一種同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及化學(xué)物質(zhì)的高效液相色譜法，特別涉及一種 同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 山楂為薔薇科植物山里紅（Crateguspinnatif idaBge · var ·ma jorN·E · Br ·)或山楂 (CrateguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果實(shí)。味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng);具有消食 健胃、行氣散瘀、化濁降脂的功效，用于肉食積滯、胃脘脹滿(mǎn)、瀉痢腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀 阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛、高脂血癥（國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一 部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:29-30)。山楂中主要含有黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)化學(xué) 成分，其中黃酮類(lèi)化合物含量較高，包括牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、槲皮素、蘆丁 等?，F(xiàn)代藥理活性研究表明山楂中黃酮類(lèi)成分具有降壓、降血脂、治療高脂血癥急性壞死性 胰腺炎以及抗氧化的作用，并且廣泛應(yīng)用于臨床(李敏，霍燕燕，劉梅，等.山楂總黃酮提取 及其抗氧化作用[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2013，30(6) :3145-3148)。臨床研究驗(yàn)證山楂黃酮提取物 具有抗癌作用(柳嘉，DavidGlenPOPOVICH，景浩.山楂黃酮提取物的抗氧化活性和對(duì)癌細(xì)胞 生長(zhǎng)抑制作用[J].食品科學(xué)，2010,31(3) :220-223)，對(duì)預(yù)防心肌缺血也有較好作用(周玲， 鄧琳，趙浞.山楂總黃酮抗心肌缺血作用及機(jī)制[J].中國(guó)生化藥物雜志，2011，32(6):475-477)。
[0003] 鑒于山楂中蘆丁和槲皮素的藥用范圍非常廣泛，為了有效地評(píng)價(jià)山楂及其相應(yīng)制 劑的質(zhì)量，有必要研究并開(kāi)發(fā)一種同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究并摸索，最終建立了一種可同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲 皮素含量的高效液相色譜法，該法測(cè)定快速、簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的 空白。
[0005] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。具 體地，本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，采用高效液相色譜法，以流動(dòng)相A 和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，按體積比計(jì)流動(dòng)相的梯度設(shè)置如下：
L0008J 所述的流動(dòng)相A為甲醇，所述的流動(dòng)相B為磷酸水浴液，所述的磷酸水浴液的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為0.4%~0.8%。
[0009]進(jìn)一步地優(yōu)選地，如上所述同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，按體積比 計(jì)流動(dòng)相的梯度設(shè)置如下：
L0011J 所述的磷酸水浴液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 5%。
[0012] 進(jìn)一步地優(yōu)選地，如上所述同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的色譜柱選用AgiLentEcLipseXDB_C18柱(250mm X 4.6mm，5μηι)。
[0013] 進(jìn)一步地優(yōu)選地，如上所述同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為330-350nm。
[0014] 進(jìn)一步地優(yōu)選地，如上所述同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm。
[0015] 進(jìn)一步地優(yōu)選地，如上所述同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的的流速為1. OmL/min，柱溫為30°C。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例中，如上所述同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量 的方法，其中所述高效液相色譜法的色譜柱選用AgiLentEcLipseXDB-C18柱（250mmX 4.6mm，5μηι)，檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm，流速為1. OmL/min，柱溫為30°C，按體積比計(jì)流動(dòng)相的梯度 設(shè)置如下：
[0018] 所述的流動(dòng)相A為甲醇，所述的流動(dòng)相B為0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷酸水溶液。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定山楂中 蘆丁和槲皮素的含量，為山楂飲片及其相關(guān)制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和含量檢測(cè)提供了快速、準(zhǔn)確 的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明涉及的檢測(cè)方法作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將 此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù) 均屬于本發(fā)明的范圍。
[0021] 山楂飲片主要含有黃酮及其苷類(lèi)成分，本文選擇黃酮類(lèi)活性成分蘆丁和槲皮素進(jìn) 行試驗(yàn)，建立用HPLC同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。采用甲醇-0.5%磷酸水溶 液梯度洗脫，出峰較快，精密度、準(zhǔn)確度及重復(fù)性均良好，為山楂中蘆丁和槲皮素的質(zhì)量評(píng) 價(jià)提供了 一個(gè)可行方法。具體實(shí)施如下：
[0022] (1)蘆丁對(duì)照品溶液的制備
[0023]稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品6. Omg，精密稱(chēng)定6 . lmg，置2mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻 度，搖勻，即得每lmL含3.05mg的蘆丁對(duì)照品溶液。
[0024] (2)槲皮素對(duì)照品溶液的制備
[0025]稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品5 . Omg，精密稱(chēng)定4.8mg，置2mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 刻度，搖勻，即得每lmL含2.4mg的槲皮素對(duì)照品溶液。
[0026] (3)混合對(duì)照品溶液的制備
[0027] 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液lmL、槲皮素對(duì)照品溶液lmL于10mL容量瓶中，用甲醇溶 液稀釋至刻度，即得2種組分的混合對(duì)照品溶液(含蘆丁濃度為305yg/mL，槲皮素濃度為240 yg/mL)，5°C冷藏保存?zhèn)溆谩?br>[0028] (4)供試品溶液的制備
[0029]取山楂粗粉（過(guò)3號(hào)篩）約2. Og，置于錐形瓶中，加入50mL甲醇，稱(chēng)重。超聲提取 40min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液，0.45μπι微孔濾膜 過(guò)濾，即得供試品溶液。
[0030] (5)色譜條件
[0031 ]色譜柱為AgiLentEcLipseXDB-C18柱（250mmX4·6mm，5μm);流動(dòng)相:A相為甲醇， Β相為0.5 %磷酸水溶液，洗脫梯度:0~15min，甲醇-0.5 %磷酸水(20:80); 16~25min甲醇-0 · 5%磷酸水(40:60);檢測(cè)波長(zhǎng):340nm;流速1 · Oml/min;柱溫:30°C;進(jìn)樣量:20yL。
[0032]以供試品溶液為樣品，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，取20yL進(jìn)樣，結(jié)果蘆丁在 5.2min時(shí)達(dá)到最大洗脫峰，槲皮素在15.6min時(shí)達(dá)到最大洗脫峰，出峰時(shí)間在25min內(nèi)，且兩 峰出峰時(shí)間分布均勻，分離度好。
[0033] (6)線(xiàn)性關(guān)系考察
[0034] 精密吸取混合對(duì)照品溶液0 · 1、0 · 2、0 · 4、0 · 6、0 · 8、1 · OmL，分別置于20mL容量瓶中 以甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對(duì)照品溶液，按照步驟(5)的色譜條件進(jìn)行分析， 分別取20yL進(jìn)樣，記錄蘆丁和槲皮素的色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。以對(duì)照品溶液濃度(X)為橫 坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0035] 表1線(xiàn)性關(guān)系考察試驗(yàn)
[0036]
[0037] 表2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性范圍
[0038]
[0039] (7)精密度試驗(yàn)
[0040] 精密吸取混合對(duì)照品溶液20yL，按步驟(5)的色譜條件平行測(cè)定6次，測(cè)得蘆丁和 槲皮素的峰面積，見(jiàn)表3，結(jié)果表明，儀器進(jìn)樣精密度良好。
[0041] 表3精密度試驗(yàn)(n = 6)
[0042]
[0043] (8)重復(fù)性試驗(yàn)
[0044] 精密稱(chēng)取同一批次的供試品6份，分別按上述步驟(4)供試品溶液制備方法制備， 測(cè)定蘆丁和槲皮素的峰面積，見(jiàn)表4,結(jié)果證明，此方法重復(fù)性良好。
[0045] 表4重復(fù)性試驗(yàn)(n = 6)
[0046]
[0047] (9)穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0048]精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、121!進(jìn)樣測(cè)定峰面積。測(cè)得蘆丁和槲 皮素的峰面積，見(jiàn)表5,結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下12h內(nèi)穩(wěn)定。
[0049] 表5穩(wěn)定性試驗(yàn)(n = 6)
[0050]
[0051] (10)加樣回收率試驗(yàn)
[0052]分別精密稱(chēng)定已知含量的山楂飲片粉末（含蘆丁 0.139mg/g，槲皮素0.078mg/g) (過(guò)3號(hào)篩)6份，各加入適量的對(duì)照品，按步驟(4)方法制備供試品溶液，按步驟(5)的色譜條 件分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表6、表7。
[0053] 表6蘆丁加樣回收率試驗(yàn)(n = 6)
[0054]
[0055] 表7槲皮素加樣回收率試驗(yàn)(η = 6)
[0056]
[0057] (11)樣品含量測(cè)定
[0058]精密稱(chēng)取山楂飲片樣品6批，按步驟(4)方法制備供試品溶液，按照步驟(5)的色譜 條件進(jìn)行測(cè)定。記錄蘆丁和槲皮素的色譜峰面積，根據(jù)峰面積積分值，采用外標(biāo)法計(jì)算出各 組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表8。
[0059] 表8山楂飲片中蘆丁和槲皮素的含量測(cè)定(η = 6)
[0060]
[0061]
[0062]需要說(shuō)明的是，本發(fā)明在前期的試驗(yàn)中考察流動(dòng)相系統(tǒng)及比例（甲醇-水、甲醇-0.5 %磷酸水、甲醇-0.1 %磷酸水系統(tǒng)），結(jié)果表明甲醇-水(30:70)、甲醇-0.1 %磷酸水(40: 60)等度洗脫效果均不好，出峰時(shí)間均大于30min。另外，流動(dòng)相梯度的選擇試驗(yàn)中，發(fā)明人 曾考察了0~2011^11甲醇-0.5%磷酸水（25:75)，20~3011^11甲醇-0.5%磷酸水（30:70) ;0-20min甲醇-0.5%磷酸水（22:78)，20~3011^11甲醇-磷酸水（35:65);0-1511^11甲醇-0.5%磷 酸水(20:80)，15-25min甲醇-0.5 %磷酸水(40:60);結(jié)果表明以甲醇-0.5 %磷酸水進(jìn)行梯 度洗脫，0~15min，甲醇-0 · 5 %磷酸水(20:80); 16~25min甲醇-0 · 5 %磷酸水(40:60)，在流 速1 .OmL/min的情況下，梯度洗脫，出峰時(shí)間在25min內(nèi)，且兩峰出峰時(shí)間分布均勻，分離度 好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同時(shí)測(cè)定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，采用高效液相色譜法， W流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，按體積比計(jì)流動(dòng)相的梯度設(shè)置如下：'^所述的流動(dòng)相為甲醇，所述的流動(dòng)相B為憐酸水溶液，所述的憐酸水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 0.4% ~0.8%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，按體積 比計(jì)流動(dòng)相的梯度設(shè)置如下：所述的憐酸水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的色譜柱選用AgiLent EcLipse XDB-C18柱(250mmX4.6mm，5皿）。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為330-350nm。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述同時(shí)測(cè)定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的的流速為1. OmL/min，柱溫為30°C。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，采用高效液相色譜法，以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，所述的流動(dòng)相A為甲醇，所述的流動(dòng)相B為磷酸水溶液，所述的磷酸水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4％～0.8％。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定山楂中蘆丁和槲皮素的含量，為山楂飲片及其相關(guān)制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和含量檢測(cè)提供了快速、準(zhǔn)確的方法。
【IPC分類(lèi)】G01N30/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105548380
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510902345
【發(fā)明人】段占娥, 趙雪梅
【申請(qǐng)人】段占娥
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月8日