一種抑制乙型肝炎病毒的雙功能3p-siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙功能高效特異抑制HBV復(fù)制的5’-ppp-siRNA(3p-siRNA)的合成及應(yīng)用。該3p-siRNA一方面通過RNAi機制特異性沉默HBV靶基因表達，同時還通過RIG-I依賴機制激活宿主干擾素表達、經(jīng)抗病毒天然免疫反應(yīng)表現(xiàn)抗病毒效應(yīng)，是一種兼?zhèn)銻NAi和激活宿主抗病毒天然免疫效應(yīng)的雙功能抗HBV新型3p-siRNA；該3p-siRNA毒性較小，能高效激活RIG-I介導(dǎo)的宿主天然抗病毒干擾素(IFN)表達，同時顯著抑制HBV的HBeAg和HBsAg分泌以及DNA復(fù)制并呈明顯劑量依賴性。本發(fā)明所述的抗HBV雙功能3p-siRNA采用體外轉(zhuǎn)錄方法和人工化學合成方法制備，可用于HBV新型藥物研究和開發(fā)。本發(fā)明所述的雙功能3p-siRNA可以應(yīng)用于其它人類重要病毒和細菌新型核酸類藥物研究和開發(fā)。
【專利說明】—種抑制乙型肝炎病毒的雙功能3p-siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制乙型肝炎病毒的雙功能3p_siRNA的合成及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是`一種可以全球性感染的病毒,具有組織和種屬特異性，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌，主要感染成人，嚴重影響人類的健康與生命安全。中國是HBV感染大國，每年直接用于治療的費用高達500億人民幣。目前針對慢性HBV感染者和攜帶者沒有特效治療方法。HBV基因組較小，易發(fā)生突變，限制了靶向病毒的抗病毒藥物應(yīng)用。核酸類藥物和干擾素-α是目前最常用的治療HBV藥物，但是面臨著停藥“反跳”以及耐藥等問題。至今沒有一種能夠徹底治愈HBV的特效藥物。
[0003]RNA 干擾技術(shù)是基于 RNA 干擾(RNA inter-ference, RNAi)現(xiàn)象，由 dsRNA、siRNA或shRNA介導(dǎo)，通過對同源互補靶基因mRNA的降解而實現(xiàn)特異性基因沉默的技術(shù)。siRNA在特異性降解同源互補的mRNA的同時也可能受到“脫靶效應(yīng)”的干擾而降低敏感性?！懊摪行?yīng)”產(chǎn)生的原因是:非靶基因與siRNA部分互補，或是外源性RNA以病毒感染的方式觸發(fā)了宿主免疫傳感元件。通過對siRNA的5'端進行磷酸化修飾，生成5’-ppp-siRNA (3p-siRNA)，不僅沉默特異性基因表達，可以避免“脫靶效應(yīng)”。3p-siRNA是一類具有21-25個核苷酸的特殊dsRNA分子，其序列與靶mRNA序列具有同源性，其雙鏈均由5’端3個磷酸基團和3’端羥基基團構(gòu)成，每條單鏈的3’端均有2個突出的非配對堿基。如圖1所示。
[0004]對普通RNA分子的5 ’端進行磷酸化修飾,生成5 ’ -ppp-RNA (3p-RNA),可以結(jié)合并活化維甲酸誘導(dǎo)基因I (retinoic-acid-1nducible gene I，RIG-1),是RIG-1特有的配體，能夠被天然免疫系統(tǒng)識別，激活RIG-1介導(dǎo)的干擾素(IFN)通路。目前，此種性質(zhì)僅見于RNA分子。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是:利用5’ -ppp-RNA激活RIG-1信號通路的性質(zhì)，將這一特性拓展用于siRNA分子，提供一種沉默HBV特定基因同時又激活天然免疫通路的抗HBV雙功能核酸類藥物。
[0006]具體來說，本發(fā)明針對HBV基因組的特定區(qū)域，設(shè)計一種能夠特異性沉默HBV基因組表達的3p-siRNA序列，該序列為雙鏈RNA，其雙鏈均由5’端3個磷酸基團和3’端羥基基團構(gòu)成，每條單鏈的3’端均有2個突出的非配對堿基。
[0007]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，上述RNA可根據(jù)已知的HBV病毒基因組序列按照堿基互補原則進行設(shè)計，例如，可針對HBV病毒C蛋白、X蛋白、S蛋白和P蛋白的編碼區(qū)域或重疊區(qū)域進行設(shè)計，采用體外轉(zhuǎn)錄法和人工化學合成法，獲得具有沉默HBV特定基因的3p-siRNA分子。在本發(fā)明的一個實施例中，發(fā)明人分別針對X蛋白獨立編碼區(qū)、S蛋白和P蛋白的編碼重疊區(qū)設(shè)計并得到了兩條3p-siRNA，即3p-siRNA(s/p)和3p_siRNA (x)，二者均具有抑制HBV復(fù)制的作用。[0008]本發(fā)明目的3p_siRNA分子的突出優(yōu)點體現(xiàn)在:⑴特異性:基于RNA干擾機制，特異性沉默HBV基因組目的區(qū)域，有效抑制HBV復(fù)制，并且克服了基因沉默中的“脫靶”效應(yīng)。
(2)高效性:該分子具有雙重功能，既可以特異性沉默HBV基因，又具有RIG-1依賴的激活宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)功能，共同實現(xiàn)抑制HBV復(fù)制的目的。(3)安全性:在使用濃度為IOOnM時對H印G2.2.15細胞無顯著毒性，僅在500nM時對H印G2.2.15細胞表現(xiàn)出一定毒性。
[0009]本發(fā)明提供的3p_siRNA可用于治療HBV感染引起的相關(guān)疾病，例如，可用于制備治療HBV感染的藥物組合物，包括臨床使用的片劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑、膠囊、滴丸、顆粒劑和其它適宜的劑型；也可與其他治療HBV感染藥物合用，以期增強療效、降低毒性或延緩抗藥性等。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0010]圖1為3p-siRNA結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖2為體外轉(zhuǎn)錄方法生成目的3p_siRNA的流程，以3p_siRNA (s/p)為例。
[0012]圖3 為 3p-siRNA(s/p)對 H印G2.2.15 細胞的毒性(3p_siRNA 轉(zhuǎn)染 96 小時)。
[0013]圖4 為 3p-siRNA(s/p)激活 RIG-1 介導(dǎo)的 IFN 通路(A:293T 細胞，3p_siRNA 轉(zhuǎn)染24 小時；B:HepG2.2.15 細胞，3p_siRNA 轉(zhuǎn)染 24 小時；C:HepG2.2.15 細胞，3p_siRNA 活化RIG-1 介導(dǎo)的 ISRE 表達；D:HepG2.2.15 細胞，CIAP+3p_siRNA 未激活 RIG-1 介導(dǎo)的 IFN 通路)。
[0014]圖5 為 3p-siRNA(s/p)在不同時間對 HBsAg、HBeAg 抑制率(A、B:48 小時；C、D:96小時;E、F:144小時)。
[0015]圖6 為不同劑量 3p-siRNA(s/p)對HBsAg、HBeAg抑制率(3p_siRNA轉(zhuǎn)染 48 小時)。
[0016]圖7 為 3p-siRNA(s/p)和 3p_siRNA(x)對 HBsAg、HBeAg 抑制率(3p_siRNA 轉(zhuǎn)染 48小時)。
【具體實施方式】:
[0017]一、3p_siRNA的序列設(shè)計與體外合成:
[0018]首先，分別選取X蛋白獨立編碼區(qū)、S蛋白和P蛋白的編碼重疊區(qū)序列設(shè)計并化學合成DNA模板(5，段包含T7啟動子)，然后分別用雙鏈RNA正義鏈和反義鏈的DNA模板轉(zhuǎn)錄生成兩條單鏈RNA。正義鏈和反義鏈模板5’末端突出的鳥嘌呤有利于T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。然后混合這兩個反應(yīng)體系孵育過夜，退火形成雙鏈RNA。用DNAse-1 (Epicenter)消化DNA模板，接著用酚/氯仿抽提去除額外的鹽和NTPs，醋酸鈉和冷乙醇沉底，70%乙醇漂洗后TEBuffer溶解沉底。如圖2所示。
[0019]使用堿性磷酸酶(CIAP，TaKaRa)去除3p_siRNA 5’末端的5’ -PPP基團，生成siRNA作為對照，根據(jù)以下方法完成:2ug體外轉(zhuǎn)錄的3p-siRNA用6U CIAP, 40URnase inhibitor 在 CIAP Buffer 中 50 °C,處理 60min,其中 CIAP Buffer 成分是:500mMTris-HCl (ph9.0)和IOmMMgCl2。接著用苯酚/氯仿抽提，醋酸鈉和冷乙醇沉底，70%乙醇漂洗后TE Buffer溶解沉底。
[0020]二、通過以下實例對本發(fā)明所述藥物3p_siRNA的細胞水平毒性、對RIG-1介導(dǎo)IFN通路的影響、對HBeAg、HBsAg的抑制率以及作用特征進行評價，但不限于以下實例。所用生物實驗主要包括:細胞培養(yǎng)、MTT實驗、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告基因分析和ELISA實驗，具體實施過程如下:[0021]實施例一:3p-siRNA(s/p)的細胞水平毒性評價
[0022]1.H印G2.2.15 細胞培養(yǎng)
[0023]HepG2.2.15細胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2.2.15細胞接種96孔板(I X IO4細胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0024]2.3p_siRNA 轉(zhuǎn)染
[0025]接種至96孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)24小時，待長至40_60%細胞匯合后，在無G418狀態(tài)下，采用轉(zhuǎn)染試劑jetPRME并參照說明書操作進行轉(zhuǎn)染3p-siRNA(IOOnM)，6小時后換為正常細胞培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液)，37°C、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。
[0026]3.MTT 檢測
[0027]按照上述方法轉(zhuǎn)染3p-siRNA，濃度分別為IOOnM和500nM并設(shè)細胞對照，每濃度設(shè)立五個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染體積為lOOul。轉(zhuǎn)染96小時后，參照MTT使用說明書，每孔加入MTT IOul,避光培養(yǎng)4小時后加入formazan溶解液，37°C孵育4小時，經(jīng)多標記酶聯(lián)免疫檢測儀測量570nm吸光度值。同時，在轉(zhuǎn)染3p_siRNA后在倒置顯微鏡下每日觀察細胞形態(tài)變化情況。
[0028]4.結(jié)果
[0029]在使用濃度為IOOnM時，所述3p_siRNA對H印G2.2.15細胞無顯著毒性，在500nM時對!fepG2.2.15細胞表現(xiàn)出一定毒性。如圖3所示。
[0030]實施例二:3p-siRNA (s/p)對RIG-1介導(dǎo)干擾素通路的激活作用
[0031]1.293T細胞和H印G2.2.15細胞培養(yǎng)
[0032]細胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將細胞接種于含有無G418、10% FBS、DMEM培養(yǎng)基的24孔板(3 X IO6細胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。
[0033]2.3p_siRNA 轉(zhuǎn)染
[0034]接種至24孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)24小時，待長至40_60%細胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用轉(zhuǎn)染試劑jetPRME并參照說明書操作進行轉(zhuǎn)染3p-siRNA(IOOnM)，6小時后換為正常細胞培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液)，37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。
[0035]3.雙熒光素酶報告基因分析法檢測干擾素通路激活及ISRE表達
[0036]將IFN-β熒光素酶報告基因、干擾素刺激應(yīng)答元件(IRSE)熒光素酶報告基因分別與Flag-hRIG-1共同轉(zhuǎn)染HEK293T和H印G2.2.15細胞，同時轉(zhuǎn)入海腎蟲熒光素酶報告基因作為內(nèi)參；轉(zhuǎn)染24小時后，用3?-^8熟、(:^^處理生成的&8熟或？017(1:0轉(zhuǎn)染細胞，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，利用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測熒光素酶活性。
[0037]4.結(jié)果
[0038]3p-siRNA作用24小時后能夠顯著激活RIG-1介導(dǎo)的干擾素表達，同時活化RIG-1介導(dǎo)的ISRE表達；而CIAP處理生成的siRNA未激活RIG-1介導(dǎo)的干擾素表達。如圖4所
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[0039]實施例三:3p_siRNA(s/p)作用48小時、96小時及144小時對HBsAg、HBeAg的抑制率
[0040]1.HepG2.2.15 細胞培養(yǎng)
[0041]H印G2.2.15細胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2.2.15細胞接種96孔板(I X IO4細胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0042]2.3p_siRNA 轉(zhuǎn)染
[0043]接種至96孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)24小時，待長至40_60%細胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用轉(zhuǎn)染試劑jetPRME并參照說明書操作進行轉(zhuǎn)染3p-siRNA(IOOnM)，6小時后換為正常細胞培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液)，37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。
[0044]3.ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中的HBsAg、HBeAg
[0045]分別于轉(zhuǎn)染3p_siRNA48、96、144小時后收集細胞培養(yǎng)上清，按照HBsAg和HbeAgELISA檢測試劑盒(萬泰公司)說明書操作步驟檢測。取50ul細胞培養(yǎng)液加入包被有HBsAb或HBeAb的96孔板中，每孔加入50ulHBsAg/HbeAg對應(yīng)的酶標結(jié)合物，37°C孵育lh，用洗液洗板5次，依次加入顯色液A 50ul、顯色液B 50ul，37°C孵育15min，加入終止液50ul，在酶標儀上測定 450nm/630nm 處 Is 吸光值 A。根據(jù) IR = (A450 M-A450 /A450?計算抑制率。
[0046]4.結(jié)果
[0047]轉(zhuǎn)染3p-siRNA后48小時、96小時、144小時3p_siRNA對HBsAg和HBeAg的抑制率分別是 55%和 41.8%、3 7%和 24.3%、33.3%和 14.8% ;當共轉(zhuǎn)染 RIG-1 和 3p_siRNA時，3p-siRNA 對 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率分別是 66.3%和 53%、55.5%和 49.7%,45.6%和26.5%。3p-siRNA轉(zhuǎn)染48小時后對HBV抑制率最高；與只轉(zhuǎn)染3p_siRNA相比，共轉(zhuǎn)染RIG-1時3p-siRNA對HBV表現(xiàn)出更明顯的抑制活性。如圖5所示。
[0048]實施例四:不同劑量(50nM、100nM、200nM)3p-siRNA(s/p)作用48 小時對 HBsAg、HBeAg的抑制率
[0049]1.HepG2.2.15 細胞培養(yǎng)
[0050]HepG2.2.15細胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2.2.15細胞接種96孔板(I X IO4細胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0051]2.3p_siRNA 轉(zhuǎn)染
[0052]接種至96孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)24小時，待長至40_60%細胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用轉(zhuǎn)染試劑jetPRME并參照說明書操作進行轉(zhuǎn)染3p-siRNA(50nM、100nM、200nM)，6小時后換為正常細胞培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液)，37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。
[0053]3.ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中的HBsAg、HBeAg
[0054]于轉(zhuǎn)染3p_siRNA48小時后收集細胞培養(yǎng)上清，按照HBsAg和HBeAg ELISA檢測試劑盒(萬泰公司)說明書操作步驟檢測。取50ul細胞培養(yǎng)液加入包被有HBsAb或HBeAb的96孔板中，每孔加入50ulHBsAg/HbeAg對應(yīng)的酶標結(jié)合物，37°C孵育Ih后，用洗液洗板5次，依次加入顯色液A 50ul、顯色液B 50ul，37°C孵育15min，加入終止液50ul，在酶標儀上測定450nm/630nm處Is吸光值A(chǔ)。根據(jù)IR = (AASOwm 4450^^)/^4505^計算抑制率。
[0055]4.結(jié)果[0056]以不同劑量(50nM、100nM、200nM)3p-siRNA對HBsAg、HBeAg的抑制作用呈明顯劑量依賴性。如圖6所示。
[0057]實施例四:3p-siRNA(s/p)、3p_siRNA(x)分別作用48 小時對 HBsAg、HBeAg 的抑制
率
[0058]1.HepG2.2.15 細胞培養(yǎng)
[0059]H印G2.2.15細胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2.2.15細胞接種96孔板(I X IO4細胞/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0060]2.3p_siRNA 轉(zhuǎn)染
[0061]接種至96孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)24小時，待長至40-60%細胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME并參照說明書操作分別進行轉(zhuǎn)染3p-SiRNA(S/p)、3p-siRNA(x)(IOOnM)，6小時后換為正常細胞培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液)，37°C，5 % CO2繼續(xù)培養(yǎng)。
[0062]3.ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中的HBsAg、HBeAg
[0063]于轉(zhuǎn)染3p_siRNA48小時后收集細胞培養(yǎng)上清，按照HBsAg和HBeAg ELISA檢測試劑盒(萬泰公司)說明書操作步驟檢測。取50ul細胞培養(yǎng)液加入包被有HBsAb或HBeAb的96孔板中，每孔加入50ulHBsAg/HbeAg對應(yīng)的酶標結(jié)合物，37°C孵育Ih后，用洗液洗板5次，依次加入顯色液A 50ul、顯色液B 50ul，37°C孵育15min，加入終止液50ul，在酶標儀上測定450nm/630nm處Is吸光值A(chǔ)。根據(jù)IR = (AASOwm 4450^^)/^4505^計算抑制率。
[0064]4.結(jié)果
[0065]3p-siRNA(s/p)、3p_siRNA(x)均可以抑制 HBsAg、HbeAg 的表達，二者的抑制作用之間不具有顯著差異。如圖7所示。
【權(quán)利要求】
1.一種新型高效雙功能的抑制HBV復(fù)制的核酸類藥物，其特征為:該核酸類藥物具有通過RNAi機制特異性沉默HBV靶基因表達從而有效抑制HBV復(fù)制的特性，同時該核酸類藥物具有通過RIG-1依賴機制激活宿主干擾素(IFN)表達，通過抗病毒天然免疫反應(yīng)表現(xiàn)抗病毒效應(yīng)，是一種兼?zhèn)銻NAi和激活宿主抗病毒天然免疫效應(yīng)的雙功能抗HBV新型核酸類藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸藥物，其特征為:其有效成分為三磷酸siRNA (3p-siRNA)，是一種雙鏈RNA分子，每條單鏈的5’端帶有3個磷酸基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸藥物，其特征為:其siRNA序列與HBV基因組編碼區(qū)的特定部分(蛋白獨立編碼區(qū)或重疊編碼區(qū))互補，可以是5’ ppp-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUU3’或者 5’ ppp-GACCUUGAGGCAUACUUCA UU-3’ 及其它序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸藥物，其特征為:可以通過體外轉(zhuǎn)錄方法和人工化學合成方法進行大量制備。
5.權(quán)利I至4所述的任一3p-siRNA分子在制備抗HBV病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK103505742SQ201210202528
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月19日
【發(fā)明者】陳忠斌, 邢雅玲, 陳曉娟, 閆飛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所