專利名稱：一種中藥有效成分的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥有效成分的檢測(cè)方法，具體為利用活性細(xì)胞與中藥中有效成分的相互作用檢測(cè)出中藥有效成分的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的中藥活性成分的研究，通常是采用植物化學(xué)的方法提取其中的有效部位化合物群或單體化合物，再經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。中藥成分復(fù)雜，一味中藥就含有幾十甚至數(shù)百個(gè)化合物，而一個(gè)由多種中藥組成的復(fù)方，其中化學(xué)成分就更多了，再經(jīng)過煎煮過程后，其中化學(xué)成分又可能產(chǎn)生化合或分解等新的變化。在眾多的化學(xué)成分中，而有效成分往往含量低微，因此其分離分析操作煩瑣，工作量大，周期長(zhǎng)，成功率低，并且不能完全闡明中藥多成分，多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。
生物色譜是用于考察藥物對(duì)細(xì)胞膜、受體、酶等結(jié)合情況的一種較新的方法，該方法是以硅膠或凝膠為載體，其上涂敷或鍵合上活性細(xì)胞膜或受體、酶等制備而成色譜固定相，根據(jù)藥物與細(xì)胞膜或受體、酶的相互作用的強(qiáng)弱不同而將不同的藥物分離開來。該方法亦可用于從中藥中篩選與生物膜或受體、酶等有相互作用的化學(xué)成分，但其在實(shí)際使用中存在諸多缺憾。例如1、細(xì)胞膜、受體、酶與硅膠等載體結(jié)合后其生物學(xué)特征會(huì)受到一定的影響。2.細(xì)胞膜、受體、蛋白等是從細(xì)胞上分離出來的，生物學(xué)特征可能受到一定的影響。3、該方法對(duì)色譜流動(dòng)相有著嚴(yán)格的限制，即只能以生理緩沖液或極低濃度的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，否則會(huì)破壞生物膜，這樣使色譜利用不同流動(dòng)相而實(shí)現(xiàn)不同性質(zhì)的化合物的分離的特點(diǎn)難以發(fā)揮，化合物在生物色譜上難以實(shí)現(xiàn)彼此的相互分離。4，生物色譜的制備程序因?yàn)樵黾恿斯枘z介質(zhì)與細(xì)胞膜、受體、酶等的結(jié)合過程，過程復(fù)雜，條件嚴(yán)格，成本較高，如市售的蛋白柱高達(dá)上萬元一個(gè)。參見汪海林等，分子生物膜色譜用于中藥活性成分篩選及質(zhì)量控制方法的研究，色譜，1999，17(2)123-124；趙惠如等，用細(xì)胞膜色譜篩選當(dāng)歸中的有效成分，中國藥學(xué)雜志，2000；35(1)13-15；孔亮等，以人血清白蛋白為固定相的分子生物色譜分析幾種中藥活性成分的研究，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(1)36。賀浪沖等固定在硅膠表面細(xì)胞膜的酶活性及其色譜特性科學(xué)通報(bào)，1999(6)633-637。趙小娟等，淫羊藿根與葉活性成分的分析和比較，分析化學(xué)，2002 30(2)195-197。高琨等用細(xì)胞膜色譜法篩選研究紅毛七中的有效成分中國藥學(xué)雜志，2003(1)14-16。
上述所有文章提供的圖譜對(duì)藥物的分離效果都不好，所有的流動(dòng)相是用緩沖液，不能與LC-MS聯(lián)用，硅膠介質(zhì)價(jià)格較高。在毛希琴等，三種色譜模式聯(lián)用在中藥活性成分初步篩選中的應(yīng)用，分析化學(xué)2003，31(8)992-995.的文獻(xiàn)中，有川芎在模擬生物膜色譜柱、蛋白色譜柱和反相柱上的分離圖譜，顯而易見生物膜色譜的分離效能不理想，不如反相色譜柱。
發(fā)明人曾研究利用生物膜與中藥中有效成分的相互作用檢測(cè)出中藥有效成分。藥物進(jìn)入人體后發(fā)揮作用，主要是藥物分子與細(xì)胞上的靶點(diǎn)即生物大分子包括酶、受體、通道等特異性的結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)第二信使分子產(chǎn)生生物效應(yīng)，最終發(fā)揮藥理作用。所以，細(xì)胞是絕大部分藥物產(chǎn)生作用的靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的問題在于研究一種快捷，準(zhǔn)確，體現(xiàn)中藥多成分協(xié)同作用的檢測(cè)中藥中與活性細(xì)胞有相互作用的化學(xué)成分的方法，盡可能地避免因細(xì)胞的生物學(xué)特征受到影響而影響到有效成分的篩選的準(zhǔn)確性，提高有效成分的分離效果，并且在篩選有效成分的同時(shí)獲得其結(jié)構(gòu)信息，以便快速的從中藥中尋找可能具有活性的先導(dǎo)化合物或化合物群。同時(shí)該方法相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，并可以作為中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充手段。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一種中藥有效成分檢測(cè)方法，包括如下步驟取待測(cè)中藥，用溶劑提取，得中藥提取液備用；將中藥提取液與活性細(xì)胞混合，培養(yǎng)后，取上清液；用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液的上清液。
所述檢測(cè)方法中，待測(cè)中藥是單味中藥或中藥復(fù)方；提取中藥的溶劑可以是水和/或有機(jī)溶劑；對(duì)含有機(jī)溶劑提取液，濃縮去除全部有機(jī)溶劑后，用緩沖液或低于3％的增溶劑溶解，制成中藥提取液備用。具體提取中藥的溶劑可選自水、C1-C5的低級(jí)醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它們的混合物；C1-C5的低級(jí)醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中藥的溶劑是中性、酸性或堿性；選用無機(jī)酸、無機(jī)堿、有機(jī)酸或有機(jī)堿中和酸性或堿性的中藥提取液。按中藥提取液的體積加入0.1-3％體積的增溶劑，增溶劑選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通或它們的混合物。
本發(fā)明的檢測(cè)方法中中藥提取液是用水和/或乙醇提取制備的中藥提取液；緩沖液是pH7.0-7.4的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液。
前述檢測(cè)方法特征在于活性細(xì)胞為來自人體或動(dòng)物組織細(xì)胞的細(xì)胞，活性細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)所需要的細(xì)胞量為106以上；將中藥提取液與活性細(xì)胞在模擬生理?xiàng)l件下的緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)用的模擬生理?xiàng)l件的緩沖液是pH7.0-7.4的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液或含1-20％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)后，取上清液，同時(shí)將不含細(xì)胞的中藥提取液作為空白對(duì)照，分別用高效色譜法檢測(cè)上清液和作為空白對(duì)照的中藥提取液，比較兩者指紋圖譜，峰面積改變的峰，即是與活性細(xì)胞有相互作用的成分。
較好的檢測(cè)方法中，細(xì)胞培養(yǎng)所需要的細(xì)胞量為106～109；細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為1-12小時(shí)，待中藥中的有效成分與細(xì)胞結(jié)合達(dá)飽和后離心取上清液，用高效液相色譜分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液與空白對(duì)照的上清液。而且，用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液培養(yǎng)后的上清液，可與液相-質(zhì)譜和/或核磁共振聯(lián)用，獲得與細(xì)胞有相互作用的成分的結(jié)構(gòu)信息。所述檢測(cè)方法，用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液培養(yǎng)后的上清液，與液相-質(zhì)譜和/或核磁共振聯(lián)用，獲得與細(xì)胞有相互作用成分的指紋圖譜。
本發(fā)明提供了一種快捷，準(zhǔn)確，體現(xiàn)中藥多成分協(xié)同作用的檢測(cè)中藥中與活性細(xì)胞有相互作用的化學(xué)成分的方法，所述檢測(cè)包括篩選與測(cè)定，避免了因細(xì)胞的生物學(xué)特征受到影響而影響到有效成分的篩選的準(zhǔn)確性，可與LC-MS聯(lián)用，提高有效成分的分離效果，并且在篩選有效成分的同時(shí)獲得其結(jié)構(gòu)信息，可以快速的從中藥中尋找可能具有活性的先導(dǎo)化合物或化合物群。同時(shí)本發(fā)明方法相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，從中藥中篩選有效成分的效率顯著提高，并且可以作為中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充手段。中藥指紋圖譜是現(xiàn)在用于中藥質(zhì)量控制的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，但現(xiàn)行指紋圖譜存在的一個(gè)突出問題就是不能提供該中藥的藥理信息。例如，圖1中表示的當(dāng)歸補(bǔ)血湯的紅色線圖譜(位置在上方)即是當(dāng)歸補(bǔ)血湯的指紋圖譜，它僅僅能提供中藥材所含成分的化學(xué)信息。應(yīng)用本發(fā)明方法將當(dāng)歸補(bǔ)血湯與內(nèi)皮細(xì)胞作用后再做指紋圖譜，如圖2中當(dāng)歸補(bǔ)血湯的藍(lán)色線圖(位置在下方)，可以看出共有5個(gè)峰的峰面積發(fā)生了明顯的變化。藥物與活性細(xì)胞的相互作用是藥物產(chǎn)生藥理活性的前提，在用指紋圖譜進(jìn)行中藥質(zhì)量控制時(shí)，這些有變化的峰應(yīng)該是重點(diǎn)控制的對(duì)象，因?yàn)樗麄儾趴赡苁窃撍幍幕钚晕镔|(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明方法將生物學(xué)技術(shù)與液相色譜聯(lián)用，結(jié)果比生物色譜方法更加簡(jiǎn)便，結(jié)論更可靠。
細(xì)胞比模擬生物膜的特異性更強(qiáng)。細(xì)胞膜是從細(xì)胞上分離出來的，其生物學(xué)特征可能會(huì)受到影響，本發(fā)明直接采用活性細(xì)胞，并且將活性細(xì)胞與藥物混合后進(jìn)行培養(yǎng)，這樣與人體的作為藥物靶標(biāo)的細(xì)胞更加接近，因此其結(jié)果比細(xì)胞膜更加可信。如果利用與生物膜有結(jié)合的藥物不能透過透析膜的特點(diǎn)，將與膜有結(jié)合的成分與沒有與膜結(jié)合的成分分離開來，由于透析達(dá)到平衡時(shí)需要有一定的時(shí)間，即在12小時(shí)以上。但是細(xì)胞比細(xì)胞膜要嬌貴，將中藥直接提取液特別是含有增溶劑的提取液加入沒有血清的細(xì)胞懸液中，時(shí)間長(zhǎng)了容易導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，所以采用活性細(xì)胞與中藥中有效成分的相互作用檢測(cè)出中藥有效成分的方法中一般控制時(shí)間在1-12小時(shí)，但有時(shí)也不是不能超過12小時(shí)。理論上來說，藥物與細(xì)胞結(jié)合是一個(gè)很短暫的過程，即藥物加入細(xì)胞便會(huì)馬上結(jié)合。透析時(shí)一般以4度低溫為宜主要是防止藥物成分改變，但是對(duì)于活性細(xì)胞來說，需要在生理?xiàng)l件，即37度為宜，低溫會(huì)降低細(xì)胞的活性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而對(duì)于細(xì)胞膜而言低溫是沒有太大的關(guān)系。而且，細(xì)胞在生理?xiàng)l件下時(shí)，容易堵塞透析膜的小孔，從而使得空白對(duì)照(不含細(xì)胞)失去對(duì)照的齊同可比性，不具有對(duì)照價(jià)值，所以利用活性細(xì)胞與中藥中有效成分的相互作用以檢測(cè)出中藥有效成分的方法中不宜使用透析。由于細(xì)胞的重量明顯大于細(xì)胞膜的重量，離心后很容易沉淀下來，因此采用簡(jiǎn)單的離心方法就可以將與細(xì)胞有結(jié)合的成分和與細(xì)胞沒有結(jié)合的成分分離開來。
以下是本發(fā)明中藥有效成分篩選方法的進(jìn)一步描述
活性細(xì)胞的選擇所有來自人體和動(dòng)物的細(xì)胞均可作為篩選中藥的靶標(biāo)，如如內(nèi)皮細(xì)胞；心肌細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞等，目前有大量的商品化的細(xì)胞株可以買，如內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞等。亦可以自己進(jìn)行分離培養(yǎng)。具體篩選中藥時(shí)可根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)試驗(yàn)選擇合適的細(xì)胞，如文獻(xiàn)顯示當(dāng)歸補(bǔ)血湯能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分泌，那么篩選時(shí)可以選擇內(nèi)皮細(xì)胞作為篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯的靶標(biāo)。
中藥的提取。所述的中藥包括單味中藥以及由數(shù)味中藥組成的復(fù)方。針對(duì)不同中藥所含有效成分的理化性質(zhì)，可以任選合適的溶媒進(jìn)行提取。但是，將與活性細(xì)胞的接觸提取液，必須是不會(huì)破壞活性細(xì)胞。一般以水或者低濃度的增溶劑如二甲基亞砜，吐溫為宜，也就是說，對(duì)待篩的中藥進(jìn)行提取時(shí)可以用任何溶劑。在提取液是水液，可以直接將提取液與活性細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)。如果是用其它可能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有機(jī)溶劑提取中藥，對(duì)該提取液要進(jìn)行一定的處理，即在去除有機(jī)溶劑后加入少量的不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的增溶劑，如1％的二甲基亞砜等。原則上，加入增溶劑的含量，以不破壞活性細(xì)胞為適度，在實(shí)際操作中，這種適度通過簡(jiǎn)單測(cè)試是容易掌握的。例如取少量待測(cè)提取液與細(xì)胞接觸，觀察細(xì)胞的變化，如有破碎現(xiàn)象則表明該提取液需要進(jìn)一步降低增溶劑的濃度。提取液中提取物的濃度只要達(dá)到可以檢測(cè)的限度就行，濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)效果并無顯著影響。
活性細(xì)胞與中藥提取物的結(jié)合。將中藥提取液與細(xì)胞混合后，按常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)一定的時(shí)間，一般可以為1-12小時(shí)，同時(shí)，用沒有加細(xì)胞的中藥提取液作一平行的空白對(duì)照。待中藥中的有效成分與細(xì)胞結(jié)合達(dá)飽和后離心取上清，用高效液相色譜分析細(xì)胞培養(yǎng)的上清液與空白提取液的上清液。本方法所需的細(xì)胞量比常規(guī)的藥理篩選的量要大，一般106以上，以107～109較好，以保證能夠用色譜方法檢測(cè)出中藥中與細(xì)胞有結(jié)合的有效成分。每一個(gè)細(xì)胞上能夠結(jié)合的藥物分子是非常有限的，如果細(xì)胞量少了，那么總的細(xì)胞加起來結(jié)合的藥物分子也很少，這樣與空白對(duì)照的時(shí)候，即使被結(jié)合的成分也可能會(huì)看不出其峰面積的變化，多加一些細(xì)胞，就是盡可能的保證所有被細(xì)胞結(jié)合的成分，都可以通過峰面積對(duì)照找出來。
色譜檢測(cè)。用高效色譜法分別檢測(cè)中藥提取液與細(xì)胞結(jié)合后離心的上清液和作為空白對(duì)照的提取液離心的上清液，比較、分析兩者圖譜的改變。其中峰面積顯著減少的峰即是與活性細(xì)胞具有相互作用的化學(xué)成分，本發(fā)明基于的原理是藥物與細(xì)胞膜上靶點(diǎn)結(jié)合具有一定的穩(wěn)定性，離心時(shí)隨著細(xì)胞一起沉淀下來，從而其在上清液中的濃度降低，或者是中藥中的活性成分透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞里，離心時(shí)同樣隨著細(xì)胞一起沉淀下來，從而其在上清液中的濃度降低，這種濃度的改變可以用現(xiàn)有的色譜技術(shù)檢測(cè)出來，即表現(xiàn)為峰面積的減少。如果測(cè)試樣品是整個(gè)中藥或復(fù)方的提取物，那么所得到的就是整個(gè)中藥中的成分與活性細(xì)胞的相互作用情況，如果樣品是單一化合物或一類或幾類化合物，那么得到的就是單一化合物或一類或幾類化合物與活性細(xì)胞的相互作用情況。至于單一化合物、一類化合物、幾類化合物、單味中藥提取物，復(fù)方中藥提取物他們之間與活性細(xì)胞相互作用有何差異，也可以進(jìn)一步考察，如阿魏酸單體，當(dāng)歸提取液中的阿魏酸，當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液中的阿魏酸分別與活性細(xì)胞作用有何差別，及中藥中的其它成分對(duì)之是否有協(xié)同或抑制作用，我們可以通過比較他們與生物膜作用后峰面積的改變是否一致來看出中藥中其它成分是否對(duì)它與活性細(xì)胞的相互作用有影響。由于中藥中含有許多成分，由于高效液相具有很高的分離效能，中藥提取液通過高效液相會(huì)出現(xiàn)許多峰，一般而言，在一種洗脫條件下，一個(gè)峰就代表一個(gè)成分或者結(jié)構(gòu)相似的幾個(gè)成分。同時(shí)，如果在某種洗脫條件下不能分開的成分，可以換一種洗脫條件將之分開。通過本發(fā)明的篩選方法，就能快速、簡(jiǎn)便地發(fā)現(xiàn)在全部的峰中，有的峰與活性細(xì)胞有相互作用，有的沒有相互作用，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是要從中藥中尋找與活性細(xì)胞有相互作用的峰，因?yàn)榕c細(xì)胞發(fā)生相互作用是藥物發(fā)揮作用的前提，對(duì)于與細(xì)胞沒有相互作用的峰，就極有可能是無效成分；在找到與活性細(xì)胞具有相互作用的中藥成分的同時(shí)，制定中藥活性指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供重要的參考信息


圖1、是當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后培養(yǎng)12小時(shí)與空白對(duì)照比較圖譜，可見有5個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，這些峰面積有改變的峰是與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的成分。其中5號(hào)峰經(jīng)用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。
圖2是黃芪提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后與空白對(duì)照比較圖譜，可見有4個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
圖3是當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后上清液與空白對(duì)照比較圖譜?？梢娪?個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，其中2號(hào)峰經(jīng)用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯圖4 A表示當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后上清液的色譜圖，B表示空白對(duì)照的色譜圖，C表示第5次用2ml磷酸緩沖液洗脫的圖譜，可見沒有任何峰，D表示用2ml 75％乙醇破碎細(xì)胞的圖譜，可見在細(xì)胞破碎液里面有兩個(gè)峰，正是當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后上清液中峰面積減少的峰。
圖5表示黃芪提取液與巨噬細(xì)胞結(jié)合后與空白對(duì)照比較圖譜，可見有2個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯中與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的有效成分當(dāng)歸補(bǔ)血湯由當(dāng)歸和黃芪兩味藥組成，其臨床比例為1∶5。臨床上主要用于治療各種貧血癥。該方成分極為復(fù)雜，含有多糖，皂苷，黃酮，生物堿，揮發(fā)油等多種成分，將其一一制備出來進(jìn)行活性篩選無疑是一個(gè)耗時(shí)，費(fèi)力，效率又低的過程。采用本發(fā)明篩選方法可以快速的從中尋找其與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的可能的活性成分。
當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取取粉碎當(dāng)歸(市售)5g，黃芪(市售)25g，加入10倍量的70％甲醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在50度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入30ml含0.5％二甲基亞砜的pH為7.0的磷酸緩沖液充分溶解，5000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)術(shù)后12小時(shí)以內(nèi)的臍帶，立即浸泡在4度無菌臍帶采集液中。按Jaffe法加以改良后進(jìn)行培養(yǎng)。用0.1％的膠原酶消化分離內(nèi)皮細(xì)胞，以2×104/ml細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，用含20％小牛血清的M199培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。傳代至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，轉(zhuǎn)入7個(gè)500ml的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，合并7瓶細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞為6.0×107吸去上層的培養(yǎng)液，以9ml含0.5％二甲基亞砜的pH7.0磷酸緩沖液制成細(xì)胞懸液。
內(nèi)皮細(xì)胞與當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液結(jié)合取當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液用0.22μm的膜過濾除菌，然后取1ml加入上法制備的9ml內(nèi)皮細(xì)胞懸液當(dāng)中；同時(shí)另取當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液1ml，加入9ml含0.5％二甲基亞砜的pH7.0磷酸緩沖液當(dāng)中作為空白對(duì)照，置37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)正常，離心取上清，進(jìn)行色譜檢測(cè)。
檢測(cè)條件C18色譜柱，Angilent系列高效液相色譜系統(tǒng)，DAD紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相甲醇水梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，標(biāo)記有阿拉伯?dāng)?shù)字的峰表示峰面積有改變的峰，即與內(nèi)皮細(xì)胞有結(jié)合的成分。
結(jié)果圖一是當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后培養(yǎng)12小時(shí)與空白對(duì)照比較圖譜，可見有5個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，這些峰面積有改變的峰是與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的成分。其中5號(hào)峰經(jīng)用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油中的主要成分，約占當(dāng)歸揮發(fā)油的45％，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)子宮具有雙向調(diào)節(jié)作用。
實(shí)施例2篩選黃芪中與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的有效成分黃芪的提取取粉碎的黃芪20g，加入8倍量90％的乙醇浸泡1h，水浴回流提取1h，提取液在45度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入20ml pH為7.4的醋酸緩沖液充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)同實(shí)施例一，取7瓶?jī)?nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞為5.0×107吸去上層的培養(yǎng)液，以9ml pH為7.4的含20％小牛血清的M199培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。
內(nèi)皮細(xì)胞與黃芪提取液結(jié)合取黃芪提取液用0.22μm的膜過濾除菌，然后取1ml加入上法制備的9ml內(nèi)皮細(xì)胞懸液當(dāng)中，同時(shí)另取黃芪提取液1ml，加入9ml pH7.4含20％小牛血清的M199培養(yǎng)液當(dāng)中作為空白對(duì)照，置37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)正常，離心取上清，進(jìn)行色譜檢測(cè)。
檢測(cè)條件同實(shí)施例1結(jié)果圖2是黃芪提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后培養(yǎng)1小時(shí)與空白對(duì)照比較圖譜，可見有4個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，這些峰面積有改變的峰是與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的成分。采用LC-MS技術(shù)，測(cè)得1，2，3號(hào)峰的分子量分別為466、284、268實(shí)施例3篩選當(dāng)歸中與內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用的有效成分當(dāng)歸的提取取粉碎的當(dāng)歸10g，加入15倍量水浸泡1h，100度油浴回流提取1h，提取液在50度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入5ml pH為7.4的磷酸緩沖液充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)同實(shí)施例1內(nèi)皮細(xì)胞與當(dāng)歸提取液的結(jié)合取當(dāng)歸提取液1ml加入上法制備的9ml內(nèi)皮細(xì)胞懸液當(dāng)中，同時(shí)另取當(dāng)歸提取液1ml，加入9ml pH7.4磷酸緩沖液當(dāng)中作為空白對(duì)照，置37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)正常，離心取上清，進(jìn)行色譜檢測(cè)。為了驗(yàn)證該方法的可靠性，用胰酶將當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞消化下來，用10ml磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，離心細(xì)胞4次，以洗掉細(xì)胞上可能吸附的中藥成分，第5次用2ml磷酸緩沖液洗脫，離心取上清，過濾供色譜檢測(cè)，將第5次離心后的細(xì)胞沉淀用2ml 75％的乙醇破碎細(xì)胞，離心取上清，過濾供色譜檢測(cè)。
檢測(cè)條件同實(shí)施例1結(jié)果圖3是當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后上清液與空白對(duì)照比較圖譜?？梢娪?個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，其中2號(hào)峰經(jīng)用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯；圖4 A表示當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后上清液的色譜圖，B表示空白對(duì)照的色譜圖，C表示第5次用2ml磷酸緩沖液洗脫的圖譜，可見沒有任何峰，D表示用2ml 75％乙醇破碎細(xì)胞的圖譜，可見在細(xì)胞破碎液里面有兩個(gè)峰，正是當(dāng)歸提取液與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后上清液中峰面積減少的峰。
實(shí)施例4篩選黃芪中與巨噬細(xì)胞有相互作用的有效成分黃芪的提取取粉碎25g，加入6倍量的50％乙醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在45度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入25ml pH為7.0的磷酸緩沖液充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)取白兔1只，麻醉后固定，分次腹腔注射PRMI 1640(含10％小牛血清，青霉素100u.L-1，鏈霉素)100ml，輕揉后抽取腹腔液，離心，記數(shù)巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2h后去上清，以D-Hanks液洗去未貼壁細(xì)胞，重新加入培養(yǎng)液培養(yǎng)8h，計(jì)數(shù)細(xì)胞為7.5×106，吸去上層的培養(yǎng)液，以9mlpH7.0磷酸緩沖液制成細(xì)胞懸液。
黃芪提取液與巨噬細(xì)胞結(jié)合取黃芪提取液用0.22μm的膜過濾除菌，然后取1ml加入上法制備的9ml巨噬細(xì)胞懸液當(dāng)中，同時(shí)另取黃芪提取液1ml，加入9ml pH7.0磷酸緩沖液當(dāng)中作為空白對(duì)照，置37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)正常，離心取上清，進(jìn)行色譜檢測(cè)。
檢測(cè)條件C18色譜柱，Angilent系列高效液相色譜系統(tǒng)，DAD紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相甲醇水梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，標(biāo)記有阿拉伯?dāng)?shù)字的峰表示峰面積有改變的峰，即與內(nèi)皮細(xì)胞有結(jié)合的成分。
結(jié)果圖5表示黃芪提取液與巨噬細(xì)胞結(jié)合后與空白對(duì)照比較圖譜，可見有2個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
權(quán)利要求
1.一種中藥有效成分檢測(cè)方法，包括如下步驟取待測(cè)中藥，用溶劑提取，得中藥提取液備用；將中藥提取液與活性細(xì)胞混合，培養(yǎng)后，取上清液；用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液的上清液。
2.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)中藥是單味中藥或中藥復(fù)方；提取中藥的溶劑可以是水和/或有機(jī)溶劑；對(duì)含有機(jī)溶劑提取液，濃縮去除全部有機(jī)溶劑后，用緩沖液或低于3％的增溶劑溶解，制成中藥提取液備用。
3.權(quán)利要求2的檢測(cè)方法，其特征在于提取中藥的溶劑選自水、C1-C5的低級(jí)醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它們的混合物；按中藥提取液的體積加入0.1-3％體積的增溶劑。
4.權(quán)利要求3的檢測(cè)方法，其特征在于C1-C5的低級(jí)醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中藥的溶劑是中性、酸性或堿性；選用無機(jī)酸、無機(jī)堿、有機(jī)酸或有機(jī)堿中和酸性或堿性的中藥提取液；增溶劑選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通或它們的混合物。
5.權(quán)利要求4的檢測(cè)方法，其特征在于中藥提取液是用水和/或乙醇提取制備的中藥提取液；緩沖液是pH7.0-7.4的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液。
6.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于活性細(xì)胞為來自人體或動(dòng)物組織細(xì)胞的細(xì)胞；將中藥提取液與活性細(xì)胞在模擬生理?xiàng)l件下的緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，取上清液，同時(shí)將不含細(xì)胞的中藥提取液作為空白對(duì)照，分別用高效色譜法檢測(cè)上清液和作為空白對(duì)照的中藥提取液，比較兩者指紋圖譜，峰面積改變的峰，即是與活性細(xì)胞有相互作用的成分。
7.權(quán)利要求6的檢測(cè)方法，其特征在于活性細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)所需要的細(xì)胞量為106以上，培養(yǎng)用的模擬生理?xiàng)l件的緩沖液是pH7.0-7.4的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液或含1-20％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。
8.權(quán)利要求7的檢測(cè)方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)所需要的細(xì)胞量為106～109；細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為1-12小時(shí)，待中藥中的有效成分與細(xì)胞結(jié)合達(dá)飽和后離心取上清液，用高效液相色譜分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液與空白對(duì)照的上清液。
9.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液培養(yǎng)后的上清液，與液相-質(zhì)譜和/或核磁共振聯(lián)用，獲得與細(xì)胞有相互作用的成分的結(jié)構(gòu)信息。
10.權(quán)利要求9的檢測(cè)方法，用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液培養(yǎng)后的上清液，與液相-質(zhì)譜和/或核磁共振聯(lián)用，獲得與細(xì)胞有相互作用成分的指紋圖譜。
全文摘要
一種利用活性細(xì)胞與中藥中有效成分的相互作用測(cè)出中藥有效成分的方法，包括將中藥提取液與細(xì)胞混合進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，用高效色譜法分別檢測(cè)中藥提取液與細(xì)胞結(jié)合后與空白中藥對(duì)照液，比較兩者指紋圖譜的改變，峰面積改變的峰，即是與活性細(xì)胞有相互作用的成分，運(yùn)用LC－MS，NMR等技術(shù)，獲得與細(xì)胞有相互作用成分的結(jié)構(gòu)信息，該方法快捷，準(zhǔn)確，相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，從中藥中篩選有效成分的效率顯著提高，并且可以作為中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充手段。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1595142SQ20041004111
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者李萍, 盛亮洪, 李睿巖, 李松林, 王偉 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)