用于阿爾茲海默癥的早期診斷的生物標(biāo)志物及方法
【專利摘要】本發(fā)明在第一個(gè)方面涉及用于在受試者中診斷阿爾茲海默癥或用于確定發(fā)生阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)以及用于確定嚴(yán)重AD的存在的方法，其中測(cè)定至少四種特定的生物標(biāo)志物。此外，提供了包含用于至少四種特定的生物標(biāo)志物的檢測(cè)工具、特別是抗體的試劑盒以及陣列。此外，提供了用于診斷阿爾茲海默癥或確定發(fā)生阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品和計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法。
【專利說明】用于阿爾茲海默癥的早期診斷的生物標(biāo)志物及方法
[0001] 本發(fā)明在第一個(gè)方面涉及在受試者中用于診斷阿爾茲海默癥或用于確定發(fā)生阿 爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)或用于確定存在嚴(yán)重的阿爾茲海默癥的方法，其中對(duì)至少四種特定的生 物標(biāo)志物的組合進(jìn)行測(cè)定。此外，提供了包含用于至少四種特定的生物標(biāo)志物的檢測(cè)工具、 特別是抗體的試劑盒以及陣列。此外，提供了用于診斷阿爾茲海默癥或用于確定發(fā)生阿爾 茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)或用于確定嚴(yán)重阿爾茲海默癥的存在的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品及計(jì)算機(jī)實(shí)施的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茲海默癥(AD)是對(duì)人類生活有巨大代價(jià)的進(jìn)行性大腦疾病。特別是由于日益 增加的處于風(fēng)險(xiǎn)中的大量老年公民，該疾病的影響對(duì)于發(fā)展中國(guó)家的政府也是越來越多的 擔(dān)憂。阿爾茲海默癥是癡呆的最常見形式，是記憶喪失和其它認(rèn)知障礙的常用術(shù)語。通常， 癡呆包括以下形式:血管性癡呆和包括阿爾茲海默癥或阿爾茨海默癡呆的退行性癡呆。不 同類型的癡呆被描述為淀粉體病變(阿爾茨海默癡呆）、tau蛋白病變(路易體疾病，克雅二 氏病，皮克氏病)和共核蛋白病(帕金森?。?。
[0003] 癡呆的最大風(fēng)險(xiǎn)因素是年齡。超過85歲的人們更可能經(jīng)歷該狀況，但是一些癡呆 形式在50歲以下的人們中發(fā)生。一些個(gè)體在基因上更容易發(fā)生特定的癡呆形式，如阿爾茲 海默癥和亨廷頓癥。此外，若干因素如大腦損傷(包括由中風(fēng)引起的損傷）、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、感染、 藥物反應(yīng)、中毒、大腦腫瘤或病灶可引起暫時(shí)性或永久性癡呆。
[0004] 阿爾茲海默癥是慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其是最普遍的癡呆類型。包括神經(jīng) 成像方法的當(dāng)前的診斷工具在不斷地改進(jìn)。然而，提高阿爾茲海默癥的診斷的靈敏性和特 異性仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。兩種診斷領(lǐng)域尤其是有挑戰(zhàn)性的：第一，將阿爾茲海默癥的早期階段與 輕度認(rèn)知障礙和正常老化區(qū)別開來;第二，尤其在相似的臨床癥狀被各種癡呆類型所共有 時(shí)提高診斷的特異性。迄今為止，來自腦脊液(CSF)的β-淀粉體（1-42)、總的tau和磷酸化 tau-181的分析是以高的可靠性和有效性診斷阿爾茲海默癥和將其與其它癡呆形式區(qū)別開 來的最佳生物標(biāo)志物。Marksteiner J·等(今日藥物(Drugs Today)43(6) :423-31,2007)綜 述了CSF生物標(biāo)志物和推定的血液相關(guān)標(biāo)志物的使用。據(jù)建議，輕度認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)受tau 蛋白基因變異的影響，并且輕度認(rèn)知障礙與阿爾茲海默癥共有共同的基因背景。這可以幫 助闡明認(rèn)知減退的基因風(fēng)險(xiǎn)和設(shè)計(jì)有效的臨床試驗(yàn)。We lge V.等（神經(jīng)傳遞雜志 (J · Neural · Transm ·)，116(2): 203-12，2009)報(bào)道了對(duì)于腦脊液（CSF)濃度，比率Αβ?-42/Αβ l-38/p-tau有力地將阿爾茲海默癥(AD)與非阿爾茲海默癡呆患者區(qū)別開來，并且滿足了合 適的篩選和差別的診斷AD生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性要求。
[0005] 阿茲海默癥協(xié)會(huì)提供了病程期間的七個(gè)階段，SM:沒有損傷，2非常輕度的減退 (早期階段），3輕度減退，4中度減退，5中度的嚴(yán)重減退，6嚴(yán)重減退，和7非常嚴(yán)重的減退。
[0006] 神經(jīng)退行性病癥的早期檢測(cè)將能夠使得更有效地治療患者。近期的研究已經(jīng)證 明，如阿爾茲海默癥的病癥以可能持續(xù)數(shù)年的預(yù)癥狀期為特征，在該預(yù)癥狀期期間但在臨 床癥狀出現(xiàn)之前發(fā)生神經(jīng)退化。這提出了兩個(gè)挑戰(zhàn)-如何在該預(yù)臨床期期間識(shí)別個(gè)體-以及 機(jī)遇?？稍诩膊“Y狀出現(xiàn)之前的預(yù)臨床階段期間開始預(yù)防療法。因此，臨床研究的主要目標(biāo) 是通過開發(fā)將診斷向后移到神經(jīng)退化臨時(shí)過程的工具而改進(jìn)這些疾病的早期檢測(cè)。此外， 處于發(fā)生阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的早期識(shí)別是高度期望的。本領(lǐng)域描述了，AD預(yù)防 和治療在具有所述神經(jīng)退行性病癥的早期檢測(cè)的患者中更有效，以及更有效地延遲AD的所 述最終進(jìn)程。
[0007] 在阿爾茲海默癥的病理學(xué)中涉及聚集的淀粉體-β(Αβ)肽。在體外和在體內(nèi)，這些 聚集體被發(fā)現(xiàn)呈多種形態(tài)學(xué)，包括球狀低聚物和線性原纖維，其具有不同的生物活性。偶發(fā) 阿爾茲海默癥(AD)的診斷和監(jiān)測(cè)已長(zhǎng)時(shí)間取決于具有晚期疾病的個(gè)體的臨床檢查。然而， 即將來臨的抗-AD療法在個(gè)體顯示非常輕度的神經(jīng)退化體征時(shí)最佳地啟動(dòng)。越來越達(dá)成共 識(shí)將腦脊液淀粉體-β(Αβ)作為AD的輕度認(rèn)知障礙階段的核心標(biāo)志物。在AD的發(fā)病機(jī)理中直 接涉及Αβ或Αβ與其它的主要致病因素緊密相關(guān)。其通過取決于β位點(diǎn)APP-裂解酶1和γ -分 泌酶復(fù)合體的蛋白酶解加工由淀粉體前體蛋白（APP)產(chǎn)生，并且被廣泛的蛋白酶所降解。
[0008] 腦脊液(CSF)中的淀粉體-邱勺40和42個(gè)氨基酸殘基形式(Αβ(1-40)和Αβ( 1-42))已 經(jīng)被提議為阿爾茲海默癥(AD)的潛在生物標(biāo)志物。CSF中的A抑太的定量分析幾乎唯一地依 賴于免疫吸附類試驗(yàn)，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)程序的使用。然而，由于Α?3肽易于自 發(fā)聚集或與其它蛋白和玻璃器皿結(jié)合的性質(zhì)，這種分析是極其有挑戰(zhàn)性的。分析進(jìn)一步被 肽經(jīng)受翻譯后修飾的可能性和在ELISA試驗(yàn)中與CSF的內(nèi)源性成分發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性 而復(fù)雜化。近期的發(fā)現(xiàn)顯示，相對(duì)于Αβ( 1-40)降低的血漿Αβ( 1-42)可能增加AD的風(fēng)險(xiǎn) (Hampel Η.等，阿爾茨海默癡呆(Alzheimers Dement. ),4(1):38-48,2008)。
[0009] 腫瘤壞死因子a(TNF-a)是屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的多功能促炎性細(xì)胞因 子。該細(xì)胞因子主要由巨噬細(xì)胞所分泌。其在包括如下的寬譜生物過程的調(diào)節(jié)中涉及:細(xì)胞 增殖、分化、凋亡，脂質(zhì)代謝和凝聚。該細(xì)胞因子已在包括自身免疫病、抗胰島素性和癌癥的 多種疾病中涉及。小鼠中的敲除研究也顯示了該細(xì)胞因子的神經(jīng)保護(hù)功能。
[0010] 因此，炎癥作為阿爾茲海默癥(AD)的主要因素的概念基于與病灶相關(guān)的自動(dòng)破壞 性變化的驗(yàn)尸后發(fā)現(xiàn)以及抗炎劑的保護(hù)效果的流行病學(xué)證據(jù)。現(xiàn)今，存在以下證據(jù):AD的風(fēng) 險(xiǎn)基本上受炎癥制劑白介素Ia、白介素1β、白介素6、腫瘤壞死因子a、a (2)_巨球蛋白和a (1)-抗胰凝乳蛋白酶中的總共10種多態(tài)性所影響。所述多態(tài)性均為常見的多態(tài)性。
[0011] WO 2005/052292和WO 2006/133423描述了用于在體液中診斷、層化和監(jiān)測(cè)AD和其 它神經(jīng)障礙的方法和組合物。例如，源于以上WO申請(qǐng)的EP 2211183B1確定了用于診斷和監(jiān) 測(cè)AD的方法，其中對(duì)作為生物標(biāo)志物的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(EGFBP-2)進(jìn)行了測(cè) 定。參考的專利申請(qǐng)?zhí)峁┝舜罅靠赡艿纳飿?biāo)志物，所述生物標(biāo)志物據(jù)稱應(yīng)適合于診斷包 括AD的神經(jīng)障礙。然而，沒有公開允許以高準(zhǔn)確性診斷和預(yù)測(cè)AD的一組特定的生物標(biāo)志物。 此外，Thambi se tty，Ν·等，生物標(biāo)志物和醫(yī)學(xué)（biomarker s and medicine),未來醫(yī)學(xué) (future medicine)，倫敦，第4卷，第1期，第65至79頁公開了基于血液的AD生物標(biāo)志物:有 挑戰(zhàn)性但可行。WO 2009/149185識(shí)別了雙重可變域免疫球蛋白及其用途。
[0012] 近期的發(fā)現(xiàn)顯示，在阿爾茲海默癥(AD)的發(fā)病機(jī)理中涉及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF) ADNF是在成人腦中的神經(jīng)功能、突觸可塑性和結(jié)構(gòu)完整性的維護(hù)中涉及的內(nèi)源性 蛋白。在27個(gè)AD患者，作比較的9個(gè)常壓腦積水(NPH)患者和28個(gè)年齡匹配的健康對(duì)照中，通 過靈敏ELISA來評(píng)估BDNF血清和腦脊液(CSF)濃度。與健康對(duì)照（21.3ng/ml; p = 0.041/p = 0.017)相比，發(fā)現(xiàn)AD(18.6ng/ml)和NPH患者（I8.1ng/ml)中的BDNF血清濃度顯著降低。m)NF 血清濃度不與AD和NPH兩種患者中的CSF水平、年齡或簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(MMSE)分?jǐn)?shù)相關(guān)。 AD和NPH中的BDNF血清水平的降低可以反映營(yíng)養(yǎng)支持的缺乏，因此促成在兩種疾病中的進(jìn) 行性退化。
[0013]慢性炎癥是阿爾茲海默癥(AD)的特征。已經(jīng)報(bào)道了在促炎性細(xì)胞因子白介素-6 (IL-6)與抗炎性細(xì)胞因子白介素-IO(IL-IO)的基因的調(diào)控區(qū)中的多態(tài)性之間與AD的風(fēng)險(xiǎn) 相關(guān)的相互作用。部分由于在所述兩種基因中的基因變異而導(dǎo)致的IL-6和IL-10兩者在一 些老年人中的失調(diào)可以促成AD的生成（Cam-barros 0.等，神經(jīng)炎癥雜志 (J.NeuroinfIammation)，23(6):22，2009)。
[0014] IL-6(也稱為干擾素β2)在阿爾茲海默癥(AD)中高度升高，并且與其它疾病如糖尿 病有著強(qiáng)的相關(guān)性。IL-6還與其它神經(jīng)退行性疾病和抑郁癥有相關(guān)性。還認(rèn)為白介素IL-10、IL-18和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在阿爾茲海默癥(AD)中起作用。Malaguera L.等（神 經(jīng)病理學(xué)(Neuropathology)，26(4) :307-12,2006)確定了，與非癡呆性年齡匹配的受試者 相比，在患有AD的患者中IL-18的水平顯著升高。
[0015] Mateo等（神經(jīng)病學(xué)學(xué)報(bào)(Acta Neurol · Scand ·)，116( 1): 56-8，2007)描述了血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)決定重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性和神經(jīng)保護(hù)性行為。低的血清VEFG水平與阿爾 茲海默癥相關(guān)。
[0016] 神經(jīng)保護(hù)的完整性是防備認(rèn)知障礙和AD的發(fā)生的重要組成部分。與健康老年受試 者（IGF-1，9 · 5±2 ·4pg/ml;VEGF，105±31pg/ml;和TGF-βΙ，68± 18pg/ml)相比，阿爾茲海默 癥患者組在基線處顯示了胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-l)(3.7±1.2pg/ml)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)(63±18pg/ml)和TGF-m(33±10pg/ml)的嚴(yán)重降低。在健康受試者（r = 0·87，p〈 0.001)以及在AD受試者中均發(fā)現(xiàn)了IGF-I與VEGF濃度之間的顯著正相關(guān)性(Luppi C.等，老 年學(xué)和老年醫(yī)學(xué)檔案(Arch.Gerontol .Geriatr. )49(附錄 1): 173-84,2009)。
[0017] 血漿同型半胱氨酸的升高與老齡化常見的問題如認(rèn)知障礙、癡呆、抑郁、骨質(zhì)疏松 性骨折和功能減退相關(guān)。已知，同型半胱氨酸水平在血管性癡呆患者中比在阿爾茲海默癥 (AD)患者或?qū)φ罩懈?。升高的血漿同型半胱氨酸濃度和低的血清葉酸濃度是發(fā)生癡呆和 AD的獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。血漿同型半胱氨酸水平的正常范圍為5-15ymol/L，對(duì)于AD患者為15μ mol/L之上。
[0018] 單核細(xì)胞趨化蛋白-I (MCP-1)在以富含單核細(xì)胞的細(xì)胞浸潤(rùn)物為特征的多種疾病 如動(dòng)脈粥樣硬化、充血性心力衰竭和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中高度誘發(fā)。
[0019] 檢測(cè)血清中的升高水平的C-反應(yīng)性蛋白（CRP)對(duì)于任何特定疾病是非特異性的。 其是炎性過程的有用的指示劑。在基于群體的背景下，在老年非癡呆人中，血漿CRP與普遍 的輕度認(rèn)知障礙(MCI)和與非遺忘型MCI相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明在MCI的發(fā)病機(jī)理中涉及炎癥。 在具有MCI的患者中，高的血漿CRP水平與加速的認(rèn)知減退和增加的癡呆風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。AD患者 比血管性癡呆患者具有更高的CRP水平(分別為4.2±0.6相比于1.7±0.2，p〈0.001)。逐步 的多元邏輯回歸分析顯示，癡呆(讓步比=〇R = 4.965,95%置信區(qū)間=CI = 1.402-13.23，p =0.004)、纖維蛋白原（OR= 1.011 ,Cl = 1.007-1.015，p〈0.001)和年齡(OR= 1.158 ,CI = 1.063-1.261，p〈0.001)獨(dú)立地與高水平的CRP相關(guān)。研究表明炎癥可在AD中具有發(fā)病的作 用(Mancinella A.等，老年學(xué)和老年醫(yī)學(xué)檔案(Arch.Gerontol .Geriatr. )49(附錄I): 185- 94,2009)。
[0020] 目前對(duì)于阿爾茲海默癥沒有治愈，但是對(duì)于其治療存在基于藥物和非藥物的方 法。一般來講，藥物治療被用于減緩癥狀的發(fā)展。幾種生物標(biāo)志物很好地證明在一大群患者 中是有效的，但是成功與在其早期識(shí)別疾病載體直接相關(guān)。這證實(shí)了對(duì)通過分子工具的及 時(shí)且準(zhǔn)確的診斷形式的需要，Ray S.等，自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med. )13(11) :1359-62,2007。
[0021] 總而言之，用于早期阿爾茲海默癥的改進(jìn)的診斷篩選具有大量的益處。早期診斷 允許在疾病早期階段中的人們促成進(jìn)行關(guān)于藥物治療的過程的決定。如果現(xiàn)有的治療方法 將會(huì)起作用，則它們?cè)诩膊〉脑缙陔A段最好地起作用。早期檢測(cè)允許早期干預(yù)。隨著藥物治 療的發(fā)展，在未來極有可能的是，早期檢測(cè)將防止隨著阿爾茲海默癥的發(fā)展而發(fā)生的對(duì)腦 的不可逆損傷。因此，對(duì)于允許在早期階段以高的特異性診斷AD的方法和測(cè)試體系有著不 斷的需要。此外，為了將AD與其它類型的癡呆區(qū)別開來，需要新的方法和測(cè)試。也就是說，鑒 定AD之后的步驟對(duì)于允許確定治療方案是有幫助的。
[0022] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0023] 本發(fā)明在第一個(gè)方面涉及用于診斷阿爾茲海默癥(AD)或用于預(yù)測(cè)發(fā)生阿爾茲海 默癥(AD)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：
[0024] a)測(cè)定來自受試者的生物樣品中的AD生物標(biāo)志物的水平或量;和
[0025] b)基于所述生物標(biāo)志物的水平或量確定或診斷AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)，
[0026]其中所述生物標(biāo)志物是至少四種選自如下的生物標(biāo)志物：腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (BDNF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-UIGF-I )，腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)，白介素18(IL-18)和單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)，并且在第一個(gè)實(shí)施方式中，其中 IL-18和/或MCP-I的增加和/或BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的降低指示AD的存在或發(fā)生 AD的風(fēng)險(xiǎn)。此外，同型半胱氨酸可用作用于驗(yàn)證診斷的另外的生物標(biāo)志物。在AD患者中，同 型半胱氨酸的水平或量降低。
[0027]此外，用于確定受試者中阿爾茲海默癥(AD)的狀態(tài)的方法包括：
[0028] a)測(cè)定來自受試者的生物樣品中的AD生物標(biāo)志物的水平或量;和 [0029] b)基于所述生物標(biāo)志物的水平或量以高的特異性確定AD的存在或狀態(tài)，
[0030]其中所述AD生物標(biāo)志物是至少四種選自如下的生物標(biāo)志物:腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (BDNF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-UIGF-I )，腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)，白介素18(IL-18)，和單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)，并且其中IL-18和/或VEGF的增 加和/或8〇即、16?-1、1〇 3-1和/或了6?-01的降低指示嚴(yán)重4〇的存在。
[0031]也就是說，在另一個(gè)實(shí)施方式中，在癡呆患者中確認(rèn)遭受從嚴(yán)重AD開始的后期AD 的特征是IL-18和/或VEGF的升高和/或BDNF、IGF-1、MCP-1和/或TGF-βΙ的降低。
[0032]所提及的生物標(biāo)志物中的至少4種的組合一方面允許以至少90 %的高特異性對(duì)發(fā) 生AD的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行早期診斷和檢測(cè)，另一方面以至少90%的高特異性確定嚴(yán)重情況的存在。 [0033] 優(yōu)選對(duì)生物標(biāo)志物BDNF、IGF-I、TGF-m、VEGF、IL-18和MCP-I中的至少四種，如至 少五種或全部生物標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定。
[0034]包含以上鑒定的生物標(biāo)志物中的至少四種的生物標(biāo)志物分子標(biāo)簽在預(yù)測(cè)臨床AD 上實(shí)現(xiàn)平均90%，如95%，特別是96%的準(zhǔn)確性如靈敏性。至少，所述生物標(biāo)志物分子標(biāo)簽 在盡早著手合適的療法方面允許早期檢測(cè)阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)，以及允許確定嚴(yán)重AD的存 在。
[0035]此外，在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于診斷或預(yù)測(cè)發(fā)生阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)以及 用于確定嚴(yán)重AD的存在的試劑盒，所述試劑盒包含用于至少四種選自如下的生物標(biāo)志物的 檢測(cè)工具：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)，腫瘤生長(zhǎng)因子β? (TGF-βΙ)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，白介素18(IL-18)和單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)，以 及任選地，同型半胱氨酸，所述試劑盒用于診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)，任選地，所述試劑 盒含有關(guān)于如何在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)以及用于確定嚴(yán)重AD 的存在的方法中使用所述試劑盒的說明書。
[0036]此外，本發(fā)明涉及如本文中限定的生物標(biāo)志物中的至少四種、如至少五種用于AD 的診斷以及評(píng)估或療法對(duì)照中的體外應(yīng)用，其通過如下進(jìn)行:確定個(gè)體的生物樣品中的所 述生物標(biāo)志物的水平或量，和與所述生物標(biāo)志物的參比水平或量相比，確定所述生物標(biāo)志 物中的至少四種、如至少五種的升高或降低。當(dāng)水平或量分別在所述特定生物標(biāo)志物的界 限之上或之下時(shí)，生物標(biāo)志物指示AD。此外，本發(fā)明涉及包含用于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo) 志物中的至少四種的工具的陣列，特別是其中檢測(cè)工具為抗體且免疫學(xué)地進(jìn)行所述生物標(biāo) 志物的檢測(cè)的陣列或試劑盒。
[0037]此外，本發(fā)明涉及診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0038] a)獲得在受試者和任選對(duì)照的生物樣品中的根據(jù)本發(fā)明的AD生物標(biāo)志物中的至 少四種的測(cè)定的水平或量的數(shù)據(jù)；
[0039] b)通過將所述樣品中的生物標(biāo)志物的水平或量與從數(shù)據(jù)庫獲得的界限值或作為 界限對(duì)照的測(cè)定水平或測(cè)定量獲得的界限值進(jìn)行比較而對(duì)步驟a)的數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算；
[0040] c)鑒定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的生物標(biāo)志物。
[0041]最后，本發(fā)明涉及具有用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的指令的計(jì)算 機(jī)介質(zhì)或計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。
[0042] 附圖簡(jiǎn)述
[0043]在圖1中，提供了顯示各探針位置的微量滴定板的方案。對(duì)各樣品進(jìn)行測(cè)定，一式 兩份。此外，存在陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和界限對(duì)照，從而允許在板上具有內(nèi)部對(duì)照。在本情況 下，測(cè)試了 5個(gè)患者樣品。
[0044] 在圖2中，示出了在表5中示出的生物標(biāo)志物組合的特異性。如顯示的，使用六種標(biāo) 志物中的至少四種標(biāo)志物給出超過90 %的特異性。發(fā)明詳述
[0045] 如本文中使用的，術(shù)語"阿爾茲海默癥"是指將大腦皮層中的神經(jīng)細(xì)胞殺死而使大 腦的額葉和顳葉中的腦回（大腦皮層上的脊)萎縮或減小的退行性大腦疾病，特別是如由 NINCDS-ARDA標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家神經(jīng)和溝通障礙和中風(fēng)研究所（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke)，和阿爾茲海默癥及相關(guān)疾病 協(xié)會(huì))所定義的。
[0046] 如本文中使用的，術(shù)語"診斷"是指鑒定病理狀態(tài)的存在或特征。關(guān)于本發(fā)明的目 的，"診斷"是指基于體液的離體分析確定患阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0047] 如在本文中使用的，術(shù)語"生物標(biāo)志物"是指能夠指示疾病狀態(tài)的物質(zhì)。在旨在診 斷阿爾茲海默癥的本發(fā)明的上下文中，"生物標(biāo)志物"是指指示大腦細(xì)胞是否處于正常狀態(tài) 或發(fā)作阿爾茲海默癥的物質(zhì)。"生物標(biāo)志物"包括多肽和糖蛋白，與正常的健康受試者相比， 遭受阿爾茲海默癥或易于受阿爾茲海默癥折磨的患者中它們的量升高或降低。
[0048] 如本文中使用的，術(shù)語"血液"包括全血、血清和血漿。
[0049] 如在本文中使用的，術(shù)語"抗體"是指與生物分子的抗原區(qū)域特異結(jié)合的免疫球蛋 白。關(guān)于本發(fā)明的目的，抗體與生物標(biāo)志物特異地結(jié)合，并且包括多克隆抗體、單克隆抗體 和重組抗體。此外，本發(fā)明的抗體包括抗體分子的功能性片段，以及具有兩個(gè)全長(zhǎng)輕鏈和兩 個(gè)全長(zhǎng)重鏈的完整形式?？贵w分子的功能片段是指保留至少抗原結(jié)合功能的片段，并且包 括? &13、？(&13'）2^4卩類似的片段。
[0050] 如在本文中使用的，術(shù)語"抗原-抗體復(fù)合物"是指生物標(biāo)志物與識(shí)別它的抗體的 結(jié)合產(chǎn)物。
[0051] 如在本文中使用的，術(shù)語"包含"和術(shù)語"含有"包括"由…組成"的實(shí)施方式。
[0052]如在本文中使用的，術(shù)語"界限水平"是指為了在遭受AD的個(gè)體或處于發(fā)生AD的風(fēng) 險(xiǎn)中的個(gè)體之間區(qū)別開來而確定的相對(duì)或絕對(duì)水平。界限水平在相對(duì)水平的情況下以倍數(shù) 差異給出，在絕對(duì)值的情況下以特定的值給出，例如在蛋白水平的情況下表示為ng/ml或 pg/ml。如在本文中指示的，分別在界限水平之上或之下的值被視為允許診斷AD或確定發(fā)生 AD的風(fēng)險(xiǎn)，或允許確定嚴(yán)重AD的存在，并且最終視為AD患者中的療法對(duì)照。
[0053]如在本文中使用的，術(shù)語"AD生物標(biāo)志物"是指為AD診斷生物標(biāo)志物的生物標(biāo)志 物。
[0054]如在本文中使用的，術(shù)語"預(yù)測(cè)"是指做出個(gè)體具有發(fā)生生物疾病的顯著提高的可 能性的發(fā)現(xiàn)。
[0055] 如在本文中使用的，術(shù)語"生物樣品"涵蓋了多種從個(gè)體得到的樣品類型，并且可 用于診斷或監(jiān)測(cè)測(cè)試。生物流體樣品涵蓋了血液、腦脊液(CSF)、尿和其它生物來源的液體 樣品。如果需要，樣品可預(yù)先進(jìn)行處理，例如濃縮或分離。
[0056] "個(gè)體"是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人類，術(shù)語個(gè)體或受試者在本文中交互使用。
[0057]如在本文中使用的，"參比值"可以是絕對(duì)值、相對(duì)值、具有上限或下限的值、值的 范圍、平均值、中值、均值、或與特定的對(duì)照或基線值相比較的值。參比值可基于單個(gè)的樣品 值，例如由來自待測(cè)個(gè)體的在較早的時(shí)間點(diǎn)獲得的樣品獲得的值，或者由來自除被測(cè)個(gè)體 外的AD患者或作為未診斷有AD的個(gè)體的正常個(gè)體的樣品獲得的值。參比值可基于例如來自 AD患者或正常個(gè)體的大量樣品，或基于包括待測(cè)樣品的樣品池。
[0058]如在本文中使用的，除非另有指出，否則"一個(gè)(a)"、"一種(an)"和"所述(the)"可 指單數(shù)或復(fù)數(shù)。
[0059]如在本文中使用的，詞組倍數(shù)差異是指AD生物標(biāo)志物的測(cè)定值和參比值之間的幅 度差異的數(shù)值表示。通過用測(cè)定數(shù)值除以參比數(shù)值來數(shù)學(xué)計(jì)算倍數(shù)差異。例如，如果AD生物 標(biāo)志物的測(cè)定值為20納克/毫升(ng/ml)且參比值為10ng/ml，則倍數(shù)差異為二。或者，如果 AD生物標(biāo)志物的測(cè)定值為10ng/ml且參比值為20ng/ml，則倍數(shù)差異為50%。
[0060]本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，當(dāng)對(duì)至少四種選自腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng) 因子-I(IGF-I)、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素 18(IL-18)、 和單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)和任選地同型半胱氨酸中的生物標(biāo)志物的組合的水平或量 進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在第一個(gè)實(shí)施方式中，其中對(duì)來自受試者的生物樣品中的IL-18、MCP-1和/或 同型半胱氨酸的增加和/或BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的降低進(jìn)行確定，可以以比僅使 用1、2或3種標(biāo)志物的組合更高的特異性診斷早期AD或確定發(fā)生阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)。特別 地，已證實(shí)阿爾茲海默癥或發(fā)生阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)與本文中指定的六種標(biāo)志物的表達(dá)水 平的變化，即IL-18、MCP-1和/或同型半胱氨酸的增加以及BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的 降低相關(guān)。此外，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)將腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-1)、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和單核細(xì)胞趨 化蛋白-I (MCP-1)中的至少四種，優(yōu)選至少五種，如全部六種生物標(biāo)志物組合時(shí)，特異性和 靈敏性高到足以診斷和預(yù)后AD，而所述生物標(biāo)志物中的每個(gè)單獨(dú)可能在除AD外的不同疾病 或狀況中變化。此外，同型半胱氨酸的量或水平可用于確認(rèn)結(jié)果。
[0061] 在又一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的方法允許將AD與確定的癡呆的其它形式區(qū)別開來， 并允許確定AD的后期階段，即嚴(yán)重階段和非常嚴(yán)重的階段。也就是說，確定的AD的特征在于 BDNF、IGF-l、MCP-l和/或TGF-m的降低和/或VEGF和/或IL-18的增加。表2顯示了正常健康 對(duì)照組和嚴(yán)重阿爾茲海默癥患者組的血清樣品中的所述蛋白的測(cè)定量。在這一點(diǎn)上，要注 意的是術(shù)語"嚴(yán)重的"和"確定的"在本文中交互使用。
[0062] 表 2
LOOM」特別地，當(dāng)如本文中I很定的六柙生物標(biāo)志物中的全少四柙生物標(biāo)志物分別增加或 降低時(shí)，診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)以及確定嚴(yán)重AD的存在的準(zhǔn)確性非常高，并且可以監(jiān) 測(cè)治療。特別地，準(zhǔn)確性為至少90%，例如至少95%，且在一些情況下為至少96%。例如，該 方法的靈敏性在至少90%，如至少95%，例如至少96%的范圍內(nèi)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法 的特異性為至少85%，如至少90%，例如至少92%或至少95%。因此，根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo) 志物的特定組合允許以高的準(zhǔn)確性，特別地以相比于現(xiàn)有技術(shù)的高的準(zhǔn)確性診斷或確定 AD0
[0065]如果需要，根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志物可與本領(lǐng)域已知并且描述為合適的AD生物標(biāo) 志物的其它生物標(biāo)志物相組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚可與本文中限定的生物標(biāo)志物相組 合的合適的生物標(biāo)志物。
[0066]現(xiàn)有技術(shù)描述了相比于對(duì)照組在遭受AD的受試者中水平或量變化的一些生物標(biāo) 志物。然而，特別是鑒于單種生物標(biāo)記物其表達(dá)水平或量可能也在其它疾病中變化的事實(shí)， 它們的特異性和靈敏性即準(zhǔn)確性不足以或不滿足于在受試者中診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng) 險(xiǎn)。
[0067]相比之下，根據(jù)本發(fā)明的該組生物標(biāo)志物，即作為根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志物中的 至少四種的生物標(biāo)志物允許以高的準(zhǔn)確性和特異性早期診斷AD以及確定嚴(yán)重AD的存在。
[0068] 此外，注意術(shù)語測(cè)定、確定或診斷包括物理地測(cè)定、物理地確定或物理地診斷AD生 物標(biāo)志物的水平或量的步驟。也就是說，該方法包括以下步驟:利用對(duì)于測(cè)定水平或量有用 的已知方法測(cè)定AD生物標(biāo)志物的水平或量，和使用所述測(cè)定的水平或量相應(yīng)地確定或診 斷。
[0069] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物標(biāo)志物以其肽或蛋白的形式加以確定。然而，也可以 在核酸水平，例如基于生物樣品中的mRNA水平或量測(cè)定AD生物標(biāo)志物的水平或量。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明，本文中公開的方法分別涉及體外和/或體內(nèi)方法。優(yōu)選地，所述方法 是基于獲自個(gè)體的和體外提供的樣品的體外方法。
[0071] 本發(fā)明人旨在證明，測(cè)定和確定特定的AD生物標(biāo)志物，即腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-UIGF-I )、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、白介素18(IL-18)和單核細(xì)胞趨化蛋白-I (MCP-1)的水平或量，允許診斷或預(yù)測(cè)發(fā) 生AD的風(fēng)險(xiǎn)，以及允許將AD與其它類型的癡呆區(qū)別開來和確定AD的后期階段。
[0072] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，對(duì)下面指示的生物標(biāo)志物的組合進(jìn)行測(cè)定：
[0073] a)BDNF、IGF-l、VEGF和TGF-βl;
[0074] b)BDNF、IGF-I、VEGF、IL-18和MCP-I;
[0075] c)BDNF、VEGF、TGF-βΙ、IL-18和MCP-I;
[0076] d)IGF-I、VEGF、TGF-m、IL-18、MCP-1。
[0077] 另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括以下組合：
[0078] e) BDNF、IGF-UVEGF 和 MCP-I
[0079] f) BDNF、IGF-I、TGF-m、MCP-l
[0080] g)BDNF、IGF-I、VEGF、TGF-m、MCP-1。
[0081] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括測(cè)定如本文中限定的所有生物標(biāo)志物 的水平或量。此外，也確定了同型半胱氨酸的水平或量。
[0082] 如提及的，生物標(biāo)志物標(biāo)簽，即根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志物的水平或量，允許以平均 96%的準(zhǔn)確性預(yù)測(cè)臨床阿爾茲海默癥。這可用于確認(rèn)具有明顯的癡呆體征的患者反映為 AD，此外，這可用于診斷具有不清楚的癥狀或輕度認(rèn)知障礙的患者，這種患者具有大的或甚 至更高的感染AD的風(fēng)險(xiǎn)。與診斷AD的現(xiàn)有技術(shù)相比，當(dāng)前請(qǐng)求保護(hù)的生物標(biāo)志物具有大量 的優(yōu)點(diǎn)。例如，所有的生物標(biāo)志物存在于血液中。它們可容易地和可信地利用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備在血 液或血清樣品中進(jìn)行測(cè)定，而不需要分析組織或腦脊液。
[0083]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，生物樣品選自血液、組織或體液。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，生物樣品是血液，特別是血清。
[0084]如提及的，在一個(gè)實(shí)施方式中，在特別是處在早期疾病階段的AD患者的樣品中，如 在AD患者組的血液中，生物標(biāo)志物IL-18和MCP-I以及同型半胱氨酸相比于所述生物標(biāo)志物 在用作對(duì)照受試者的非疾病人類組中的水平或量增加。對(duì)于確定的（嚴(yán)重)AD，生物標(biāo)志物 IL-18 和 VEGF 增加。
[0085] 此外，與在非疾病人類組的樣品中的量相比，BDNF、IGF-l、TGF-m和VEGF以較低的 量存在于特別是處在早期疾病階段的AD患者組的樣品中。對(duì)于確立的（嚴(yán)重)AD，生物標(biāo)志 物 BDNF、IGF-I、TGF-βΙ 和 MCP-I 增加。
[0086]也就是說，對(duì)于單個(gè)的生物標(biāo)志物，在AD組中的量或水平的變化相比于對(duì)照組或 參比組在高達(dá)至70%的范圍內(nèi)，而如本文中限定的生物標(biāo)志物的組合，即確定至少四種生 物標(biāo)志物的水平或量的變化或改變?cè)试S將診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確性增加90% 以上。
[0087] 例如，相比于對(duì)照受試者，BDNF在AD患者的血液中降低幾乎70%。細(xì)胞因子與年齡 顯不尚的顯者的相關(guān)性。
[0088]表1顯示在正常健康對(duì)照組和早期阿爾茲海默癥患者組的血清樣品中的生物標(biāo)志 物蛋白和所述蛋白的測(cè)定量。
[0089]表1
[0091 ]通過已知方法進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志物的水平或量的測(cè)定。例如，在蛋白水 平確定水平或量的情況下，進(jìn)行免疫試驗(yàn)，例如ELISA、RIA、放射免疫擴(kuò)散、蛋白印跡、奧克 特洛尼免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫組化染色、免疫沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、FACS和蛋白 質(zhì)芯片試驗(yàn)以及免疫熒光試驗(yàn)、多重免疫試驗(yàn)、線性試驗(yàn)或斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)。
[0092] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)行ELISA。用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或量的測(cè)定工具 的典型實(shí)例包括蛋白特異性抗體。特定的分子抗體在本領(lǐng)域是已知的或者可基于本領(lǐng)域描 述的方法容易地制備。測(cè)定蛋白水平意味著通過使用與蛋白特異結(jié)合的測(cè)定工具如抗體測(cè) 定蛋白的量。所述測(cè)定方法可限定為上述方法中的任一種。通常，所述方法包括形成抗原抗 體復(fù)合物和通過已知方法確定該復(fù)合物。
[0093] 通過測(cè)定生物標(biāo)志物蛋白的測(cè)定標(biāo)簽或表達(dá)標(biāo)簽的信號(hào)大小，可以確定抗原-抗 體復(fù)合物形成的量。也就是說，抗體可貼上本領(lǐng)域已知的檢測(cè)標(biāo)簽，所述檢測(cè)標(biāo)簽包括但不 限于酶、熒光標(biāo)志物、配體、發(fā)光體、微粒子和氧化還原分子?？捎米鳈z測(cè)標(biāo)簽的酶的實(shí)例包 括但不限于D-葡萄糖苷酶、脲酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、 己糖激酶、GDP酶、RNA酶、螢光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶和磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶。熒光標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于異硫氰酸熒光素、羅丹 明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和熒光胺。配體的實(shí)例包括但不限于生物素、親和素以 及生物素和親和素的衍生物。
[0094] 如上所述，為了對(duì)選自所提及的蛋白生物標(biāo)志物中的蛋白種類的水平進(jìn)行測(cè)定， 本發(fā)明提供了如下的組合物，其包含對(duì)所述生物標(biāo)志物蛋白有特異性的制劑，例如抗體，優(yōu) 選單克隆抗體、重組抗體或抗體片段的形式。
[0095] 在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟:將在所述生物樣品中測(cè)定 的AD生物標(biāo)志物的水平或量與生物標(biāo)志物的參比水平或量進(jìn)行比較。所述參比標(biāo)簽是：
[0096] a)從未患有AD的群體獲得的平均標(biāo)簽;和/或
[0097] b)來自包括AD患者的個(gè)體的組的平均或中值水平。
[0098] 特別地，確定生物標(biāo)志物的水平或量是否分別在界限水平之上或之下。
[0099] 例如，表3和4提供了在早期診斷的情況下在測(cè)定血液樣品如血清樣品中的生物標(biāo) 志物蛋白的水平或量時(shí)的界限水平(表3)。
[0100] 衷3
[0102] 例如，對(duì)于BDNF，量降低至少50%，例如從正常健康對(duì)照組中的20ng/ml降至AD患 者組中的約l〇ng/ml以下。對(duì)于IGF-I，變化為約降低超過40%，例如從70ng/ml之上降至 6〇1^/1111以下。\^?降低約18%以上，例如從3〇9口8/1111降至25(^8/1111以下。對(duì)于16?-01，降低 為至少20%，例如從370? 8/1111降至300?8/1111以下。對(duì)于抓?-1，增加為40%以上，例如從 160pg/ml增至300pg/ml以上。對(duì)于IL-18,增加至少15%，例如增至200pg/ml以上。此外，可 確定同型半胱氨酸的水平或量，用于確認(rèn)或證實(shí)使用如本文中限定的生物標(biāo)志物獲得的結(jié) 果。
[0103] 此外，表4顯示具有嚴(yán)重AD的患者情況下的界限水平。
[0104] 表4
[0107] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如下的試劑盒，所述試劑盒包含用于至少四種選自如 下的生物標(biāo)志物的檢測(cè)工具:腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)， 腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，白介素18(IL-18)和單核細(xì)胞趨化蛋 白-I (MCP-1 )，所述試劑盒用于診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)，以及用于確定嚴(yán)重AD的存在， 任選地，所述試劑盒含有關(guān)于如何以根據(jù)本發(fā)明的用于診斷AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)以及 用于確定嚴(yán)重AD的存在的方法使用所述試劑盒的說明書。
[0108] 用于檢測(cè)診斷生物標(biāo)志物的本發(fā)明試劑盒包含對(duì)以上蛋白有特異性的抗體，并且 可還包含與用于與底物的顯色反應(yīng)的標(biāo)簽例如酶偶聯(lián)的第二抗體;誘發(fā)與標(biāo)簽的顯色反應(yīng) 的顯色底物溶液;洗液;和酶反應(yīng)停止液。其可還包含合適的微孔板、標(biāo)準(zhǔn)溶液和方案。對(duì)上 文和下文描述的生物標(biāo)志物有特異性的（第一)抗體可自身代替與標(biāo)簽偶聯(lián)的第二抗體而 與標(biāo)簽偶聯(lián)。
[0109] 用于檢測(cè)診斷生物標(biāo)志物的本發(fā)明試劑盒可通過經(jīng)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)定性地或 定量地分析抗原而診斷阿爾茲海默癥，并且抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)可通過常規(guī)方法如ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))或夾心試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。例如，用于檢測(cè)如上文或下文所述的診斷生物 標(biāo)志物的試劑盒可以設(shè)置為以下方式:通過使用表面涂布有分析物和對(duì)照的96孔微量滴定 板進(jìn)行用于與重組單克隆抗體蛋白反應(yīng)的ELISA。作為抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的接受器，可以 使用聚乙烯樹脂或聚苯乙烯樹脂，硝基纖維素膜，或載玻片。
[0110]進(jìn)行顯色反應(yīng)的常規(guī)標(biāo)簽如HRP(辣根過氧化物酶），堿性磷酸酶，膠體金，熒光標(biāo) 簽，如熒光素，F(xiàn)ITC(聚L-賴氨酸-異硫氰酸熒光素)或RITCX異氰酸羅丹明-B)或染料可優(yōu)選 用作第二抗體偶聯(lián)物的標(biāo)簽或者用作第一抗體偶聯(lián)物的標(biāo)簽。
[0111] 取決于標(biāo)簽而選擇產(chǎn)生顯色反應(yīng)的底物。特別優(yōu)選的底物是要與過氧化物酶，例 如與辣根過氧化物酶使用的底物，并且例如為TMB(3，3 '，5，5 '-四甲基聯(lián)苯胺），ABTS(2，2 '-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）），或OPD(鄰苯二胺）。優(yōu)選地，在緩沖液(例如0 . IM 乙酸鈉 ，pH 5.5)中以溶解的狀態(tài)制備顯色底物。用作抗體偶聯(lián)物的標(biāo)簽的HRP(辣根過氧化 物酶)分解顯色底物如TMB，以在過氧化氫的存在下制造顯色沉淀。通過用裸眼檢查顯色沉 淀的沉淀程度，檢測(cè)蛋白生物標(biāo)志物的存在與否。在450nm下測(cè)定TMB的顏色，在420nm下測(cè) 定ABTS的顏色，和在492nm下測(cè)定(PD的顏色。硫酸溶液(H 2SO4)可優(yōu)選用作過氧化物酶停止 液。
[0112] 可選地，可以使用作為酶標(biāo)簽的堿性磷酸酶和作為顯色底物的PNPP(對(duì)硝基苯磷 酸鹽）?？稍?05nm下測(cè)定硝基苯酚的黃色。通過添加氫氧化鈉來停止該反應(yīng)。
[0113] 洗液優(yōu)選包含磷酸鹽緩沖溶液、NaCl和吐溫20,并且更優(yōu)選地是包含0.02M磷酸鹽 緩沖液、〇. 13M的NaCl和0.05 %的吐溫20的緩沖溶液。在進(jìn)行抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)以形成抗 原-抗體復(fù)合物之后，抗原-抗體復(fù)合物與第二抗體偶聯(lián)物反應(yīng)，然后通過將適量的洗液添 加至反應(yīng)器而進(jìn)行洗滌3到6次。
[0114] 也考慮確定生物標(biāo)記物的量的其它方法，特別是RIA(放射免疫檢測(cè)），聚丙烯酰胺 凝膠上的蛋白印跡，免疫印跡和免疫組化染色。如本領(lǐng)域眾所周知的，針對(duì)考慮用于生物標(biāo) 志物的定量確定的特定方法調(diào)整試劑盒。
[0115] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，利用辣根過氧化物酶和選自TMB、ABTS和OPD中的顯 色底物，通過ELI SA測(cè)定生物標(biāo)志物的量。
[0116]如上指出的，在蛋白水平確定生物標(biāo)志物的水平或量的情況下，檢測(cè)工具例如是 抗體?？蛇x地，在核酸水平檢測(cè)水平或量的情況下，檢測(cè)工具可以是核酸分子。
[0117]例如，試劑盒是ELISA或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它合適的免疫試驗(yàn)。
[0118] 此外，本發(fā)明提供包含用于檢測(cè)如本文中限定的生物標(biāo)志物中的至少四種，例如 檢測(cè)所述生物標(biāo)志物中的至少五種，特別是如本文中限定的生物標(biāo)志物中的六種的工具的 陣列。
[0119] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒或陣列對(duì)于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法是特別有用的。在所述試 劑盒或陣列的一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)工具是與如本文中限定的生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗 體，如單克隆抗體。
[0120] 例如，根據(jù)本發(fā)明的陣列可以是微量滴定板。
[0121] 所述微量滴定板可允許確定生物標(biāo)志物的水平或量，以及確定陽性對(duì)照、陰性對(duì) 照和/或界限對(duì)照的水平或量。因此，所述陣列允許確定所述生物標(biāo)志物的增加或降低，特 別是所述生物標(biāo)志物在界限水平之下或之上的增加或降低，由此允許基于所述生物標(biāo)志物 的水平或量，容易地確定或診斷AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)，以及確定嚴(yán)重AD的存在。在圖1 中，提供了顯示合適的微量滴定板的方案。如指出的，患者樣品1~5用六種分析物，即選自 根據(jù)本發(fā)明的七種生物標(biāo)志物中的分析物1~6進(jìn)行測(cè)定。此外，提供了陽性對(duì)照以及陰性 對(duì)照。此外，為了確定樣品中的生物標(biāo)志物的水平或量是否適合于允許確定或診斷AD，提供 了界限對(duì)照。因此，在同一陣列上的這一對(duì)照允許容易地確定AD生物標(biāo)志物的測(cè)定水平或 量是否適合于診斷。這對(duì)于計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法或系統(tǒng)是特別有價(jià)值的。
[0122] 也就是說，本發(fā)明在另一個(gè)方面涉及如本文中限定的生物標(biāo)志物中的至少四種， 如五種，例如六種或全部用于阿爾茲海默癥的診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或療法對(duì)照中的體外應(yīng)用，其 通過如下進(jìn)行:確定個(gè)體的生物樣品中的所述生物標(biāo)志物的水平或量，和與所述生物標(biāo)志 物的參比水平或量相比，確定所述生物標(biāo)志物中的所述至少四種、如至少五種、如六種或全 部的升高或降低，其中參比水平是從未患有AD的群體獲得的平均水平;和/或來自包括AD患 者的個(gè)體的組的中值水平，其中所述個(gè)體生物標(biāo)志物的界限水平被相應(yīng)地用于鑒定增加或 降低。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，由在根據(jù)本發(fā)明的方法中作為對(duì)照存在的合適的界限 對(duì)照反映界限水平，例如，如在根據(jù)本發(fā)明的陣列中所述的。
[0123]此外，本發(fā)明涉及診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0124] a)獲得如本文中限定的AD生物標(biāo)志物，即腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣 生長(zhǎng)因子-I(IGF-1)、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)中的至少四種在受試者和任選對(duì)照的生物樣品中的測(cè) 定水平或量的數(shù)據(jù)；
[0125] b)通過將所述樣品中的生物標(biāo)志物的水平或量與從數(shù)據(jù)庫獲得的界限值或作為 界限對(duì)照的測(cè)定水平或測(cè)定量獲得的界限值進(jìn)行比較而對(duì)步驟a)的數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算；
[0126] c)分析和鑒定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的生物標(biāo)志物。
[0127] 任選地，所述方法還包括在輸出單元將每一種生物標(biāo)志物的結(jié)果或僅僅陽性或陰 性診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的結(jié)果以例如有色和突出顯示的形式展示呈現(xiàn)的步驟。
[0128] 例如，通過主成分分析進(jìn)行分析。所述分析可伴有誤差分析。
[0129] 最后，本發(fā)明涉及如下的計(jì)算機(jī)介質(zhì)或計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其具有用于執(zhí)行根據(jù)本 發(fā)明的方法的步驟的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的指令。
[0130] 在一些實(shí)施方式中，測(cè)定值和參比值的比較包括計(jì)算測(cè)定值和參比值之間的倍數(shù) 差異，從而相應(yīng)地鑒定測(cè)定值是否在界限值之上或之下。 實(shí)施例
[0131] 實(shí)施例1:從具有退行性腦疾病的患者和從正常健康受試者收集的血液的定量蛋 白分析
[0132] 在患者同意且遵循可適用的倫理準(zhǔn)則的情況下，從患有阿爾茲海默癥的患者和從 健康人受試者的對(duì)照組收集血液樣品。
[0133] 使用血清分離管，并使得樣品在室溫下凝結(jié)2小時(shí)或在4°C下過夜，然后在約1000 Xg下離心約20分鐘。立即對(duì)新鮮制備的血清進(jìn)行測(cè)定或者將樣品以等份儲(chǔ)存在_20°(：或-80 °C下。應(yīng)避免重復(fù)的冷凍/解凍循環(huán)。
[0134] 使用對(duì)以下標(biāo)志物蛋白的收集樣品的抗原有特異性的抗體進(jìn)行ELISA(測(cè)定樣品 抗原的夾心ELISA):BDNF，IGF-I，TGF-βΙ，VEGF，MCP-1 和IL-18。
[0135] 實(shí)施例 2:80陬、見？-1、了6?-財(cái)、￥￡6?、11-18和如卩-1的￡115八
[0136] 制備各抗原在pH7.4的I3BS中的I.Oml(lμg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋物。將其在室溫下保持 1 〇分鐘，并輕輕地?fù)u動(dòng)。
[0137] 從B&D Biosciences、Bachem、Novagen、Invitrogen或GenScript或其它購買分別 預(yù)涂布有 IL-18、TGF-βl、VEGF、BDNF、MCP-l和IGF-l的抗體的孔。
[0138] 制備提及的lμg/ml標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液的I: I、1: 2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64的稀釋液 各IOOyl并且各添加至一個(gè)孔(7個(gè)孔）。第8個(gè)孔預(yù)留為空白。利用封板機(jī)將孔封閉并在持續(xù) 搖動(dòng)下（700rpm)在室溫下孵育2小時(shí)。在孵育后，將板抽干，用400μ1洗液洗滌三次，并再次 抽干。然后，將1〇〇μ1各自的抗-HRP-偶聯(lián)的抗體添加到板的各個(gè)孔中，并且在700rpm下的搖 動(dòng)下在室溫下孵育2小時(shí)。將各個(gè)孔的內(nèi)含物抽干。將板再次洗滌三次，然后添加200μ1的 OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽)底物溶液。通過將兩片i〇mg的oro片劑添加到供應(yīng)的oro稀釋劑中， 然后添加50μ1的3 %H2O2，從而制備(PD底物溶液。然后將板在黑暗中孵育20-25分鐘，同時(shí)產(chǎn) 生顏色。添加1 〇〇μ 1的停止液(3N硫酸)使顯色停止。在微孔板讀取儀中，在492nm下讀取板。
[0139] 可使用ABTS(2,2'_連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））、TMB(3,3'，5,5'_四 甲基聯(lián)苯胺)或DAB(3，3 ' -二氨基聯(lián)苯胺)代替(PD作為顯色底物。
[0140] 可選地，可以使用作為酶的堿性磷酸酶和PNPP(對(duì)硝基苯磷酸鹽）。在15分鐘之后， 在室溫下，可以在405nm下測(cè)定硝基苯酚的黃色。通過添加等體積的0.75M NaOH而停止該反 應(yīng)。
[0141]由板上的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且將其用于計(jì)算樣品中的目標(biāo)抗原的濃度。
[0142] 實(shí)施例3:來自阿爾茲海默癥患者和正常健康受試者的測(cè)試樣品
[0143] 用 IL-18、TGF-m、VEGF、BDNF、MCP-l和IGF-l各自的抗體（購自B&DBiosciences、 Genscript、Invitrogen、Genzyme、IBL international、Innogenetics或Calbiochem的特定 抗體的20μ1的1:100稀釋溶液）以lOμg/ml的濃度對(duì)96孔高結(jié)合Stripwell免疫測(cè)試板 (Corning LifeSciences，NY，或BD Bioscience)進(jìn)行預(yù)涂布，并進(jìn)行封閉。將以1: 1、1:2、1: 4、1: 8、1:16和1:64的比率用PBS稀釋的血漿樣品100μΙ添加到各個(gè)預(yù)涂布的孔中。將板在 700rpm的旋轉(zhuǎn)下，在室溫下孵育2小時(shí)。在4 °C下，將孔用I3BS中的3 %牛血清白蛋白封閉過 夜。在用PBS/Ο. 1 %吐溫20洗滌三次后，將BDNF、IGF-I、TGF-m、VEGF、IL-18和MCP-I的特異 抗體100μΙ施用到各個(gè)孔中，并且在4°C下孵育過夜。添加對(duì)第一抗體有特異性的HRP連接的 第二抗體50μ1，并且在700rpm下、在室溫下孵育2小時(shí)。用0.1 M的PBS(碳酸氫鈉緩沖液， Sigma，pH 9.6)將板洗滌三次，從而除去未結(jié)合的抗體-酶偶聯(lián)物。添加100μ1的TMB(3，3 '， 5，5 四甲基聯(lián)苯胺），在H2O2在甲醇中的3 %溶液的存在下，該TMB被酶轉(zhuǎn)化為黃色。添加100 μL的3Ν硫酸使反應(yīng)停止。在450nm下測(cè)定板孔的吸光度，從而確定抗原的存在和量。吸光度 和濃度的相關(guān)性是測(cè)試樣品的標(biāo)準(zhǔn)(參比）曲線。
[0144] 表5:顯示如本文中限定的生物標(biāo)志物的組合，其中編號(hào)如下：1=BDNF，2 = IGF-I， 3 = VEGF，4 = TGF-m，5=MCP-1，6 = IL-18
[0147] 實(shí)施例4:同型半胱氨酸的確定
[0148] 遵循Araki A.和Sako Y.，色譜雜志（J.Chromatogr. ),422:43-52,1987,通過具有 熒光檢測(cè)的高效液相色譜(HPLC)測(cè)定同型半胱氨酸。
[0149] 結(jié)果：
[0150] 在圖2中，示出了如本文中限定的6種生物標(biāo)志物中的至少4種的組合與特異性的 相關(guān)性。如顯示的，僅僅在將至少4種標(biāo)志物組合時(shí)才獲得至少90%的特異性，然而僅僅在 將至少4種標(biāo)志物組合時(shí)，就足以獲得至少90%的特異性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于診斷受試者中的阿爾茲海默癥（AD)或確定受試者中發(fā)生阿爾茲海默癥 (AD)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括： a) 測(cè)定來自受試者的生物樣品中的AD生物標(biāo)志物的水平或量;和 b) 基于所述生物標(biāo)志物的水平或量，以高的特異性確定或診斷AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng) 險(xiǎn)，其中所述AD生物標(biāo)志物是至少四種選自腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因 子-l(IGF-l)、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和單 核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)中的生物標(biāo)志物，并且其中IL-18和/或MCP-1的增加，和/或 BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的降低指示AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)。2. -種用于確定受試者中的阿爾茲海默癥(AD)的狀態(tài)的方法，所述方法包括： a) 測(cè)定來自受試者的生物樣品中的AD生物標(biāo)志物的水平或量;和 b) 基于所述生物標(biāo)志物的水平或量，以高的特異性確定AD的存在或狀態(tài)， 其中所述AD生物標(biāo)志物是至少四種選自腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因 子-l(IGF-l)、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和單 核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)中的生物標(biāo)志物，其中IL-18和/或VEGF的增加，和/或BDNF、IGF- 1、MCP-1和/或TGF-βΙ的降低指示嚴(yán)重AD的存在。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其還包括提供來自受試者的生物樣品的步驟。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3所述的方法，其中測(cè)定如權(quán)利要求1中限定的至少五種AD生物標(biāo) 志物的水平或量，優(yōu)選地，其中測(cè)定如權(quán)利要求1中限定的全部生物標(biāo)志物。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物為蛋白或肽的形式。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)定如下的生物標(biāo)志物的組合： a) BDNF、IGF-1、VEGF和TGF-βΙ; b) BDNF、IGF-1、VEGF、IL-18和MCP-1; c) BDNF、VEGF、TGF-β1、IL-18和MCP-1; d) IGF-1、VEGF、TGF-β1、IL-18、MCP-1; e) K)NF、IGF-1、VEGF和MCP-1; f) BDNF、IGF-1、TGF-βΙ、MCP-1; g) BDNF、IGF-1、VEGF、TGF-βΙ、MCP-1。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中診斷AD或預(yù)測(cè)AD的風(fēng)險(xiǎn)以及確定嚴(yán)重 AD的存在的特異性具有至少90%，優(yōu)選至少95%的準(zhǔn)確性。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品選自組織或包括血液的 體液，優(yōu)選選自外周血液，特別是選自血清。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用免疫試驗(yàn)，優(yōu)選ELISA、 RIA、多重免疫試驗(yàn)或免疫熒光試驗(yàn)、蛋白印跡、線性試驗(yàn)、斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述樣品中的AD生物標(biāo)志物的水 平或量與所述生物標(biāo)志物的參比水平或量進(jìn)行比較，其中所述參比水平是： a) 從未患有AD的群體獲得的平均水平;和/或 b) 來自包括AD患者的個(gè)體的組的平均或中值水平，并且 其中分別在預(yù)定的相對(duì)或絕對(duì)界限水平或量之上或之下，所述生物標(biāo)志物的水平或量 指示AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)或者指示嚴(yán)重AD的存在。11. 一種試劑盒，其包含用于至少四種選自腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長(zhǎng) 因子-l(IGF-l)、腫瘤生長(zhǎng)因子m(TGF-m)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和 單核細(xì)胞趨化蛋白-l(MCP-l)中的生物標(biāo)志物的檢測(cè)工具，所述試劑盒用于診斷受試者中 的AD或確定受試者中發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)或用于確定受試者中嚴(yán)重AD的存在，任選地，所述試劑 盒含有關(guān)于如何在根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的用于診斷AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn) 以及用于確定嚴(yán)重AD的存在的方法中使用所述試劑盒的說明書。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其是ELISA、RIA、多重免疫試驗(yàn)或免疫熒光試驗(yàn)、蛋 白印跡、線性試驗(yàn)、斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)。13. 根據(jù)權(quán)利要求11~12中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其用于根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng) 所述的方法中。14. 一種陣列，其包含用于檢測(cè)如權(quán)利要求1中限定的生物標(biāo)志物中的至少四種、優(yōu)選 所述生物標(biāo)志物中的至少五種或用于根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的方法中的工具。15. 根據(jù)權(quán)利要求11~14中任一項(xiàng)所述的試劑盒或陣列，其中所述檢測(cè)工具是特異性 地針對(duì)如權(quán)利要求1中限定的AD生物標(biāo)志物的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。16. 如權(quán)利要求1中限定的AD生物標(biāo)志物中的至少四種、如五種的組合用于AD的診斷、 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或療法對(duì)照中的體外用途，其通過如下進(jìn)行:確定個(gè)體的生物樣品中的所述生物 標(biāo)志物的水平或量，并且確定與所述AD生物標(biāo)志物的參比水平或量相比，所述生物標(biāo)志物 中的至少四種、如至少五種的增加或降低，其中所述參比水平是： a) 從未患有AD的群體獲得的平均水平;和/或 b) 來自包括AD患者的個(gè)體的組的平均或中值水平，并且 分別在預(yù)定的相對(duì)或絕對(duì)界限水平或量之上或之下，所述生物標(biāo)志物的水平或量指示 AD的存在或發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)。17. -種診斷AD或確定發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法，所述方法包括以下步驟： a) 獲得根據(jù)權(quán)利要求1所述的AD生物標(biāo)志物中的至少四種在受試者和任選對(duì)照的生物 樣品中的測(cè)定水平或測(cè)定量的數(shù)據(jù)； b) 通過將所述樣品中的AD生物標(biāo)志物的水平或量與從數(shù)據(jù)庫獲得的界限值或作為界 限對(duì)照的測(cè)定水平或測(cè)定量獲得的界限值進(jìn)行比較而對(duì)步驟a)的數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算； c) 分析和鑒定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的AD生物標(biāo)志物。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法，其中所述分析是主成分分析。19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法，其還包括以下步驟： d) 在輸出單元上示出分析和鑒定AD標(biāo)志物的數(shù)據(jù)，特別地，示出AD的診斷或風(fēng)險(xiǎn)的結(jié) 果。20. 計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)或計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其具有用于執(zhí)行如權(quán)利要求1~10或權(quán)利要求 17~19中指出的步驟的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的指令。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK106062563SQ201580006178
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年1月28日
【發(fā)明人】安格萊特·福伊爾黑爾姆-海德爾
【申請(qǐng)人】普雷德姆泰克有限公司