技術具有典型和示范作用，亦可用于其它化學成分相對清楚、藥理作用相對明確、方劑藥味組成相對較少的的中藥復方有效成分群組方設計。具體歩驟是①選擇臨床治療膿毒癥的有效方劑黃連解毒湯(黃連、黃芩、黃柏、梔子)作為研究對象，以中醫(yī)配伍理論君臣佐使為指導，根據(jù)膿毒癥發(fā)病機理分子機制對方劑進行君臣佐使有效成分功能群的研究。②應用化學信息學及其相關技術，通過文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問等方法，建立黃連解毒湯各單味藥的化學成分信息數(shù)據(jù)庫。其中包括化合物名稱、分子式、分子量、結構式(二維、三維)、物化性質(zhì)、藥理作用、分子機制、藥代、毒性、臨床應用等。③通過文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問等方法，建立黃連解毒湯復方數(shù)據(jù)庫。其中包括組成、劑量、功能與主治、化學、藥理作用、分子機制、藥代、毒性、臨床應用等。④在文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問、數(shù)據(jù)挖掘的基礎上，針對方劑主要且明確的藥理作用，應用計算機輔助藥物設計技術，系統(tǒng)建立其分子藥理模型。⑤根據(jù)分子藥理模型篩選結果，對有效成分聚類并以得分高低進行排對。◎根據(jù)計算機輔助藥物設計功能分類方法，確定其君臣佐使作用，并對其聚類。⑦根據(jù)計算機輔助藥物設計分子藥理模型篩選結果，分別在對應的體內(nèi)體外藥理模型中驗證。⑧根據(jù)分子藥理模型篩選和君臣佐使聚類結果，結合體內(nèi)體外藥理模型藥理作用強度、多靶點作用和化合物取得難易程度，從每類模型中選取數(shù)個分子組成復方。◎在體現(xiàn)中醫(yī)證侯的整體動物模型中，對組方進行驗證。取得反映復方整體作用特點的基于有效部位群的中藥組方。⑩通過優(yōu)化設計、系統(tǒng)研究和反復驗證，最終建立起適宜于中醫(yī)藥整體作用特點的基于有效成分群的中藥組方設計技術。中藥復方中的每味藥所處君、臣、佐、使地位不同，但它們卻各司其職、互助互補、相互制約、相互協(xié)調(diào)，保持著完美組合，發(fā)揮整體或群體功效。本發(fā)明首先采用計算機輔助藥物設計技術，系統(tǒng)建立膿毒癥表癥分子藥理模型。根據(jù)分子藥理模型篩選結果，對有效成分聚類并以得分高低進行排對，根據(jù)計算機輔助藥物設計功能分類方法，確定其君臣佐使作用，并對其聚類，根據(jù)篩選結果將復方中含有有效成分同樣劃分為君、臣、佐、使群，然后探討不同有效部位群的藥物之間的整體作用。因此，其藥效學試驗、藥理毒理學試驗應以這樣的整體為受試物質(zhì)，分別進行各個"有效部位群"的藥效、藥理毒理試驗。以動物試驗反映這個群體的藥效作用和毒性狀況，為臨床研究提供安全、有效性基礎。本發(fā)明充分借助整體動物實驗、化學信息學、生物信息學、計算機虛擬篩選技術，進行有效部位群中化合物活性的測定、有效部位群之間的相互關系以及組方各階段的研究，將現(xiàn)代植物化學、化學信息學與數(shù)學藥理學密切結合、聯(lián)合應用，最后通過藥理學這一研究工具，以利于我們從微觀到客觀，從局部到整體、從各個層面全方位研究傳統(tǒng)藥物的療效物質(zhì)基礎，獲得更多信息，為臨床研究提供必要的依據(jù)。本發(fā)明建立的中藥有效成分群的中藥組成技術具有高效快捷、經(jīng)濟新穎的特點。該發(fā)明直接對應中藥分子新型復方的產(chǎn)生。上述發(fā)明步驟篩選出來的化學成分分子，大多可以直接定購，少數(shù)不能購買的成分也可以從藥材中提取，取材便利可行。這種分子新復方從原中藥復方中來，繼承了原方的其中一種藥理作用，更具針對性，卻又拋棄了中藥方劑不利于制劑順應性差的缺點，通過藥效毒理實驗驗證之后，便可制劑成方，申報新藥。該發(fā)明前段實驗設計在計算機虛擬狀態(tài)下完成，無需使用和耗費化學藥劑，經(jīng)濟安全，而后期的藥理實驗又對該方法的實際藥效進行了驗證，使該發(fā)明更具合理性。本發(fā)明為中藥復方現(xiàn)代化、中藥復方創(chuàng)新提供了一條可行性思路。圖1是黃連解毒湯化學成分分子庫(部分)。圖2是膿毒癥發(fā)病機理分子機制系統(tǒng)建模。圖3是膿毒癥發(fā)病機理系統(tǒng)建模后耙標。圖4有效成分分子組方(配伍)、整體評價技術路線。具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明并不受限于下述實施例。實施例1研究對象的確定病種及方劑的選擇選取臨床常見難治的膿毒癥和化學成分清楚、主要藥效明確、臨床療效肯定的治療膿毒癥方劑"黃連解毒湯"為研究對象。實施例2復方化學成分數(shù)據(jù)庫的建立本發(fā)明應用化學信息學及其相關技術，通過文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問等方法，建立"黃連解毒湯(黃連、黃芩、黃柏、梔子)"各單味藥的化學成分及復方中由于煎煮等作用新產(chǎn)生的化學成分信息數(shù)據(jù)庫。以中科院上海有機化學研究所的化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫和Dr.Duke'sPhytochemicalandEthnobotanicalDatabases這兩個化合物數(shù)據(jù)庫為主，通過數(shù)據(jù)庫訪問方式收集兩方各單味藥的化學成分，并結合文獻調(diào)研，對復方中因煎煮等作用形成的新成分進行補遺。復方化學成分數(shù)據(jù)庫的信息內(nèi)容包括化合物中英文名稱、分子式、分子量、結構式(二維、三維)、物化性質(zhì)、藥理作用、分子機制、藥代、毒性、臨床應用、相關文獻等。主要利用ISIS/Draw的分子結構描畫功能和ISIS/Base的數(shù)據(jù)庫管理功能創(chuàng)建"黃連解毒湯"。本發(fā)明構建了黃連解毒湯四味組方藥材的四個化學成分子庫，共計分子數(shù)目為222個。(圖1)實施例3針對膿毒癥發(fā)病機理分子機制系統(tǒng)建模(圖2)以膿毒癥為實例，建立相應的病理機制系統(tǒng)模型，見附圖2膿毒癥發(fā)病機理分子機制生物網(wǎng)絡圖。實施例4針對膿毒癥發(fā)病機理系統(tǒng)建模后靶標的確定(圖3)在膿毒癥的病理機制系統(tǒng)模型中，炎癥、細菌感染、發(fā)熱是癥候中的主要矛盾，而這些病理途徑中居于上游的靶點和起決定性作用的靶點是關鍵的靶標。見附圖3"君臣佐使"有效成分分子群與病機靶標對映圖。實施例5有效成分的功能分群以中醫(yī)配伍理論"君臣佐使"為指導，以根據(jù)膿毒癥發(fā)病機理分子機制建立的系統(tǒng)模型為基礎，對"黃連解毒湯"方劑進行"君、臣、佐、使"有效成分功能分群。君藥"分子群根據(jù)中醫(yī)理論，君藥是復方方劑中針對疾病與癥候起主要治療作用的藥物，用藥理學的現(xiàn)代語言闡釋即是針對主要病機靶標的藥物成分。在膿毒癥的藥理機制系統(tǒng)模型中，炎癥是癥候中的主要矛盾，而這些病理途徑中又分布著一些關鍵的靶標。君藥分子群篩分即針對這些關鍵靶標進行。篩分方法綜合運用現(xiàn)代計算機藥物設計與篩選技術和現(xiàn)代分子生物學篩選技術。篩分技術路線以計算機藥物設計與篩選技術為起始運作模塊，對大量的復方化學成分分子進行初步篩分，初歩篩分結果再進入分子生物學篩分通道進行驗證與再次篩分，以此節(jié)約成本與人力物力。I.計算機藥物設計與篩選技術A.分子對接對于在PDB蛋白分子庫中可以找到三維晶體結構的靶標，直接采用分子對接的技術進行研究。以真實實驗數(shù)據(jù)形成的靶標分子三維結構為基礎的分子對接技術，可以保證篩選的精度。對接技術環(huán)節(jié)采用最新的Schrodinger軟件包中的專利技術Induced-fit，靶標的活性結合口袋真正實現(xiàn)柔性處理，并處理靶標口袋體積的伸縮與形狀的柔變，靶標分子與復方化學成分分子實現(xiàn)真正的"誘導契合"式對接，大大加強了活性預測精度。B.同源模建對于目前尚沒有三維晶體結構報道的耙標蛋白，利用同源模建技術構建靶標蛋白，并在此模建蛋白基礎上進行分子對接。C.藥效團搜索對于既沒有三維晶體結構、又無法進行同源模建的靶標蛋白，則利用其配體結構構建活性相關藥效團，利用構建完成的藥效團模型作為提問結構對復方化學成分分子庫進行搜索，命中的化合物即是可能具有該靶標生物活性的化學成分。同時，這項技術同時與以上兩種技術配合使用，加強篩選精度。n.分子生物學篩選由以上計算機藥物設計與篩選技術篩分出來的化合物，進入分子生物學篩選通道進行驗證與二次篩分。最終確定君藥分子群。②"臣藥"分子群在中醫(yī)理論中臣藥是處方中輔助君藥起治療作用的藥物，那么用現(xiàn)代藥理學的語言闡釋就是針對次要或起輔助作用的病機耙標的復方化學成分分子。臣藥分子群的篩分與君藥分子群的篩分流程是一樣的，所不同的是針對不同的靶標。③"佐藥"分子群依據(jù)中醫(yī)理論，佐藥是處方中佐助君藥臣藥，或與君藥臣藥能相反相成起治療作用的藥物。佐藥作用的現(xiàn)代藥理學闡釋可能與一些非治療性藥物靶點相關，如P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白等。P-糖蛋白是ATP結合和轉(zhuǎn)運載體蛋白中最大的一個亞系，它在許多組織有分布，是一種ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運體，作為藥物轉(zhuǎn)運子，其作用類似于排出泵，可將藥物從細胞內(nèi)外排而使胞內(nèi)藥物濃度降低，從而降低藥效。因此，p-糖蛋白與底物及調(diào)節(jié)子之間的相互作用能影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄。抑制p-糖蛋白可以有效增強主要藥效成分"君臣"藥物的藥效作用。因此，中藥復方"佐藥"分子群對君臣藥的佐助作用很可能是通過對p-糖蛋白這一類非治療性藥物靶點產(chǎn)生作用而實現(xiàn)的。對佐藥分子群的篩分依據(jù)以上理論分析，采用計算機輔助藥物篩選技術，以p-糖蛋白等非治療性靶點為篩選模板，篩分復方化學成分分子庫中的佐藥分子。④"使藥"分子群在中醫(yī)理論中"使藥"是處方中引導諸藥達到患病臟腑、相關經(jīng)絡、病位。研究發(fā)現(xiàn)，一些化合物分子可通過增加負責藥物運輸?shù)乃视屯ǖ赖鞍?、有機陰、陽離子轉(zhuǎn)運體的含量，促使進入細胞的藥物含量增多；另一方面，一些化合物分子可以通過改變其他藥物分子作用的內(nèi)環(huán)境，如增加細胞膜的通透性，而達到"引經(jīng)"的作用，如冰片中的龍腦可以改變細胞膜通透性，促進血-腦脊液屏障開放，引藥入腦。這些作用均納入"使藥"作用，具有這些作用的復方化學成分分子篩分進入"使藥"分子群。使藥分子群的篩分首先利用計算機QSAR(定量結構-活性關系)藥物活性預測技術結合人工智能技術如人工神經(jīng)網(wǎng)絡和支持向量機技術，以己知的具有以上作用的化合物為訓練集，訓練產(chǎn)生使藥識別模型，對復方中的化學成分分子進行分類識別，篩分可能具有"使藥"功能的化學成分。篩分出來的化合物再采用細胞生物學、分子生物學等相關技術對其進行驗證與二次篩分，通過測量這些化學成分分子對水甘油通道蛋白等的含量、細胞膜通透性的改變程度等驗證并評價篩分最終"使藥"分子群。實施例6君藥有效成分群的計算機藥物設計與篩選技術-分子對接分子對接對于在PDB蛋白分子庫中可以找到三維晶體結構的靶標，直接采用分子對接技術進行研究。選擇數(shù)據(jù)庫中入錄分子的三維結構作為靶標分子為基礎進行分子對接技術研究，具有較好的篩選精度。對接技術環(huán)節(jié)采用最新的Schrodinger軟件包中的專利技術Induced-fit，耙標的活性結合口袋真正實現(xiàn)柔性處理，并處理靶標口袋體積的伸縮與形狀的柔變，耙標分子與復方化學成分分子實現(xiàn)真正的"誘導契合"式對接，大大加強活性預測精度。黃連解毒湯分子庫222個分子與C0X-2對接結果打分見表1，并按打分高低排序。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，打分大于5.0以上的分子有25個，說明黃連解毒湯中存在有效的C0X-2抑制活性化學成分，如己有C0X-2抑制活性報道的阿魏酸，在本發(fā)明中阿魏酸的打分為5.56，排序前十位。表1C0X-2分子對接打分表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>ferulicacid5.56alpha-cubebene5.55isoeugenol5.557-methoxybaicalein5.49methyldihydrojasmonate5,45phtha丄icacid-diocty1-ester5.38baicalcin5,29moslosooflavonc5.25neocnidi1ide5.224-phenyl-but-cis-3-eD-2-one5.21genipin5.16rivu丄arin5.155，2'，7'-trihydroxy-8-methoxy士'丄avanone5.13n-butylphthalide5.08panicolin5.02skullc即flavonel5.02scute柳oenin4,93實施例7君藥有效成分群的計算機藥物設計與篩選技術-同源模建同源模建對于目前尚沒有三維晶體結構報道的靶標蛋白，利用同源模建技術構建靶標蛋白，并在此模建蛋白基礎上進行分子對接。本發(fā)明中針對IKK-2的篩選采用這種方法。技術路線為l)序列比對利用Schrodinger軟件包中的Prime模塊比對IKK-2與蛋白庫中的同源蛋白，找到合適的同源模建蛋白模板。2)蛋白模建以找到的同源蛋白為模板，進行IKK-2激酶的蛋白模建，特別是對于結合口袋的模建非常關鍵，采用與己知配體聯(lián)合模建的方法，得到精確的蛋白模型。3)分子對接以同源模建的IKK-2蛋白為模板進行復方分子庫的對接。GALAHAD得到藥效團模型20個，結合IKK-]3同源模建體活性位點的分析，同時考慮藥效團模型能量打分，經(jīng)挑選得到藥效團模型。將該藥效團模型置入AndrewBaxter等構建的同源模建IKK-2活性結合腔中，發(fā)現(xiàn)該模型與IKK-2結合口袋的關鍵位點十分吻合。以該藥效團模型為"提問模板"進行Unity的化合物搜索。得到命中化合物40個。表2中列出了所有搜索到的40個命中化合物，QFIT表示化合物與藥效團模型命中程度的打分表2Unity搜索到的IKK-2抑制活性藥效團命中化合物10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例8君藥有效成分群的抗炎耙點PDE-4的虛擬篩選黃連解毒湯化學成分分子與PDE-4的對接結果如表3，并依據(jù)對接打分高低排序。由于PDE-4的活性口袋并非封閉性結合腔，對接分子與結合腔殘基的碰撞情況較少，所以整體的對接打分并無太多低分或負分，但是對接打分高的分子仍然應視為可能具有PDE-4抑制活性的化合物。統(tǒng)計結果表明，對接打分大于5.0的分子有23個，這說明黃連解毒湯中具有天然PDE-4抑制劑存在。表3PDE-4分子對接打分表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例9君藥有效成分群中化學成分的綜合評價以C0X-2和PDE-4分子對接打分排序前20%的分子作為可能具有C0X-2和PDE-4抑制生物活性的分子，IKK-2藥效團搜索命中的分子作為可能具有IKK-2抑制生物活性的分子，分析黃連解毒湯化學成分的多耙導向作用。表4列出了可能同時抑制2個及2個以上耙酶的分子，共計28個，其中2個分子對三個靶標都呈現(xiàn)抑制作用。表4黃連解毒湯化學成分的針對多靶的綜合評價<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5，2'，5'-trihydro:xy-6，7，8-trimethoxyflavanone+—+5，2'-dihyrdoxy-6，7，8-trimethoxyflavone++5，5'-dimethylfurfuralether++一5，7，4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone+—+5，8-dihydroxy-6，7-dimethoxyflavone++一baicalein—++chlorogenicacid-++chrysin-6-C-beta-glucoside—++gardoside—+十geniposide—++herculin++—isoscutellarein-8-O-glucoside++—ligustilide++—lirmlool++methyldihydrojasmonate++—oroxylin-A-7-0-glucuronide—++phthalicacid-dioctyl-ester++—rivularine++一salidroside+++scuteamoenin+—+viscidulinll++wogonin-5-beta-D-glucoside—++wogonin-7-beta-D-gluconide-methyl-ester一++wogonoside—++本發(fā)明中選取目前已經(jīng)明確的炎癥靶標COX-2、IKK-2、PDE-4，以之為篩選靶點對黃連解毒湯化學成分分子庫進行虛擬篩選，并在此基礎上進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯中存在大量具有多靶導向作用的分子，即能同時對兩個或兩個以上的耙點產(chǎn)生作用，抑制它們的活性，這說明中藥復方的多靶治療作用是有物質(zhì)基礎的，在此基礎下篩選的多耙點化學成分進行體內(nèi)外藥理活性的研究。實施例10君藥有效成分群的分子生物學篩選-COX-2酶抑制活性測試COX-2酶抑制活性測試應用體外酶反應實驗體系，采用EIA法觀察受試化合物對環(huán)氧化酶-2(C0X-2)純酶活性的影響。參照試劑盒說明書，96孔酶標板設試劑空白對照孔、SI-S8標準對照孔、TA孔、NSB孔、B0孔、C0X-2空白對照孔、C0X-2100%酶活性孔、樣品孔等，每孔設兩個復孔。樣品孔中加入950uL反應緩沖液[O.1MTris-HCl(pH8.0)含5mMEDTAand211M苯酚]、10iiL亞鐵血紅素、10uL。COX-2、20uL倍比稀釋的不同濃度的受試化合物溶液；100%酶活性孔除不加受試化合物外，其余同樣品孔COX-2空白對照孔加970wL反應緩沖液、10uL亞鐵血紅素和滅活的C0X-210uL。各孔37。C預孵IO分鐘后，加入花生四烯酸(100umol/L)混勻后37°C，水浴2分鐘后，加入50yL1MHC1終止酶反應。取出后各管加入IOOpLSnC12。溶液混勻置室溫避光反應5分種。標準對照對照孔加倍比稀釋的不同濃度的PGE2以酶免疫測定法(EIA法)檢測前列腺PGE2。，以PGE2。的生成量計算酶的活性。計算IC50，分析其對酶活性的抑制強度及選擇性。實施例ll君藥有效成分群的分子生物學篩選-IKK-2抑制活性測試IKK-2抑制活性測試實驗方法將IkB-a底物及ATP的溶液加于以受試化合物預先培養(yǎng)5分鐘于含IKK-2酶的聚丙烯板內(nèi)開始反應。然后將反應混合物于25"C培養(yǎng)1小時，置于冰上通過加150u].10%三氯醋酸及5%焦磷酸二鈉停止反應?；旌虾?，將整個停止反應的反應混合物移入預濕的PackardUnifilter過濾板，抽吸并用250yLddH20洗6次，使用PackardFiltermateHarvester。然后將過濾板風干，補充40yLMicroscint20閃爍液，使用PackardT叩Count閃爍計數(shù)器定量"P-標記的反應產(chǎn)物，可以得到不同化合物IKK-2抑制活性。實施例12君藥有效成分群的分子生物學篩選-PDE-4抑制活性測試PDE-4抑制活性測試:實驗材料96孔微量滴定板(MTS);混合物(20mMTris(pH7.4)，5mMMgCl2,0.5pMcAMP，[:!H]cAMP(約30，OOOcpm/測定)，試驗化合物，主要含有PDE4活性物的人嗜中性粒細胞胞質(zhì)溶膠)；PDE-3特異性抑制劑Motapizone(liiM);DMSO;;5'-核苷酶(響尾蛇毒液(Crotalusatroxsnakevenom);QAES印hadexA-25柱;甲酸銨(pH6.0)。實驗方法37'C預溫育5分鐘后，加入底物(cAMP)啟動反應，于37'C進一步溫育測定物15分鐘。加入50yl0.2NHCL終止反應，在冰上放置測定物約10分鐘。在37。C與25yg5'-核苷酶(響尾蛇毒液(Crotalusatroxsnakevenom))—起溫育10分鐘后，將測定物上柱到QAES印hadexA-25柱(lml床體積)。柱用2ml30mM甲酸銨(PH6.0)洗脫，計數(shù)洗出液測定放射活性，然后得出不同化合物對PDE-4抑制活性。實施例13君藥有效成分群的分子生物學篩選-HMGB-l抑制活性測試HMGB-1抑制活性測試實驗材料動物模型制備清潔級雄性Wistar大鼠，體重220250g。大鼠適應性詞養(yǎng)1周后行CLP，復制嚴重腹腔感染致膿毒癥模型。術前將大鼠稱重、編號，并禁食12h，自由飲水。以鹽酸氯胺酮注射液與速眠新II注射液按8:3體積比混合，肌肉注射麻醉大鼠后固定，常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾。沿腹正中線作一長約1.5cm的切口，暴露盲腸并于根部結扎，避免結扎回腸以及盲腸系膜血管，用16號穿刺針貫通穿刺盲腸3次形成腸瘺，并留置一條寬2.0ram的橡皮片以防針孔閉合。將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術畢立即皮下注射生理鹽水抗休克，術后自由飲水。動物分組及給藥將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、假手術組、模型組和治療組4組。治療組分別于CLP后0.5、12、24、36、48和60h經(jīng)陰莖背靜脈注射供試品，按照觀察時間點分為CLP后2、8、24、48和72h時間點，每個時間點8只動物；模型組依同法分組并平行注射等量生理鹽水。標本采集與處理按相應時間點將動物麻醉后，腹主動脈無菌采血，留取3ml血于質(zhì)量分數(shù)為3.8。/。的枸櫞酸鈉(1:9)抗凝試管中，4。C下離心5min，分離血漿，-80。C保存待測。檢測指標血漿HMGB-l含量用HMGB-l酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定血漿HMGB-1含量，檢測步驟嚴格按說明書進行，將樣品吸光度(A)值代入標準曲線，計算出樣品HMGB-1濃度。受試化合物對HMGB-l的抑制作用采用以上方法檢測。實施例14君藥有效成分群的生物學篩選-內(nèi)毒素抑制活性的實驗內(nèi)毒素抑制活性的生物實驗體外鱟試劑定性法試驗設受試分子組、地塞米松陽性對照組、內(nèi)毒素組、溶媒對照組、陰性對照組。將侯選分子組、地塞米松用溶媒稀釋為一系列所需濃度，用試劑溶解液將內(nèi)毒素溶解(10IU/ml).在O.Olml內(nèi)毒素加入0.lml藥液，于37'C恒溫水浴中保溫1小時或4小時。其它組同樣條件下溫浴。溫浴后，另取一套試管分別加入鱟試劑0.lml及溫浴反應后之反應液0.lml混勻，再置37t:恒溫水浴中保溫1小時，第二次溫浴后輕輕取出試管架，緩緩將試管架倒轉(zhuǎn)180°，觀察判斷試驗結果。以管內(nèi)呈堅實之凝膠者為(+)，不呈凝膠狀或呈凝膠狀但不能保持完整者為(-)。通過該試驗觀察受試分子體外抗內(nèi)毒素作用并為體內(nèi)試驗劑量設計提供依據(jù)。體內(nèi)抗內(nèi)毒素活性實驗取昆明種小鼠，隨機分組，每組12只小鼠，正常組灌胃自來水每天0.5mL，連續(xù)4d;受試組灌胃不同劑量的黃連解毒湯4d，末次給藥后受試組、正常組、地塞米松組腹腔注射D—GALN150mg/kg，24h后眼睚取血分離血清，置-30°C冰箱，待測IL-2。實施例15君藥有效成分群的生物學篩選-抑菌實驗抑菌實驗主要針對膿毒癥常見感染源革蘭氏陰性菌，也包括部分革蘭氏陽性菌，具體如下肺炎鏈球菌(31002)、金黃色葡萄球菌(26003)、綠膿假單胞菌(10104)、大腸埃希菌(44102)。經(jīng)活化、鑒定后取對數(shù)生長期菌液進行實驗肺炎鏈球菌37'C培養(yǎng)18h，肺炎鏈球菌用血清肉湯培養(yǎng)基及血液瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)外，其它3種菌均用肉膏湯及普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。1)瓊脂擴散法(抑菌環(huán)直徑大小的測定)取直徑12cm平皿，傾入培養(yǎng)基(血液瓊脂培養(yǎng)基或普通瓊脂培養(yǎng)基)15mL，冷凝后用滅菌的棉拭子蘸取供試菌菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，室溫下放置一定時間。用直徑6mm的打孔器在瓊脂平皿上打孔，每孔加一定量藥液，每種藥液設3L。37'C培養(yǎng)24h后取出，測抑菌環(huán)直徑，并求出每種藥液3個孔抑菌環(huán)直徑的平均值。2)試管稀釋法(MIC、MBC的測定)取無菌試管若干支，用液體培養(yǎng)基(血清肉湯或肉膏湯)等倍稀釋藥物后，各管加0.1mL供試菌液，同時設培養(yǎng)基對照管和菌液對照管，37'C培養(yǎng)24h后取出觀察結果，在對照管符合要求的情況下，逐一觀察各試驗管，以能抑制試驗菌生長的藥物最高稀釋度為最低抑菌濃度(MIC)，并將各無菌生長的試管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至相應培養(yǎng)基的瓊脂平板上。37'C培養(yǎng)24h后取出觀察結果，以殺死99.9%試驗菌菌體的藥物最高稀釋度為最低殺菌濃度(MBC)。實施例16君藥有效成分群的生物學篩選-解熱作用解熱作用的動物實驗取Wistar種大鼠50只，體重220-250g，雌雄各半，分為受試化合物高中低劑量三組、阿斯匹林陽性對照組組及生理鹽水空白對照組。除生理鹽水組外其余各組大鼠給與參考劑量篩選得出的目標化合物，注射后2h給藥，每隔lh測l次肛溫.連續(xù)8h。記錄服藥前體溫及服藥后不同時間的體溫變化。受試化合物的降溫效果與對照組比較并進行統(tǒng)計學分析，判定受試化合物的解熱作用并給出最佳劑量參考。實施例17其他有效成分分子群的研究各有效部位群均采用上述研究方法進行系統(tǒng)篩選，針對不同靶點和病理模型針對不同有效群進行逐個分析研究，得出各有效部位群中關鍵的有效成分分子。實施例18有效成分分子組方(配伍)、整體評價原則與方法組方(配伍)遵循的基本原則經(jīng)過系統(tǒng)篩選和驗證得到的"君臣佐使"有效成分分子群，還須進行有效成分的配伍設計得到與原方藥理作用相同(或大于原方藥理作用)的新方劑。中藥有效成分群配伍的研究，其實質(zhì)是藥物相互作用動力學的研究。當中藥有效成分群配伍時，中藥有效成分間發(fā)生不同類型的相互影響，綜合表現(xiàn)為藥效的增強或減弱等，通過分析多個有效成分不同劑量與效應間的定量規(guī)律，最終實現(xiàn)中藥有效成分群配伍的最優(yōu)化。中藥有效成分群組方的基本原則是有理、有利、有據(jù)。有理就是在中醫(yī)理論和藥理機制上，組方或配伍有合理的文獻或?qū)嶒炓罁?jù)。有利就是藥效上有協(xié)同作用而毒性不增；毒性降低或毒性器官分散，而藥效不減；起效或作用時間互補；藥效范圍擴展，作用于多種癥狀。有據(jù)就是組分藥選擇合理；劑量配比合適，已接近最佳配比；用藥劑量恰當，過小藥效減小，過大并無必要。其次，科學、合理、客觀的中藥有效成分群復方，必須選擇理想的整體評價方法。中藥有效成分群組方的理想評價方法是數(shù)學上可立。數(shù)學模型嚴謹；專業(yè)上可行。具有治療學價值；統(tǒng)計上可信。測定指標合理；邏輯上合理。根據(jù)以上原則，由于中藥17有效成分群復方為多成分、多劑量和多比例配伍，應將多指標進行單一化處理，即綜合分析。多指標綜合指數(shù)法由于可以對多指標進行綜合分析，所以更適合中藥有效成分群組方進行評價。通過以上信息整合、數(shù)據(jù)挖掘、系統(tǒng)建模、層次分析、有效辨識、優(yōu)化設計、整體評價等研究過程，建立黃連解毒湯中藥有效成分群組方技術。最終確定黃連解毒湯中藥有效成分群組方。實施例19有效成分分子組方(配伍)、整體評價技術路線遵循中醫(yī)配伍理論和中藥有效成分群組方有理、有利、有據(jù)的原則進行。依據(jù)均勻設計的原理，以"君臣佐使"四個有效分子群為考察因素，分子個數(shù)為考察水平，導出新配伍方劑。每個分子以最佳劑量配伍入方。組方與整體評價技術路線見圖4。實施例20中藥有效成分群分子組方入選標準①同類中藥有效成分群分子中藥效作用強的分子優(yōu)先入選；②同類中藥有效成分群分子中藥效作用相同或相近時，參考計算機篩選、體外篩選和文獻報道結果進行綜合評價，選優(yōu)者。③同類中藥有效成分群分子中上述①和②相同或相近時，作用靶點多者優(yōu)先。④同類中藥有效成分群分子中上述①、②和③相同或相近時，易獲得者(在中藥中有效成分含量高、制備方法簡單)優(yōu)先。⑤同類中藥有效成分群分子中上述①、②、③和④相同或相近時，劑量小(用量少)者優(yōu)先。實施例21入選有效成分分子組方后驗證試驗建立試驗動物模型，針對不同的病理模型將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、假手術組、模型組、陽性對照組和治療組。治療組根據(jù)臨床給藥途徑給藥。模型組依同法分組并平行給予等量生理鹽水，陽性對照組分別給予黃連解毒湯煎劑，觀察得出結果。實施例22有效成分中抗炎作用分子預方的藥理實驗藥效驗證建立二甲苯致小鼠耳廓腫脹的炎癥藥理模型，對實施例17得到的黃連解毒湯抗炎作用分子預方中的每個成分小檗堿、阿魏酸、7—甲氧基黃芩素、京尼平分別進行抗炎藥效驗證。1.材料1.1實驗動物本研究所自行繁殖昆明種小鼠，雌雄各半，體重20.0士2.0g。1.2藥物小檗堿、阿魏酸、7—甲氧基黃芩素、京尼平均購于sigma公司。用蒸餾水溶解配成溶液備用。陽性對照藥物為黃連解毒湯水煎煮濃縮液(0.8g生藥/ml)。二甲苯(分析純)購于天津大學科威公司。1.3儀器電子精密天平，日本，ShimadzuAUY220。2.實驗方法取60只小鼠隨機分為6組，每組10只，各組分別灌胃給藥，空白對照組灌以蒸餾水，受試組分別給予4種受試藥物，均按照150mg/kg給藥，陽性對照組按25ml/kg給藥，連續(xù)7d。所有小鼠，于末次給藥后12h，右耳涂以二甲苯0.05ml，2h后，脫椎處死小鼠，剪取小鼠兩耳用直徑O.9cm的打孔器取其耳片，稱重。小鼠耳廓腫脹度計算腫脹度-右耳重量一左耳重量。腫脹抑制率計算腫脹抑制率=(空白組腫脹度一給藥組腫脹度)/空白組腫脹度X100%。3.實驗結果表5抗炎藥理實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注與空白組比較，*p<0.01，**p<0.001實驗結果(表5)表明5種藥物均有一定的抗炎效果，可用于"黃連解毒湯"抗炎作用分子新復方的組方成分。實施例23抗炎作用分子新復方的劑量配比與實驗設計運用均勻設計軟件UD2.2，以實施例18得到的4個分子為影響因子，因子取7水平，各因子水平都取200、100、50、25、12.5、6,25、0(單位:mg/kg)。軟件生成均勻設計表117，根據(jù)設計表安排各因子和水平，得到表2的實驗方案，其中一列為一種藥，一行就是一種新配方，按表中行數(shù)值取相應的藥混合即得此配方，共7種，其中第7組即為空白對照組，同時設黃連解毒湯水煮液陽性對照組。實施例24抗炎作用分子新復方的抗炎藥理實驗1.材料1.l實驗動物本研究所自行繁殖昆明種小鼠，雌雄各半，體重20.0士2.0g。1.2藥物小檗堿、阿魏酸、7—甲氧基黃芩素、京尼平均購于sigma公司。用蒸餾水溶解配成溶液備用。陽性對照藥物為黃連解毒湯水煎煮濃縮液(0.8g生藥/ml)。二甲苯(分析純)購于天津大學科威公司。1.3儀器電子精密天平，日本，ShimadzuAUY220。2.實驗方法取80只小鼠隨機分為8組，每組10只，小鼠分別按表1灌胃給予受試藥物，陽性對照組按25ml/kg給藥，連續(xù)7d。所有小鼠，于末次給藥后12h，右耳涂以二甲苯0.05ml，2h后，脫椎處死小鼠，剪取小鼠兩耳用直徑O.9cm的打孔器取其耳片，稱重。小鼠耳廓腫脹度計算腫脹度=右耳重量_左耳重量。腫脹抑制率計算腫脹抑制率=(空白組腫脹度一給藥組腫脹度)/空白組腫脹度X100X。3.實驗結果結果見表6。黃連解毒湯水煎液陽性對照組腫脹抑制率為71.25%。直觀分析，各種配方均有很好的炎癥抑制效果，尤其是第一種配方炎癥抑制率甚至超過了黃連解毒湯水煎液陽性對照。由軟件生成的回歸方程y=16.3+0.24*X(l)+0.128*X(2)+0.0802*X(3)+0.246*X(4)X(l)代表小檗堿給藥劑量；X(2)代表阿魏酸給藥劑量X(3)代表7_甲氧基黃芩素給藥劑量；X(4)代表京尼平給藥劑量y代表腫脹抑制率。因為回歸系數(shù)某種程度上代表了其對應變量對結果炎癥抑制率的貢獻大小，通過回歸系數(shù)比較0.24:0.128:0.0802:0.2466:3:2:6，粗略推測該黃連解毒湯抗炎作用分子新復方以小檗堿阿魏酸7—甲氧基黃芩素京尼平=6:3:2:6的配比成方炎癥抑制效果可能會更好，經(jīng)藥理實驗驗證，其腫脹抑制率為71.02%，因此保留第一種配方32:16:8:1的劑量配比。表6配方均勻設計表及實驗結果組別繁賦阿魏酸7—甲氧基黃萃素京尼平耳廓腫脹度(mg)抑制率(1200.0100.050.06.256.2±1.5**72.322100.025.06.2512.59.2±2,1*58.93350.06.25100.025.08.9±2.8*60.27425.0200.012.550.07.6±2.4*66.0712.550.0200.0100.09.0±2.2*59.8266.2512.525.0200.06.7±2.3*70.097000022.4±3.00注與空白組比較，*p<0.01，**p<0.00120權利要求1、本發(fā)明提供一種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該技術集成信息整合(化學、生物學信息數(shù)據(jù)庫建立)、數(shù)據(jù)挖掘(方劑已有藥理作用和分子機制的知識庫建立)、系統(tǒng)建模(基于發(fā)病機制的分子病理模型和細胞、整體水平的藥效模型構建)、層次分析(基于中醫(yī)配伍理論、現(xiàn)代分子生物學和藥理學的有效成分群分類和基于病癥分子、細胞、整體水平藥效模型的癥侯分類)、有效辨識(計算機輔助藥物設計技術和體內(nèi)外藥效模型驗證)、優(yōu)化設計(基于發(fā)病機制的病理模型和計算機輔助藥物設計技術的應用)、整體評價(多指標整體動物模型和多指標綜合指數(shù)評價法)等多項技術，用于中藥有效成分群組方設計。主要包括以下步驟1)選擇臨床有效方劑黃連解毒湯作為研究對象。2)應用化學信息學及其相關技術，通過文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問等方法，建立方劑黃連解毒湯各單味藥的化學成分信息數(shù)據(jù)庫。其中包括化合物名稱、分子式、分子量、結構式(二維、三維)、物化性質(zhì)、藥理作用、分子機制、藥代、毒性、臨床應用等。3)通過文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問等方法，建立黃連解毒湯復方數(shù)據(jù)庫。其中包括組成、劑量、功能與主治、化學、藥理作用、分子機制、藥代、毒性、臨床應用等。4)在文獻調(diào)研、數(shù)據(jù)庫訪問、數(shù)據(jù)挖掘的基礎上，針對方劑主要且明確的藥理作用，系統(tǒng)建立其膿毒癥分子藥理模型。5)以中醫(yī)配伍理論君臣佐使為指導，根據(jù)膿毒癥發(fā)病機理分子機制對方劑進行君臣佐使有效成分功能群的研究。6)應用計算機輔助藥物設計技術，并結合分子藥理模型篩選結果，對有效成分聚類并以得分高低進行排對。7)根據(jù)計算機輔助藥物設計分子藥理模型篩選結果，分別在對應的體內(nèi)體外藥理模型中驗證。8)根據(jù)分子藥理模型篩選和君臣佐使聚類結果，結合體內(nèi)體外藥理模型藥理作用強度、多靶點作用和化合物取得難易程度，從每類模型中選取數(shù)個分子組成分子復方。9)在體現(xiàn)中醫(yī)證侯的整體動物模型中，對組方進行驗證。取得反映復方整體作用特點的基于有效部位群的中藥組方。10)通過優(yōu)化設計、系統(tǒng)研究和反復驗證，最終建立起適宜于中醫(yī)藥整體作用特點的基于有效成分群的中藥組方設計技術，得到新的中藥分子復方。2、根據(jù)權利要求i所述的一種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該方法不僅僅應用于權利要求l中(1)中所提到的黃連解毒湯，同時也可以應用于臨床治療有效、發(fā)病機理研究明確其他任何方劑。3、根據(jù)權利要求l和權利要求2所述的-種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該方法不僅僅應用于權利要求1中(1)中所提到的膿毒癥病理模型，同時也可以應用于發(fā)病機理研究明確的其他任何病理模型的研究。4、根據(jù)權利要求1所述的一種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該方法中(4)涉及到分子藥理模型建立中使用計算機輔助藥物設計時使用的軟件和方法不僅僅為實施例所列舉，同等效果技術和方法亦可互相取代。5、根據(jù)權利要求1所述的一種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該方法中(5).涉及到有效成分相似性聚類，以復方分子數(shù)量為指標，控制聚類相似度，在結構相似的分子群中挑選類藥性評分靠前的分子進入對接，以加快對接速度，提高工作效率。6、根據(jù)權利要求]所述的一種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該方法中(8)根據(jù)分子藥理模型篩選和君臣佐使聚類結果，結合體內(nèi)體外藥理模型藥理作用強度、多耙點作用和化合物取得難易程度，選擇候選分子組成新分子復方，其中候選分子的數(shù)目無嚴格限制，根據(jù)每個實驗結果綜合分析得出合理數(shù)目。7、根據(jù)權利要求1所述的-種基于有效成分群的中藥組方設計技術，其特征在于該方法同樣適用于成分復雜的單味中藥藥效物質(zhì)基礎、作用機理及藥效物質(zhì)基礎系藥理篩選和驗證模型建立，步驟(1)、(2)、(3)中的研究對象替換為單味中藥，其他步驟如權利要求1所述。全文摘要本發(fā)明是以黃連解毒湯為研究對象，綜合并集成信息整合(化學生物學信息數(shù)據(jù)庫建立)、數(shù)據(jù)挖掘(方劑已有藥理作用和分子機制的知識庫建立)、系統(tǒng)建模(基于膿毒癥發(fā)病機制的分子病理模型和細胞、整體水平的藥效模型構建)、層次分析(基于中醫(yī)配伍理論、現(xiàn)代分子生物學和藥理學的有效成分群分類和基于膿毒癥分子、細胞、整體水平藥效模型的癥侯分類)、有效辨識(計算機輔助藥物設計技術和體內(nèi)外藥效模型驗證)、優(yōu)化設計(基于膿毒癥發(fā)病機制的病理模型和計算機輔助藥物設計技術的應用)、整體評價(多指標膿毒癥整體動物模型和多指標綜合指數(shù)評價法)等多項技術，用于黃連解毒湯中藥有效成分群的組方設計，最終確定黃連解毒湯中藥有效成分群組方。本發(fā)明建立的中藥有效成分群的中藥組方技術具有示范、高效、快捷、經(jīng)濟、新穎的特點。應用該發(fā)明可產(chǎn)生基于中藥有效成分群的中藥分子新復方，為中藥復方現(xiàn)代化、中藥復方創(chuàng)新提供了一條可行性思路。文檔編號G06F19/00GK101615222SQ20081005360公開日2009年12月30日申請日期2008年6月23日優(yōu)先權日2008年6月23日發(fā)明者劉培勛,李欣孺,陳龍飛,靜高,偉龍申請人:中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所