一種巴豆醛-dna加合物的測定方法
【專利摘要】一種巴豆醛?DNA加合物的測定方法，即DNA中Propano?dG的測定方法，采用巴豆醛溶液暴露小牛胸腺DNA，DNA溶液進行酶水解并依次加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標和DNA水解酶。水解液經(jīng)Strata?X小柱固相萃取，收集洗脫液，室溫下氮吹至干，復(fù)溶于甲醇水溶液，引入LC?MS/MS系統(tǒng)分析，可準確檢測出加合物Propano?dG的含量水平。本發(fā)明為全新的DNA中巴豆醛?DNA加合物的測定方法，采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標定量分析物可以減少樣品前處理過程中引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性、準確性和靈敏度。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機溶劑的消耗量。
【專利說明】
一種巴豆醛-DNA加合物的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于DNA樣本的理化檢驗技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及DNA中1，N2-丙醇-鳥嘌呤 (Propano-dG)加合物的測定技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/ MS )測定DNA中巴豆醛-DNA加合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巴豆醛是一種廣泛存在于環(huán)境基質(zhì)中的污染物，如工業(yè)生產(chǎn)、機動車尾氣和卷煙 煙氣等；巴豆醛為可疑的人類致癌物，性質(zhì)較活潑，易于鳥嘌呤上的堿基發(fā)生邁克爾加成-關(guān)環(huán)反應(yīng)形成環(huán)外加成產(chǎn)物1，N 2-丙醇-鳥噪呤(Propano-dG)，該加合物可抑制DNA的合成 并導(dǎo)致錯譯。
[0003] 目前，關(guān)于DNA加合物的分析檢測方法報道的較多，主要有32P-后標記技術(shù)、酶聯(lián)免 疫技術(shù)(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC-UV)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應(yīng)用于DNA加合物的檢測分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 技術(shù)建立的巴豆醛-DNA加合物(Propano-dG)的測定方法。該方法具有快速、準確、靈敏度高 等特點，可用于DNA中巴豆醛-DNA加合物的定性定量分析。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的： 一種巴豆醛-DNA加合物的測定方法，即Propano-dG的測定方法，具體步驟如下： a、巴豆醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液（巴豆醛 溶液用〇. 1 M的roS溶液配制，濃度0.001-1 mM)，對照組加入同等體積的PBS溶液。將上述溶 液放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清 液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 yL超純水復(fù)溶，用 NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個吸收單位 (0D)相當于50 yg/mL。
[0006] b、DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液(pH=7)中，向DNA溶液中加入20 yL的[15N5]Propano_dG內(nèi)標溶液和60U脫氧核 糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù) 孵育2h。水解液經(jīng)Strata-X固相萃取，收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100此30%甲醇水溶 液，即為樣品待測液。此過程的目的是為了使雙鏈DNA酶解成單核苷酸狀態(tài)，通過固相萃取 和氮吹濃縮純化分離并富集所需的DNA加合物。所述內(nèi)標為10 ng/mL的[15地]Propano-dG。
[0007] c、標準工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的Propano-dG標準工作溶液。
[0008] d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶 液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內(nèi)標峰 面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
[0009] 色譜條件:Extend-C18(1.8 wn，4.6X100 mm)色譜柱，流動相體系選取A:0.01%甲 酸甲醇和和B: 10 mM乙酸銨水溶液，洗脫條件為梯度洗脫:0-2 min:32% A，2-7 min:42% A， 7-10 min:32% A，分析時間為10 min，進樣量為5 yL。
[0010] 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V， 離子源溫度：600°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為45 psi，干燥氣為50 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：150 ms。監(jiān)測離子對為Propan〇-dG:338.3- 222 ? 1定量離子對，338 ? 3-117 ? 2定性離子對；內(nèi)標[15N5]Propan〇-dG為343 ? 2-227 ? 2〇
[0011] 本發(fā)明方法的線性范圍和檢出限： 將系列標準工作溶液注入LC-MS/MS，得到標準工作曲線、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。 Propano-dG標準曲線的點為0 ? 02，0 ? 05，0 ? 1，0 ? 2，0 ? 5，1 ? 0，1 ? 5，2 ? 0和5 ? 0 ng/mL，內(nèi)標 [15N5]Propano_dG的濃度為2 ng/mL。目標物的線性回歸方程為尸0.脫r娘㈨價，相關(guān)系數(shù) f=l.0000。利用加標稀釋得到方法的定量限和檢出限，目標峰十倍信噪比對應(yīng)的濃度為定 量限L0Q，三倍信噪比對應(yīng)的濃度為檢出限L0D，該方法對應(yīng)Propano-dG的L0Q和L0D分別為 0.006 ng/mL 和0.018 ng/mL。
[0012] 本發(fā)明方法加標回收率和重復(fù)性： 采取小牛胸腺DNA樣本中加標的方法獲得方法的加標回收率，總共選取了三個添加水 平，每個添加水平重復(fù)測定3次，得到的方法的回收率和重復(fù)性，結(jié)果見表1。目標物的回收 率在86.3%-99.8%之間，RSD小于5%，證明方法的準確性和重復(fù)性結(jié)果較好。
[0013] 表1分析物的加標回收率和重復(fù)性
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對DNA中巴豆醛-DNA加合物的 色譜條件進行了優(yōu)化，并對LC-MS/MS的相關(guān)檢測條件進行了優(yōu)化。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明 方法具有如下優(yōu)良效果： ①與傳統(tǒng)的液相色譜方法比較，由于選取了串聯(lián)質(zhì)譜，使得方法的選擇性和靈敏度提 高，有利于DNA中低含量的巴豆醛-DNA加合物的測定。
[0014] ②本方法具有操作簡便、快速、準確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點。
[0015] ③本發(fā)明方法采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標定量分析物可以減少樣品前處理過程中 引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準確性和靈敏度。通過色譜柱以及 洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機 溶劑的消耗量。
【附圖說明】
[0016]圖1巴豆醛-DNA加合物及其內(nèi)標的總離子流圖。
[0017] 圖2不同巴豆醛暴露劑量下，小牛胸腺DNA中Propano-dG的含量。
[0018]
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明以下結(jié)合實例做進一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0020] 一種DNA中巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其測試過程是用巴豆醛溶液對小牛胸 腺DNA進行暴露，對DNA溶液進行酶水解并加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標和DNA水解酶。水解液經(jīng) Strata-X小柱固相萃取，收集洗脫液氮吹濃縮，引入LC-MS/MS系統(tǒng)分析。
[0021] 實例 1: 1.儀器與試劑： AB SCIEX三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國加州應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Agilent 1200高效 液相色譜(美國安捷倫公司），NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國賽默飛科技公司），恒 溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛科技公司），Milli-Q水純化系統(tǒng)(德國默克集團），Analyst 1.5.1數(shù) 據(jù)采集與處理軟件。
[0022]脫氧核糖核酸酶I、堿性磷酸酶（美國紐英倫生物技術(shù)公司），磷酸二酯酶I、乙酸 銨、甲酸、和小牛胸腺DNA(美國西格瑪公司），甲醇(韓國德山試劑公司），Strata-X聚合物小 柱(33 ym，30 mg/lmL，廣東菲羅門科學儀器有限公司）。標準品Propano-dG，內(nèi)標物[15N5] Pr opano-dG。試劑均為色譜純。
[0023] 2 ?樣品處理： 巴豆醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同濃度的巴豆醛溶液 (0.001，0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM)，對照組加入同等體積的PBS溶液。將上述溶液放入 37 °C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用 70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 yL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個吸收單位相當于50 y g/mL〇
[0024] DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2 緩沖液(pH=7)中，加入20 yL的[15N5]Pr〇pan〇-dG內(nèi)標溶液和60U脫氧核糖核酸酶I，在37°C 中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h。水解液經(jīng)1 mL甲醇活化和1 mL純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇 水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100此30%甲醇水 溶液，即為樣品待測液。
[0025] 3.測定方法： 吸取不同濃度的標準溶液和前處理之后的小牛胸腺DNA樣品各5 yL，注入LC-MS/MS系 統(tǒng)進行分離分析，測得樣本中巴豆醛-DNA加合物的含量。
[0026]實例2:如實施例1所述，利用本研究建立的方法對不同濃度巴豆醛(0.001，0.01， 0.05，0.1，0.5和1.0 mM)暴露的小牛胸腺DNA中巴豆醛-DNA加合物進行了檢測(每個樣本平 行檢測三次）。依據(jù)標準曲線和峰面積得出各個樣品中DNA加合物的濃度，根據(jù)公式
計算獲得各個樣品中DNA加合物相對于核苷酸的含量，結(jié)果乘以108換算成DNA加合物 個數(shù)/1〇8個核苷酸。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示Propano-dG的量與巴豆醛暴露劑量成效應(yīng)關(guān)系（SPSS，P <0.003,圖 2)。
【主權(quán)項】
1. 一種巴豆醛-DNA加合物的測定方法，即DNA中I，N2-丙醇-鳥噪呤(Propano-dG)的測定 方法，其特征在于:包括以下具體步驟： a、 巴豆醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液，對照組 加入同等體積的PBS溶液;將上述溶液放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇 沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并 加入200 yL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對 于雙鏈DNA-個吸收單位(OD)相當于50 yg/mL; b、 DNA的酶水解及純化富集:將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖 液中，向DNA溶液中加入20 yL內(nèi)標溶液和60U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，隨后加入 0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h，水解液經(jīng)Strata-X固相萃取， 收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100 yL 30%甲醇水溶液，即為樣品待測液； c、標準工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的Propano-dG標準工作溶液； d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶液，注 入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內(nèi)標峰面積的 比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟a中巴豆醛 溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟b中所述內(nèi) 標溶液為 I 〇 ng/mL的[15Νδ ] Propano-dG 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟d中選取 Extend_C18色譜柱，規(guī)格1.8 ym，4.6X100 mm，流動相體系選取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙 酸銨水溶液B，梯度洗脫，分析時間為10 min，進樣量為5 yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：梯度洗脫條件 為：0-2 min :32% A，2-7 min :42% A，7-10 min :32% A;流速為0.40 mL/min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟d中串聯(lián)質(zhì) 譜檢測器的條件：電噴霧離子源ESI，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式;噴霧電壓：5500 V，離子 源溫度:600°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為45 psi，干燥氣為50 psi，碰撞氣為9 psi， 射入電壓：1〇 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：150 ms;監(jiān)測離子對為Propan〇-dG:338.3-222.1 定量離子對，338 · 3-117 · 2定性離子對；內(nèi)標[15N5]Propano_dG為343 · 2-227 · 2〇
【文檔編號】G01N30/02GK105911165SQ201610226586
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】侯宏衛(wèi), 胡清源, 陳歡, 劉魯娟, 朱貝貝, 王紅娟, 陳建
【申請人】國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心