本發(fā)明涉及生物篩查領(lǐng)域，特別涉及篩查大豆花葉病毒的rpa-iac方法、引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
：大豆花葉病毒(soybeanmosaicvirus,smv)為馬鈴薯y病毒科(potyviridae)馬鈴薯y病毒屬(potyvirus)成員。smv初侵來(lái)源主要是帶毒種子，病毒會(huì)存在于種胚與子葉中(花粉攜毒)，毒力能保持兩年，甚至更久，帶毒種子發(fā)育成幼苗后，葉、莖都可能帶有病毒并表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀。由于smv很易接觸傳染，所以無(wú)論發(fā)病與否，都可能成為田間再侵染的毒源。攜毒蚜蟲(chóng)也是smv自然傳播的另一個(gè)重要因素，能造成病毒再次傳播，具有非持久性特征。smv是一種在世界性廣泛分布并極具破壞性的一種的病毒。受害植株豆莢數(shù)量減少，百粒重降低，褐斑粒增多。常年減產(chǎn)5％－7％，重病年減產(chǎn)10％－25％，個(gè)別年份或少數(shù)地區(qū)可達(dá)95％，甚至絕收；并且病株豆粒蛋白質(zhì)含量及油含量減少，影響種子商品價(jià)值，每年都會(huì)給很多國(guó)家?guī)?lái)巨大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。由于該病害在世界范圍內(nèi)廣泛分布并普遍發(fā)生，導(dǎo)致大豆嚴(yán)重減產(chǎn)和種質(zhì)衰退，所以建立smv病毒病害的快速準(zhǔn)確的篩查方法對(duì)于該病害的準(zhǔn)確診斷及把握該病害的流行規(guī)律和提出有效防治措施非常重要。目前大豆花葉病毒病的檢測(cè)主要包括生物學(xué)鑒定、電鏡鑒定和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(rt-pcr)。生物學(xué)鑒定周期長(zhǎng)，電鏡鑒定對(duì)樣本的制備比較繁瑣且需要昂貴的電子顯微鏡，而rt-pcr技術(shù)需要熱循環(huán)設(shè)備。rpa(recombinasepolymeraseamplifcation)是一項(xiàng)新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其主要原理為利用重組酶和引物在模板dna上搜索到與之完全互補(bǔ)配對(duì)的序列時(shí)，在單鏈dna結(jié)合蛋白的幫組下使模板dna解鏈，引物與模板dna開(kāi)始配對(duì)，并在dna聚合酶的作用下復(fù)制延伸。該方法僅需1對(duì)引物即可完成擴(kuò)增，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)過(guò)程；只需要37℃下恒溫反應(yīng)，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；反應(yīng)時(shí)間短；擴(kuò)增產(chǎn)物有特定大小的條帶，結(jié)果易于判斷。而rpa與擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(internalamplificationcontrol,iac)的結(jié)合使用則會(huì)有效控制假陰性的出現(xiàn)，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免了漏檢，能夠更有效的篩查防控該病毒的發(fā)生危害。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和快速的基于rpa-iac技術(shù)的篩查大豆花葉病毒的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、篩查時(shí)間短、質(zhì)控效果佳、不需要特殊的儀器和適用范圍廣的rpa-iac引物和內(nèi)標(biāo)及含有該rpa-iac引物和內(nèi)標(biāo)的試劑盒。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明第一方面提供了一種引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列，所述引物對(duì)包含seqidno-：1所示的核苷酸序列和seqidno：2所示的核苷酸序列，所述內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列包含seqidno：3所示的核苷酸序列。本發(fā)明第二方面提供了所述的引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列在制備篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。在一優(yōu)選例中，所述制備篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的產(chǎn)品包括：制備篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒的產(chǎn)品，以及制備篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒的產(chǎn)品。本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物對(duì)和包含有上述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒。在一優(yōu)選例中，還包括rpa-iac恒溫?cái)U(kuò)增試劑。在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac恒溫?cái)U(kuò)增試劑包括來(lái)自twistdx公司的rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits所包含的試劑。在一優(yōu)選例中，還包括植物總rna提取試劑。在一優(yōu)選例中，所述植物總rna提取試劑包括來(lái)自天根生物科技有限公司貨號(hào)為dp432的植物總rna提取試劑盒所包含的試劑。在一優(yōu)選例中，還包括反轉(zhuǎn)錄試劑。在一優(yōu)選例中，所述反轉(zhuǎn)錄試劑包括來(lái)自takara的貨號(hào)為rr014a的primescriptrt-pcrkit所包含的試劑。本發(fā)明第四方面提供了一種試劑盒在篩查或輔助篩查大豆花葉病毒，或制備篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用；在一優(yōu)選例中，所述篩查或輔助篩查大豆花葉病毒包括：篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒，以及篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒；在一優(yōu)選例中，所述制備篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的產(chǎn)品包括：制備篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒的產(chǎn)品，以及制備篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒的產(chǎn)品。本發(fā)明第五方面提供了一種篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的方法，包括使用所述的引物對(duì)和包含有上述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，或所述試劑盒的步驟。在一優(yōu)選例中，所述篩查或輔助篩查大豆花葉病毒包括：篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒；以及篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒。在一優(yōu)選例中，所述的方法包括如下步驟：1)rpa-iac擴(kuò)增從待測(cè)植物樣品或待測(cè)病毒中提取總rna，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，再以cdna為模板與所述的引物對(duì)和包含有上述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，或所述試劑盒進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增。2)根據(jù)rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒，或待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒。在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有大小為154bp的目標(biāo)基因片段，或同時(shí)擁有大小分別為338bp、154bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為待測(cè)植物樣品感染大豆花葉病毒或待測(cè)病毒為或候選為大豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物只有大小為338bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，未含有大小為154bp的目標(biāo)基因片段，則判定為待測(cè)植物樣品未感染大豆花葉病毒或待測(cè)病毒不為或候選不為大豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物未含有大小為338bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，同時(shí)也未含有大小為154bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)為假陰性，需要重新進(jìn)行篩查。在一優(yōu)選例中，步驟1)中從待測(cè)植物樣品中提取總rna是采用天根生物科技有限公司貨號(hào)為dp432的植物總rna提取試劑盒進(jìn)行的；步驟1)中將總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna是采用takara的貨號(hào)為rr014a的primescriptrt-pcrkit進(jìn)行的。在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管再水化緩沖液29.5μlseqidno：1所示的引物和seqidno：2所示的引物各2μl，引物的終濃度均為0.4μmol/l在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：所述rpa-iac擴(kuò)增的溫度為37℃，時(shí)間為40min。本發(fā)明提到的待測(cè)植物樣品，可為植物的根﹑莖﹑葉等部分的成長(zhǎng)的植物體；而待測(cè)病毒則是一種純病毒或至少二種以上的病毒的混合。本發(fā)明涉及的“內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段”是添加到pcr反應(yīng)體系中用以指示假陰性現(xiàn)象的一段人工構(gòu)建dna序列或者是一段致病菌的保守基因序列。擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)作用的主要原理是：將擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加到pcr反應(yīng)體系中，使之與目的基因進(jìn)行共同擴(kuò)增，如果在反應(yīng)體系中存在一些抑制因素，則擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)和目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)都將受到抑制，從而達(dá)到指示pcr反應(yīng)假陰性的目的。本發(fā)明的有益效果包括：(1)本發(fā)明針對(duì)大豆花葉病毒設(shè)計(jì)特異性rpa-iac引物，建立了大豆花葉病毒rpa-iac篩查方法，可對(duì)大豆花葉病毒進(jìn)行定性篩查。(2)本發(fā)明涉及的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列與大豆花葉病毒基因組非同源，可在確保目標(biāo)序列擴(kuò)增效率的同時(shí)有效規(guī)避篩查假陰性的發(fā)生。(3)本發(fā)明針對(duì)大豆花葉病毒僅用一對(duì)引物即可完成擴(kuò)增，省去了lamp等其它恒溫?cái)U(kuò)增方法需要的多對(duì)引物的復(fù)雜設(shè)計(jì)過(guò)程；本發(fā)明的引物擴(kuò)增只需要37℃下恒溫反應(yīng)即可，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；反應(yīng)時(shí)間僅需40min，篩查時(shí)間短；不像lamp產(chǎn)物的彌散帶，rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)具有特定大小的條帶，其結(jié)果易于判斷。(4)本發(fā)明的rpa-iac擴(kuò)增引物特異性好、靈敏度高且適用范圍廣。(5)本發(fā)明建立的大豆花葉病毒rpa-iac篩查方法，靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和快速，對(duì)進(jìn)出境相關(guān)植物及產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫具有指導(dǎo)意義。附圖說(shuō)明圖1是采用本發(fā)明的rpa-iac引物對(duì)多種病毒進(jìn)行特異性篩查的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有八條泳道：其中m為markerdl1000，1為大豆花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，2為南方菜豆花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，3為菜豆莢斑駁病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，4為南芥菜花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，5為煙草環(huán)斑病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對(duì)照。圖2是采用本發(fā)明的rpa-iac引物對(duì)大豆花葉病毒進(jìn)行靈敏度篩查的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有九條泳道：其中m為markerdl500，1-7分別為大豆花葉病毒cdna的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，8為陰性對(duì)照。具體實(shí)施方式：除非特殊說(shuō)明，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。下面參考具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了一種rpa-iac引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列及其應(yīng)用。rpa-iac引物的篩選方法為：針對(duì)大豆花葉病毒外殼蛋白基因(genbank登錄號(hào)u25673.1)的保守序列，設(shè)計(jì)篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的rpa-iac引物，設(shè)計(jì)了多條rpa-iac引物后進(jìn)行了大量的篩選實(shí)驗(yàn)，綜合其特異性、靈敏度和所使用的各引物與rpa-iac擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、靈敏度高且適用范圍廣的一對(duì)rpa-iac引物。此rpa-iac引物具體序列如下：上游引物：5′-aagatgaatcttccaatggttgaagggaagatc-3′(seqidno：1)；下游引物：5′-caagctcatattcatctttaactgcattgtacc-3′(seqidno：2)。內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的設(shè)計(jì)和合成：為避免相近病原物的同源干擾和篩查人員的個(gè)體核酸污染，經(jīng)過(guò)綜合分析考量和反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以高度保守的豬種屬特異性基因β-actin的部分核酸序列為基礎(chǔ)，兩端分別連接上述的上游引物的序列和下游引物的序列，形成如下所示序列大小為338bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列：aagatgaatcttccaatggttgaagggaagatcgttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacatcaaggggtacaatgcagttaaagatgaatatgagcttg(seqidno：3)上述seqidno：3中，大寫(xiě)序列為添加的上述上游引物的原始序列和下游引物的反向互補(bǔ)序列，小寫(xiě)序列272bp來(lái)源于genbank登錄號(hào)為dq452569.1且標(biāo)題為susscrofabetaactin(actb)gene,partialcds中489-760的一段序列，并經(jīng)過(guò)理論和實(shí)踐的同源性驗(yàn)證。上述rpa-iac引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的合成工作，均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。上述rpa-iac引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列可應(yīng)用到制備篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的產(chǎn)品上，例如制備篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒的產(chǎn)品，或制備篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒的產(chǎn)品。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：(1)植物總rna提取試劑；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；(3)seqidno：1、seqidno：2(均來(lái)自實(shí)施例1)，以及含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒；(4)含凍干酶粉管；(5)再水化緩沖液；(6)醋酸鎂溶液。所述植物總rna提取試劑為來(lái)自天根生物科技有限公司植物總rna提取試劑盒(貨號(hào):dp432)的試劑；所述反轉(zhuǎn)錄試劑為來(lái)自takara公司primescriptrt-pcrkit(貨號(hào):rr014a)的試劑。上述含凍干酶粉管、再水化緩沖液(rehydrationbuffer)和醋酸鎂溶液(280mmol/l)均來(lái)源于rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits(twistdx公司，貨號(hào):tabas03kit)。所述含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的構(gòu)建：將實(shí)施例1合成的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列連接到通用載體puc57上，得到含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的陽(yáng)性質(zhì)粒。具體為：采用常規(guī)t4噬菌體dna連接酶連接到通用載體puc57，并制備成陽(yáng)性質(zhì)粒凍干粉。在本發(fā)明中此構(gòu)建是由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。按照拷貝數(shù)ncopies/μl＝pcr片段的質(zhì)量(g/μl)/(650g/mol×堿基數(shù))×(6.02×1023)計(jì)算，將陽(yáng)性質(zhì)粒干粉稀釋至1.83×103copies/μl。利用seqidno：1、seqidno：2和上述含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒針對(duì)大豆花葉病毒進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，得到的rpa-iac目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的大小分別為154bp、338bp。實(shí)驗(yàn)證明，上述植物總rna提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑與rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits，以及其與seqidno：1、seqidno：2和含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)在特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高以及質(zhì)控效果佳。上述試劑盒可應(yīng)用于篩查或輔助篩查大豆花葉病毒上，例如篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒，或篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒；還可以用來(lái)制備篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的產(chǎn)品，例如制備篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒的產(chǎn)品，或制備篩查或輔助篩查待測(cè)病毒是否為或候選為大豆花葉病毒的產(chǎn)品。實(shí)施例3本實(shí)施例提供了一種篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的方法，例如篩查或輔助篩查待測(cè)植物樣品是否感染大豆花葉病毒，該方法使用了實(shí)施例1的rpa-iac引物和含有上述內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，或?qū)嵤├?的試劑盒。上述方法包括如下步驟：1、rna的提取及cdna的合成采用天根生物科技有限公司的貨號(hào)為dp432的植物總rna提取試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)提取待測(cè)植物樣品的總rna；并采用takara的貨號(hào)為rr014a的primescriptrt-pcrkit，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)將前述提取的總rna作為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，將獲得的cdna保存于-20℃?zhèn)溆谩?、rpa-iac擴(kuò)增以cdna為模板，添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，采用實(shí)施例1的上游引物和下游引物(序列分別為seqidno：1和seqidno：2)進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(模板為超純水)。rpa-iac擴(kuò)增體系(50μl)的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl、上游引物和下游引物(實(shí)施例1的上游引物和下游引物)各2μl(引物的終濃度均為0.4μmol/l)，含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1μl(1.83×103copies)(來(lái)自實(shí)施例2)，模板cdna50ng，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)，用去離子水補(bǔ)足至50μl。rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)條件：將上述rpa-iac擴(kuò)增體系充分混勻，置于37℃的金屬浴上反應(yīng)40min，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物。3、rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)rpa-iac反應(yīng)結(jié)束后，向上述rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻后12000rpm離心2min，取5μl上清液于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并對(duì)rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(在建立方法過(guò)程中均進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，本文不再贅述)。所述rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有大小為154bp的目標(biāo)基因片段，或同時(shí)擁有大小分別為338bp、154bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為待測(cè)植物樣品感染大豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物只有大小為338bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，未含有大小為154bp的目標(biāo)基因片段，則判定為待測(cè)植物樣品未感染大豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物未含有大小為338bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，同時(shí)也未含有大小為154bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)為假陰性，需要重新進(jìn)行篩查。實(shí)施例4本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例3建立的篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的方法進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。步驟一：rna的提取及cdna的合成采用天根生物科技有限公司的貨號(hào)為dp432的植物總rna提取試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)提取感染大豆花葉病毒的大豆葉片(保存于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)的rna；并采用takara的貨號(hào)為rr014a的primescriptrt-pcrkit，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)將前述提取的rna作為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，將獲得的cdna保存于-20℃?zhèn)溆?。步驟二：rpa-iac擴(kuò)增以步驟一獲得的cdna為模板，添加含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，采用實(shí)施例1的上游引物和下游引物進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(模板為超純水))。rpa-iac擴(kuò)增體系(50μl)的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl、上游引物和下游引物(實(shí)施例1的上游引物和下游引物)各2μl(引物的終濃度均為0.4μmol/l)，含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1μl(1.83×103copies)(來(lái)自實(shí)施例2)，模板cdna50ng，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)，用去離子水補(bǔ)足至50μl。rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)條件：將上述rpa-iac擴(kuò)增體系充分混勻，置于37℃的金屬浴上反應(yīng)40min，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟三：rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)rpa-iac反應(yīng)結(jié)束后，向rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻后12000rpm離心2min，取上清液5μl于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并對(duì)rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示大豆花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物含有1條大小為154bp的條帶和1條大小為338bp的條帶，而陰性對(duì)照僅在338bp處有擴(kuò)增條帶，說(shuō)明本發(fā)明的基于rpa-iac引物及rpa-iac試劑盒建立的篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的方法可以有效篩查大豆花葉病毒。實(shí)施例5本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的rpa-iac引物進(jìn)行了特異性驗(yàn)證，所用的供試材料如下：大豆花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、菜豆莢斑駁病毒、南芥菜花葉病毒和煙草環(huán)斑病毒共5種病毒感染的大豆葉片，5種病毒如表1所示，編號(hào)依次為1、2、3、4、5。上述供試材料均保存于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，并設(shè)陰性對(duì)照(模板為超純水)。表1供試病毒序號(hào)病毒名稱英文名縮寫(xiě)1大豆花葉病毒soybeanmosaicvirussmv2南方菜豆花葉病毒southernbeanmosaicvirussbmv3菜豆莢斑駁病毒beanpodmottlevirusbpmv4南芥菜花葉病毒arabismosaicvirusarmv5煙草環(huán)斑病毒tobaccoringspotvirustrsv采用天根生物科技有限公司的貨號(hào)為dp432的植物總rna提取試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)分別提取上述5種病毒感染的大豆葉片的rna；并采用takara的貨號(hào)為rr014a的primescriptrt-pcrkit，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)將前述提取的rna作為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。以cdna為模板，進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)，rpa-iac擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)的方法同實(shí)施例4的步驟二和步驟三。結(jié)果分析：結(jié)果如圖1所示，組1-組5分別對(duì)應(yīng)泳道1-5，陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)泳道6，泳道1顯示在338bp和154bp處均有擴(kuò)增條帶，根據(jù)實(shí)施例3的判斷標(biāo)準(zhǔn)，為陽(yáng)性，即順利篩查到大豆花葉病毒，其余泳道2-泳道6顯示只有在338bp處有擴(kuò)增條帶，根據(jù)實(shí)施例3的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷為未感染大豆花葉病毒，且排除了假陰性可能性，進(jìn)一步提高了結(jié)果的可靠性。綜上，上述陽(yáng)性判定和陰性判定結(jié)果均準(zhǔn)確且所有組的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)均成功擴(kuò)增，由此證明本發(fā)明實(shí)施例1的引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列具有有效性、高特異性和良好指示性；進(jìn)一步的，本發(fā)明基于引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列及試劑盒建立的篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的方法能夠準(zhǔn)確的對(duì)大豆花葉病毒進(jìn)行篩查。實(shí)施例6本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的rpa-iac引物進(jìn)行了靈敏度的驗(yàn)證，其方法如下：步驟一：cdna的獲取參照實(shí)施例5的方法對(duì)感染大豆花葉病毒的大豆葉片(保存于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)提取rna并反轉(zhuǎn)錄獲取cdna(濃度為50ng/μl)，并將獲取的cdna進(jìn)行梯度稀釋，分別得到稀釋度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的大豆花葉病毒的cdna。步驟二：rpa-iac擴(kuò)增分別以上述步驟一得到的稀釋度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的大豆花葉病毒的cdna為模板(模板量均取1μl)進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)，并設(shè)陰性對(duì)照(模板為超純水)。rpa-iac擴(kuò)增的方法同實(shí)施例4的步驟二。步驟三：電泳檢測(cè)rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，分別向rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻，12000rpm離心2min，取5μl上清液于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。rpa-iac電泳結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，本發(fā)明的rpa-iac方法的靈敏度為10-2稀釋度。組1-3均在154bp處有條帶且組2-8在338bp處有條帶，這說(shuō)明組1-8的結(jié)果均有效且組4-組8無(wú)假陰性可能性，同時(shí)也說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1的引物對(duì)具有較高的靈敏度，可篩查出樣品中僅含有0.5ng的微量dna；而后進(jìn)行對(duì)應(yīng)的rpa擴(kuò)增(擴(kuò)增體系里不添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，其余條件相同)，其靈敏度結(jié)果同rpa-iac擴(kuò)增，由此可知添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)并沒(méi)有降低篩查的靈敏度。對(duì)比例1實(shí)際上，在尋求到本發(fā)明的引物對(duì)之前，嘗試了本發(fā)明的包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒(來(lái)自實(shí)施例2)與非常多的引物對(duì)組合，在本對(duì)比例中只摘取其中之若干進(jìn)行闡述，其余不予贅述，具體為：利用實(shí)施例1的rpa-iac引物對(duì)以及用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)并選取其中排分靠前的rpa-iac引物組合1-6，用實(shí)施例3建立的篩查或輔助篩查大豆花葉病毒的方法對(duì)50份大豆樣品進(jìn)行了篩查，同時(shí)用引用較多的文獻(xiàn)“沈建國(guó),高芳鑾,蔡偉,金晶,廖富榮,吳祖建.進(jìn)境大豆種子上菜豆莢斑駁病毒和大豆花葉病毒的多重rt-pcr檢測(cè)[j/ol].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,49(04):667-676”報(bào)道的方法對(duì)這50份大豆樣品進(jìn)行了大豆花葉病毒的篩查，靈敏度試驗(yàn)的取樣和模板濃度梯度的設(shè)置均按照實(shí)施例6進(jìn)行，篩查結(jié)果如表2所示。表2不同引物對(duì)篩查樣品中大豆花葉病毒的結(jié)果引物對(duì)檢出率(陽(yáng)性數(shù)/樣品數(shù))(重復(fù)三次)靈敏度(按實(shí)施例6的稀釋度計(jì))引物對(duì)18/50；8/50；8/5010-1引物對(duì)29/50；7/50；8/5010-2引物對(duì)39/50；9/50；9/5010-1引物對(duì)48/50；8/50；8/5010-2引物對(duì)59/50；8/50；9/5010-1引物對(duì)67/50；7/50；7/5010-1本發(fā)明引物對(duì)9/50；9/50；9/5010-2文獻(xiàn)9/50；9/50；9/5010-2結(jié)果顯示：鑒于存在包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的情況下本發(fā)明引物對(duì)的篩查結(jié)果與文獻(xiàn)篩查方法的篩查結(jié)果一致，說(shuō)明了本發(fā)明引物對(duì)組合特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性很好，而采用引物設(shè)計(jì)軟件隨機(jī)選取的若干種rpa-iac引物對(duì)則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高、重復(fù)性不好以及干擾擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)等各種缺陷。對(duì)比例2本對(duì)比例提供了不同的試劑與本發(fā)明的引物對(duì)(來(lái)自實(shí)施例1)、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒(來(lái)自實(shí)施例2)組合在一起篩查大豆花葉病毒時(shí)的篩查結(jié)果對(duì)比。各種試劑與本發(fā)明的引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒組合:組合1：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售植物總rna提取試劑盒1+某市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒1+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒1組合2：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售植物總rna提取試劑盒2+某市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒2+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒2組合3：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售植物總rna提取試劑盒3+某市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒3+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒3本發(fā)明組合：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+來(lái)自天根生物科技有限公司貨號(hào)為dp432的植物總rna提取試劑盒所包含的試劑+來(lái)自takara的貨號(hào)為rr014a的primescriptrt-pcrkit所包含的試劑+來(lái)自twistdx公司的rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits所包含的試劑。利用上述本發(fā)明組合篩查大豆花葉病毒時(shí)，其方法采用實(shí)施例3中的方法進(jìn)行。靈敏度實(shí)驗(yàn)的取樣和模板濃度稀釋梯度的設(shè)置均按照實(shí)施例6進(jìn)行。利用上述組合1、組合2和組合3篩查大豆花葉病毒時(shí)，凡是用到市售試劑盒，均按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作進(jìn)行，其余條件均同本發(fā)明組合。同時(shí)設(shè)文獻(xiàn)方法檢測(cè)，文獻(xiàn)見(jiàn)對(duì)比例1。受檢樣品同對(duì)比例1中的50份大豆樣品。篩查結(jié)果如表3所示。表3不同試劑組合篩查樣品中大豆花葉病毒的結(jié)果組合檢出率(陽(yáng)性數(shù)/樣品數(shù))(重復(fù)三次)靈敏度(按實(shí)施例6的稀釋度計(jì))組合110/50；9/50；9/5010-3組合28/50；9/50；8/5010-2組合38/50；8/50；8/5010-3本發(fā)明組合9/50；9/50；9/5010-3文獻(xiàn)9/50；9/50；9/5010-3結(jié)果顯示：本發(fā)明引物對(duì)、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒和各特定試劑的組合的篩查結(jié)果與文獻(xiàn)篩查方法的篩查結(jié)果一致，這說(shuō)明本發(fā)明引物對(duì)、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒和各特定試劑的組合所組成的試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，而在存在包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的情況下采用本發(fā)明引物對(duì)與其它隨機(jī)選取的若干試劑的組合則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高和重復(fù)性不好的各種缺陷。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。sequencelisting<110>中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院<120>基于rpa-iac技術(shù)篩查大豆花葉病毒的方法、rpa-iac引物及試劑盒<130>17cn<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>33<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno：1<400>1aagatgaatcttccaatggttgaagggaagatc33<210>2<211>33<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno：2<400>2caagctcatattcatctttaactgcattgtacc33<210>3<211>338<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno：3<400>3aagatgaatcttccaatggttgaagggaagatcgttcgagaccttcaacaccccagccat60gtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgt120gatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgcc180ccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagat240cctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacat300caaggggtacaatgcagttaaagatgaatatgagcttg338當(dāng)前第1頁(yè)12