一種葉面鋅肥肥效的原位評價方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及葉面肥肥效評價技術，具體涉及一種葉面鋅肥肥效的原位評價方法。
【背景技術】
[0002]鋅是動植物和人體必需的微量營養(yǎng)元素，直接或間接參與生命體內(nèi)的代謝過程，在生命活動中起著極其重要的作用，被譽為“生命之花”、“智慧元素”。然而，我國缺鋅狀況十分嚴重，土壤缺鋅面積高達40%，嚴重影響了作物產(chǎn)量與品質(zhì)，直接或間接導致了人體對鋅的攝入不足，成為威脅人類健康尤其是兒童智力發(fā)育的重要限制因子。在解決人類對微量元素需求的途徑中，糧食作物微量元素的生物強化被認為是最有前景的途徑之一，因此，通過農(nóng)藝措施改善作物鋅營養(yǎng)狀況，對提高作物生產(chǎn)力和保障人體健康均具有非常重要的現(xiàn)實意義。
[0003]葉面施肥是公認的實現(xiàn)微量元素生物強化目標最直接、高效的農(nóng)藝措施之一，葉面鋅肥可以有效彌補土壤施鋅肥存在的易被土壤吸附固定、淋失、施用不均等局限性，補充作物鋅素營養(yǎng)、矯正作物缺鋅癥，提高作物產(chǎn)量品質(zhì)。作為土壤施肥的輔助措施，葉面肥已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用微量元素肥料的主導技術，顯示出明顯的效能優(yōu)勢和應用前景。
[0004]然而，葉面施鋅普遍存在著吸收難、轉(zhuǎn)運慢的問題，嚴重影響了葉面施鋅的作用效果和施用效率。葉面噴施的養(yǎng)分從葉表面滲透到葉片內(nèi)部后，其營養(yǎng)功效和生理有效性不僅取決于植物葉片細胞對養(yǎng)分的吸收利用，還與養(yǎng)分向其他部位的轉(zhuǎn)運與再利用能力相關。但是，迄今關于葉面噴施的鋅在植物葉片內(nèi)部如何被吸收利用、儲存與再轉(zhuǎn)運等關鍵機理仍知之甚少，如何促進鋅從葉片噴施部位向其他部位的轉(zhuǎn)運仍然是葉面鋅肥及其施用技術研發(fā)中的瓶頸。
[0005]可見，全面了解和闡明葉面鋅肥作用機理，不僅能為研發(fā)新型葉面鋅肥及其促效技術提供理論依據(jù)，而且是提高葉面鋅肥施用效率的關鍵所在。然而，長期以來，葉面噴施的鋅在植物體內(nèi)的追蹤和定位技術未能突破。傳統(tǒng)評價葉面肥的肥效技術，通常采用長期定位試驗方法，結合破壞性采樣等分析測試手段，費時長、見效慢，且由于易產(chǎn)生污染而常導致評價結果出現(xiàn)較大的偏差。同位素標記技術，雖可在一定程度上追蹤葉面噴施后鋅在植物中的吸收和轉(zhuǎn)運特征，但難以對進入到植物組織內(nèi)部的鋅進行細胞與亞細胞定位，不能原位解析鋅在植物體內(nèi)的吸收、運輸與再轉(zhuǎn)運機制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種葉面鋅肥肥效的原位評價方法，利用該方法能夠簡便高效地追蹤葉面噴施后，鋅在植物中的吸收和轉(zhuǎn)運特征，實現(xiàn)葉面鋅肥肥效的快速原位評價。
[0007]本發(fā)明所提供的技術方案為:
[0008]—種葉面鋅肥肥效的原位評價方法，包括如下步驟:
[0009]I)配制同位素68Zn標記液；
[0010]2)選取實驗植株中的待標記葉片，對待標記葉片的特定部位標記同位素68Zn標記液；
[0011]3)選定步驟2)中實驗植株的待測部位，所述的待測部位與特定部位沒有重合區(qū)域，對待測部位進行前置處理；
[0012]4)對步驟3)中經(jīng)過前置處理的待測部位進行μ-XRF原位分析、LA-1CPMS驗證分析、ICP-MS定量分析中的兩種或三種。
[0013]作為改進，所述的待標記葉片優(yōu)選成熟葉片;所述的待標記葉片的特定部位標記同位素68Zn標記液前，用去離子水清洗待標記葉片的上表皮和下表皮。
[0014]作為進一步改進，在所述的待標記葉片的特定部位標記同位素68Zn標記液前，在所述的待測部位用羊毛脂(Lanolin)涂抹并用Teflon膜包裹，避免待測部位受到同位素68Zn標記液的污染。
[0015]作為改進，所述的特定部位的同位素68Zn標記液的標記是通過粘貼含同位素68Zn標記液的濾紙或浸泡在同位素68Zn標記液中的兩種方式對特定部位進行標記。
[0016]作為優(yōu)選，所述的步驟2)中特定部位為待標記葉片的整個葉面，所述的步驟3)中待測部位為待標記葉片的葉柄以及實驗植株新生的新葉。
[0017]作為進一步優(yōu)選，所述的步驟3)中待測部位進行前置處理是指:將所述的待標記葉片的葉柄進行冷凍切片，然后冷凍干燥；另外分別將待標記葉片的葉柄和實驗植株新生的新葉烘干磨碎，進行三酸消煮。
[0018]作為優(yōu)選，所述的烘干磨碎，烘干溫度為60?70°C，時間為60?80h。
[0019]作為優(yōu)選，所述的步驟2)中特定部位為待標記葉片的局部葉面，所述的步驟3)中待測部位為待標記葉片的剩余葉面。
[0020]作為進一步優(yōu)選，所述的步驟3)中待測部位進行前置處理是指:將所述的待標記葉片的剩余葉面進行冷凍干燥。所述的冷凍干燥的溫度為-85?-75°C，時間為60?80h。[0021 ]作為優(yōu)選，所述的步驟I)中同位素68Zn標記液包括150?250mg L—1的ZnSO4水溶液，所述的ZnSO4水溶液中68Zn的摩爾比為5?15 %。作為改進，所述的同位素68Zn標記液還包括0.05?0.15%1%的表面活性劑5丨1?的L-77。表面活性劑用于降低同位素68Zn標記液的表面張力，提高同位素68Zn標記液在葉片表面的吸附量，增強葉面噴施效果。
[0022]作為優(yōu)選，所述的三酸消煮是指:將烘干磨碎后的樣品分散于三酸消煮液中，先進行常溫消煮，消煮溫度為20?28°C，時間為1.5?2.5h，再進行高溫消煮，消煮溫度為120?1400C，時間為4?6h;所述的三酸消煮液組成為:體積比為4.5?5.5:0.5?1.5:1的濃硝酸、高氯酸和氫氟酸的混合液。
[0023]作為優(yōu)選，所述的冷凍切片的溫度為-16?-20 °C，切片厚度為60?ΙΟΟμπι。溫度依據(jù)樣品的性質(zhì)可作適當調(diào)整，過低容易使樣品組織破碎，過高則組織冷凍硬度不夠，易導致切片不成型或出現(xiàn)褶皺。
[0024]作為優(yōu)選，所述的冷凍切片是指:將葉柄用OCT包埋劑包埋固定，置于冷凍切片機中進行切片。
[0025]作為優(yōu)選，所述的步驟4)中的μ-XRF原位分析、LA-1CPMS驗證分析和ICP-MS定量分析是指:將冷凍干燥后的樣品通過同步輻射熒光探針μ-XRF技術對樣品中鋅元素進行定位，同時利用激光刻蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜LA-1CPMS技術進一步定量分析樣品中68Zn的原位分布特征；利用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS技術測定三酸消煮后液體樣品中的鋅含量。
[0026]上述同步輻射微熒光探針μ-XRF技術可原位無損分析生命體內(nèi)各金屬元素的分布特征和形態(tài)信息。新一代XRF技術檢測限可達ppm量級，空間分辨率為微米乃至納米級(Nano-XRF，Nano-XRF-CT)，可表征生命體中元素在亞細胞水平上的定位信息。
[0027]上述μ-XRF實驗條件優(yōu)選為:利用帶有諧波抑制的Si(220)雙晶單色儀使得入射光為單色光，利用Kirkpatrick-Baez顯微鏡聚集光斑，光斑大小為2μηι，樣品打點角度為45°，利用單通道渦流Si檢測儀檢測熒光信號；光斑步長及掃描時間依據(jù)樣品性質(zhì)可作適當調(diào)整。
[0028]上述激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜LA-1CPMS技術是近幾年發(fā)展起來的生物組織樣品中元素成像技術，其可分析元素的同位素豐度，檢測限為亞ppm級，分辨率為ΙΟμπι。相較于XRF，LA-1CPMS優(yōu)勢在于靈敏度高，在分析低豐度樣品時有一定優(yōu)勢，但分辨率不如前者。
[0029]上述LA-1CPMS實驗條件優(yōu)選為:LA系統(tǒng)采用Nd: YAG激光器(波長213nm，重復頻率1Hz，激光參數(shù)設置為40%)，掃描光斑直徑為5μπι;植物樣品切片固定于樣品臺上，置于樣品室內(nèi)聚焦激光束按行掃描樣品，行與行之間的間隔設置為ΙΟμπι，灼燒后的樣品物質(zhì)由載氣氦氣和氫氣混合氣體送入ICP檢測離子強度。為了校正水分流失及樣品厚度對ICP的影響，需要同時檢測13C的離子強度，將13C作為內(nèi)標元素；用Ba和Rh標準樣品最優(yōu)化ICP-MS參數(shù)，并選取美國標準與技術研究院(NIST)的標準參比物作為參比物質(zhì)。
[0030]若無特殊說明，本發(fā)明中各溶液均采用超純水配制。
[0031]同現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0032]基于同位素示蹤與金屬組分析技術(y-XRF、LA-1CPMS、ICP_MS)，創(chuàng)建并優(yōu)化了葉面鋅肥肥效的原位評價方法，突破了傳統(tǒng)葉面肥肥效評價技術存在的耗時長、見效慢等技術瓶頸，率先在細胞水平上原位表征了植物體內(nèi)鋅的分布特征及其動態(tài)變化規(guī)律。
【附圖說明】
[0033]圖1為實施例1中同位素68Zn標記液標記示意圖；
[0034]圖2為實施例1中空白對照組的Zn元素的微區(qū)分布特征示意圖；
[0035]圖3為圖1中區(qū)域B的Zn元素的微區(qū)分布特征示意圖；
[0036]圖4為圖3中區(qū)域B進一步細掃的微區(qū)分布特征示意圖；
[0037]圖5為圖4進一步細掃的微區(qū)分布特征不意圖；
[0038]圖6為實施例1中LA-1CPMS定量分析待測葉片的鋅元素分布圖；
[0039]圖7為實施例2中同位素68Zn標記液標記示意圖；
[0040]圖8為實施例2中葉柄切片樣品的顯微組織圖；
[0041]圖9為實施例2中葉柄切片樣品的Zn元素的微區(qū)分布特征示意圖，ck為對照組，Zntreatments為實驗組；
[0042]圖10為實施例2中LA-1CPMS定量分析葉柄切片樣品的鋅元素分布圖；
[0043]圖11為實施例2中ICP-MS定量分析圖，ck為對照組，Zn為實驗組，Pet1le為葉柄切片樣品，New leaf為新生的新葉。
【具體實施方式】
[0044]實施例1
[0045]1、溶液配制
[0046]同位素68Zn標記液:4mL68Zn溶液(Isotec公司，Miamisburg，Oh1)，0.8g硫酸鋅，ImL Silwet L-77，溶于超純水中并定容至1L。
[0047]2、標記同位素68Zn標記液
[0048]用兩層塑料薄膜覆蓋住土壤表面，防止噴施同位素68Zn標記液時肥料滴入土壤中，再于塑料薄膜上覆蓋兩層吸水紙，用膠紙將塑料薄膜和吸水紙封嚴實，僅留出可供安裝滴灌的開口。
[0049]選取實驗植株為Prunus dulcis(Mill.)DAWebb品種杏樹，將完全展開的成熟葉片作為待標記葉片，用去離子水清洗葉片上表皮和下表皮，再用吸水紙輕輕吸干備用。
[0050 ] 將羊毛脂(Lano lin,Si gma公司)均勾地涂抹在所選待標記葉片的葉柄表面，并用Teflon膜小心將葉柄包裹完全。
[0051 ]將配置好的穩(wěn)定性同位素68Zn標記液轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，用方形玻璃纖維濾紙蘸取同位素68Zn標記液后，貼于所選待標記葉片的特定部位A，如圖1所示，用保鮮膜將濾紙固定于該位置上進行穩(wěn)定性同位素68Zn標記液標記處理。
[0052]3、樣品制備
[0053]上述實驗植株處理7天后，輕輕取下玻璃纖維濾紙，于