一種提高膠乳試劑靈敏度和線性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種混合大小粒徑膠乳同時(shí)提高膠乳試劑靈 敏度和線性的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] C反應(yīng)蛋白（CRP)是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，機(jī)體受微生物入侵或組織損傷等炎癥 性刺激后幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生由肝細(xì)胞合成，分子量為115-140KD、半壽期為19天的血清β球蛋白； 在人的血清、腦脊液、胸腹水等多種體液中均可測(cè)出。CRP的檢測(cè)在臨床應(yīng)用相當(dāng)廣泛，包括 急性感染性疾病的診斷和鑒別診斷，手術(shù)后感染的監(jiān)測(cè);抗生素療效的觀察;病程檢測(cè)及預(yù) 后判斷等。臨床常規(guī)測(cè)定CRP的方法可在感染或組織損傷時(shí)檢測(cè)出CRP>10mg/L的濃度，但是 因缺乏較高的靈敏性，不能很好的檢測(cè)出低濃度(0.1 -1 〇mg/L)的CRP變化，而該濃度的CRP 與新生兒的感染、心血管疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，也就是通常所說(shuō)的超敏CRP(hsCRP)。 近幾年來(lái)，隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)始出現(xiàn)了一種全量程CRP，這種CRP即能滿足較高的靈敏 度，又能滿足較高的線性，但是限于膠乳比濁技術(shù)平臺(tái)的限制，這些全量程CRP往往要么降 低敏感性獲得高線性，要么降低線性獲得高靈敏度，因此，對(duì)現(xiàn)有的膠乳比濁平臺(tái)工藝進(jìn)行 優(yōu)化和改進(jìn)，以同時(shí)滿足靈敏度和高線性就成為了一個(gè)急需解決的問(wèn)題。
[0004] 目前常用的測(cè)定CRP濃度的方法有熒光免疫層析法、膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法等。其中熒光免疫層析法、膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法雖然可以部分同 時(shí)解決靈敏度和線性問(wèn)題，但是只能做到定性或者半定量，尤其在超敏CRP濃度范圍內(nèi)，測(cè) 值準(zhǔn)確度很低;常用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)值準(zhǔn)確，但是無(wú)法兼顧高靈敏度和寬線性范 圍。
[0005] 膠乳免疫比濁法分為透射比濁法和散射比濁法。前者用于生化分析儀，后者用于 特定蛋白分析儀。生化分析儀特點(diǎn)是集中樣本檢驗(yàn)，用時(shí)長(zhǎng)，但是通量高，成本低。特定蛋白 分析儀比生化分析儀體積小巧，檢測(cè)耗時(shí)更短，數(shù)分鐘內(nèi)即可出結(jié)果，特別適用于門(mén)、急診 和床邊監(jiān)護(hù)使用，但是不能處理大批量樣本，成本高。施國(guó)民和徐斐在《C反應(yīng)蛋白快速定量 檢測(cè)試劑盒性能評(píng)價(jià)》中公開(kāi)將CRP單克隆多克隆抗體用EDC/NHS共價(jià)法與羧基化聚苯乙烯 微球結(jié)合，制備出用膠乳免疫比濁法檢測(cè)CRP的試劑。蛋白載體微球一般用人工合成的高分 子材料制成，用不同的單體聚合成的微球有不同的性能。以苯乙烯為單體通過(guò)乳液聚合制 成的直徑為〇.8μπι左右的微球是常用的微球載體，此種微球的懸液呈乳狀，有良好的懸浮性 能。然而，該試劑盒檢測(cè)限0.7 2mg /L，僅能在此值附近定性確定樣本中含有待測(cè)CRP，無(wú)法 準(zhǔn)確區(qū)分超敏CRP的臨界值lmg /L;根據(jù)文章發(fā)表的回歸方程數(shù)據(jù)，結(jié)合儀器本身的準(zhǔn)確度 計(jì)算，準(zhǔn)確測(cè)定樣本的臨界點(diǎn)將會(huì)大于lmg /L;另外該試劑僅適用于特定蛋白儀，特定蛋白 儀特點(diǎn)是單個(gè)檢驗(yàn)，用時(shí)短，但是無(wú)處理大量樣本，無(wú)法在全自動(dòng)生化分析儀上高通量檢 測(cè)，因此無(wú)法充分滿足臨床診斷的需要。
[0006] 透射比濁法用于生化分析儀，生化分析儀主要原理是運(yùn)用光譜技術(shù)中不同原子吸 光不同而測(cè)量的，那么對(duì)于ISE模塊的功能實(shí)現(xiàn)，主要有兩種方法，一是比色法，二是間接 法。比色法因其測(cè)量精度，準(zhǔn)確度等與所要求的相差太大，此法在醫(yī)學(xué)的早期實(shí)驗(yàn)室檢查中 使用，已經(jīng)是屬于淘汰的用法。間接法，其方法原理與目前市場(chǎng)上存在的其它儀器所用直接 法相似，但ACA的脆弱性所致，為防儀器內(nèi)部被堵塞，對(duì)樣品的要求極為嚴(yán)格，需經(jīng)常規(guī)分離 再經(jīng)稀釋后方可測(cè)量，而一般的生化ISE模塊對(duì)樣品的稀釋倍數(shù)又大都在30倍左右，在如此 大的稀釋倍數(shù)下，對(duì)管路確是有益，但從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理角度來(lái)看，這樣的測(cè)量，將會(huì)把誤差 同比例放大，那么這樣測(cè)到的結(jié)果，準(zhǔn)確度和精確度不能達(dá)到要求。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種混合大小粒 徑膠乳同時(shí)提高膠乳試劑靈敏度和線性的方法，具有靈敏度高，線性范圍寬，節(jié)省抗體用量 等優(yōu)點(diǎn)。
[0009] 一種提高膠乳試劑靈敏度和線性的方法，檢測(cè)試劑盒包含試劑R1和試劑R2,其特 征在于，所述膠乳試劑為混合大小粒徑膠乳的膠乳試劑，制成C反應(yīng)蛋白膠乳比濁檢測(cè)試劑 盒，該試劑盒包括試劑R1和試劑R2;所述方法包括如下步驟： 1) 將鼠待測(cè)抗原單克隆抗體定向包被到大粒徑的膠乳微球上， 2) 將兔或羊待測(cè)抗原多克隆抗體定向包被到小粒徑的膠乳微球上； 3) 然后將包被后的大粒徑膠乳和小粒徑膠乳混合。
[0010]優(yōu)選的實(shí)施方案為，所述待測(cè)抗原為C反應(yīng)蛋白； 優(yōu)選的實(shí)施方案為，所述的膠乳微球?yàn)轸然揎椀木郾揭蚁┠z乳微球； 所述的大粒徑膠乳微球的平均粒徑為200-400nm，優(yōu)選300-350; 所述小粒徑膠乳微球的平均粒徑為50-200nm，優(yōu)選50-100nm。
[con]優(yōu)選的實(shí)施方案為，所述的將抗C反應(yīng)蛋白抗體定向包被到大粒徑膠乳微球上所 用的抗體為鼠單克隆抗體，ELISA效價(jià)大于1:100000;包被到大粒徑膠乳微球上所用的抗體 為兔多克隆抗體或者羊多克隆抗體，ELISA效價(jià)大于1:50000。
[0012] 所述的將抗C反應(yīng)蛋白抗體定向包被到大粒徑膠乳或小粒徑微球上的制備步驟包 括： (1) 聚苯乙烯膠乳微球的激活:在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳微球中加入乙基二甲基胺 丙基碳化二亞胺，混合均勻，反應(yīng)結(jié)束后加入己二酸二酰肼，繼續(xù)反應(yīng)，得到激活的聚苯乙 烯膠乳微球； (2) 抗C反應(yīng)蛋白抗體的氧化：用高碘酸鈉將抗C反應(yīng)蛋白抗體Fc端糖鏈上的羥基氧化 成醛基； (3) 抗C反應(yīng)蛋白抗體與聚苯乙烯膠乳微球的偶聯(lián):將步驟（1)激活的聚苯乙烯膠乳微 球和步驟(2)氧化的抗C反應(yīng)蛋白抗體混合進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入葡萄糖封閉聚苯乙 烯膠乳微球上沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)，獲得偶聯(lián)抗C反應(yīng)蛋白抗體的聚苯乙烯膠乳微球。
[0013] 所述試劑R2的制備包括： 1 )、取大粒徑或小粒徑聚苯乙烯膠乳顆粒，用2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶液MES洗滌三次， 分散； 2) 、加入用MES溶液新鮮配制的乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺EDAC溶液，室溫反應(yīng)1小 時(shí)； 3) 、加入用的MES溶液新鮮配制的已二酸二酰肼溶液，4°C反應(yīng)過(guò)夜； 4) 、用MES溶液洗滌兩次，磷酸鹽緩沖液洗滌一次，分散備用； 5) 、分別取鼠單克隆抗體、兔或羊多克隆抗體溶液，加入磷酸鹽緩沖液配制的高碘酸鈉 溶液，室溫混合15分鐘； 6) 、將步驟5)中氧化好的抗體加入到步驟4)中激活的聚苯乙烯膠乳微球溶液中，其中 鼠單克隆抗體用來(lái)包被大粒徑膠乳微球，兔或羊多克隆抗體用來(lái)包被小粒徑微球，4°C反應(yīng) 過(guò)夜； 7) 、加入牛血清白蛋白溶液，4°C反應(yīng)2小時(shí)； 8) 、加入10%葡萄糖溶液，4°C反應(yīng)過(guò)夜； 9) 、用氯化銨緩沖液洗滌三次，加入含1.5%蔗糖，0.2%疊氮鈉的，氯化銨緩沖液至膠乳 微球終濃度為0.25%。
[0014] 10)、將制備的大粒徑膠乳微球和小粒徑膠乳微球按照1:5的體積比進(jìn)行混合，完 成試劑R2的制備。
[0015] 進(jìn)一步地， 按照質(zhì)量份數(shù)計(jì)， 步驟1)中，乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺:聚苯乙烯膠乳顆粒為0.1-1:100,優(yōu)選0.5: 100； 步驟3)中，己二酸二酰肼:聚苯乙烯膠乳顆粒為10-50:100,優(yōu)選50:100。
[0016] 步驟5)中，按照質(zhì)量份數(shù)計(jì)，高碘酸鈉：抗體為1:2,其中，抗體為鼠單克隆抗體、 兔或羊多克隆抗體。
[0017] 步驟6)中，按照質(zhì)量份數(shù)計(jì)，抗體:激活的聚苯乙烯膠乳微球?yàn)?-20:100,優(yōu)選10-15:100，步驟8)中，葡萄糖:激活的聚苯乙烯膠乳微球?yàn)?0-50:100，優(yōu)選30-40:100。
[0018] 所述的混合大小粒徑膠乳微球中，大粒徑膠乳微球:小粒徑膠乳微球質(zhì)量比為1: 3-10,優(yōu)選2-5,更優(yōu)選2-3。
[0019]所述R1的配方為：Tris 50mmol/L，鹿糖的濃度為5g/L，疊氮鈉的濃度為lg/L， PEG8000的濃度為70g/L，水蘇糖1.6-3g/L ;明礬0.6-lg/L ;果糖二磷酸鈉0.8-3g/L ;六偏 磷酸鈉 0.09-0.3g/L。
[0020]所述試劑2中，分散液中Tris-HCl緩沖液的濃度為30mM，牛血清白蛋白BSA的濃 度為5g/L，疊氮鈉的濃度為lg/L。
[0021 ] 所述試劑盒中試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。
[0022] 所述的混合大小粒徑膠乳同時(shí)提高膠乳試劑靈敏度和線性的方法，用來(lái)制備C反 應(yīng)蛋白膠乳比濁檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括試劑R