用于進(jìn)行cvd風(fēng)險評估的生物化學(xué)標(biāo)志物的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請是中國專利申請CN200880123912.0的分案申請，原申請是國際申請?zhí)朠CT/ EP2008/064946于2010年7月2日進(jìn)入中國國家階段的申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及檢測對心血管疾病診斷目的和疾病發(fā)展預(yù)后有價值的生物化學(xué)標(biāo)志 物的測定，其包括指示由發(fā)生動脈粥樣硬化和斑塊不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的心血管事件風(fēng)險的生 物化學(xué)標(biāo)志物。
【背景技術(shù)】
[0003] 心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD)是世界范圍內(nèi)致病及死亡的首要原 因。目前，尚沒有允許診斷并將患者歸類為不同風(fēng)險組以及允許診斷低風(fēng)險患者的有效且 非介入性的診斷方法。診斷和預(yù)后工具主要由簡單標(biāo)志物的多變量分析構(gòu)成，例如年齡、吸 煙情況和多種脂質(zhì)和脂蛋白的濃度。
[0004] CVD涵蓋數(shù)種臨床綜合征，主要有心絞痛、心肌梗死(冠狀動脈栓塞)和中風(fēng)。所有 這些綜合征通常都是復(fù)雜動脈粥樣硬化的后遺癥。
[0005] 動脈粥樣硬化開始于童年階段的內(nèi)膜增厚，并發(fā)展成為動脈內(nèi)膜中的脂肪條紋， 這些病變分別表征為I型和II型。脂肪條紋是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中最早的宏觀可見病 變，其在所有種族和社會的幾乎所有人類中發(fā)生。在非致病狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)對白細(xì)胞的粘附性相互作用有抗性。但是，動脈粥樣化形成過程中動脈壁中促炎 癥細(xì)胞因子以及積累的氧化脂蛋白的作用引發(fā)粘附分子的表達(dá)，例如主動脈EC表面上的細(xì) 胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM)_1和血管細(xì)胞粘附分子 (vascular cell adhesion molecule，VCAM)_1。這使得白細(xì)胞能被內(nèi)皮表面捕獲并移行進(jìn) 血管壁的內(nèi)膜部分。斑塊的發(fā)生包括發(fā)生移位和凋亡的平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell， SMC)個數(shù)的增加，其導(dǎo)致基質(zhì)周轉(zhuǎn)(turnover)增加。受損的膠原蛋白合成可導(dǎo)致纖維帽削 弱并產(chǎn)生更易于破裂的動脈粥樣硬化斑塊;但是，大多數(shù)研究者認(rèn)為，蛋白水解酶例如基質(zhì) 金屬蛋白酶(matrix metallo_protease，MMP)及其它蛋白酶的作用對斑塊破裂的風(fēng)險有重 要的貢獻(xiàn)(Clarkson和Kaplan 509-28)。
[0006] 斑塊可分為兩種不同類型："脆弱的"和"穩(wěn)定的"斑塊。但是，對于詳細(xì)的組織學(xué)分 析和對分子的認(rèn)識，經(jīng)常使用更詳細(xì)的分類。斑塊的發(fā)生有三個主要階段:起始、脂肪條紋 和復(fù)雜/晚期斑塊(Stary H.C·)。
[0007] 動脈粥樣硬化斑塊在動脈內(nèi)膜內(nèi)發(fā)生，并可根據(jù)其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類。這種分 類將病變分為8個類型(Stary H.C.):
[0008] I.內(nèi)膜中載有脂滴并被其增大的巨噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞)增多。
[0009] II.巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞與內(nèi)膜SMC內(nèi)的脂滴一起在蛋白聚糖層深部積累。泡沫 細(xì)胞層以脂肪條紋的形式可見。在II型病變中，單核細(xì)胞通過單核細(xì)胞趨化蛋白（主要是 MCP-1)穿透內(nèi)皮細(xì)胞層，所述趨化蛋白在人粥樣斑中過表達(dá)。早期病變類型（I型和II型）可 以在嬰兒期開始，但不一定導(dǎo)致斑塊破裂。此外，動脈粥樣硬化的發(fā)展可以在形成III型病 變之后結(jié)束，斑塊的形成是無法預(yù)測的（stary H. C.)。
[0010] III. Ill型病變確定為處于脂肪條紋（II型）和粥樣斑（IV型）之間的中間病變。這 些病變還含有胞外脂質(zhì)的混合物，由此使得內(nèi)膜深部肌肉彈性層中通常緊密相鄰的SMC之 間的間距擴(kuò)大。物質(zhì)混合物可取代通常位于這里的蛋白聚糖和膠原纖維，但是這在動脈粥 樣化形成的這一階段造成的影響很小。
[0011] IV.粥樣斑是動脈粥樣硬化的第一個臨床體征。細(xì)胞外脂質(zhì)混合物的積累所導(dǎo)致 的動脈內(nèi)膜中SMC的移位以及內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的破壞是IV型病變的標(biāo)志。脂質(zhì)核心的形成是這種 SMC移位的最終結(jié)果。脂質(zhì)核心的形成導(dǎo)致壁增厚加劇。脂質(zhì)核心是內(nèi)膜深處大且界限明確 的區(qū)域，在此處動脈壁這一部分的正常結(jié)構(gòu)成分已經(jīng)被致密堆積的泡沫細(xì)胞殘留物、游離 脂滴、膽固醇晶體和鈣顆粒所取代。在動脈粥樣硬化發(fā)展的這一階段，在正常情況下位于該 區(qū)域中的SMC減少或者完全失去。任何殘留的SMC開始廣泛分散，產(chǎn)生長形細(xì)胞體，并且常常 具有異常厚的基底膜。在此階段，開始形成覆蓋在脂質(zhì)核心上的層。該層由富含膠原蛋白和 蛋白聚糖的細(xì)胞間基質(zhì)、含和不含脂滴的SMC、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞組成。
[0012] V.對IV型病變的應(yīng)答是形成修復(fù)性纖維組織基質(zhì)，形成纖維"帽"。通常，這些病變 會由彼此不規(guī)則堆疊的脂質(zhì)核心和修復(fù)性組織的層組成。另外，諸如血腫和血栓形成等事 件可額外并發(fā)這些病變類型。如果不致命，則這些病變并發(fā)癥整合到病變中，其上長出修復(fù) 性基質(zhì)組織的薄層，其由膠原蛋白和蛋白聚糖組成。在形成所述帽的過程中，動脈粥樣硬化 斑塊中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原和蛋白聚糖的含量增加。
[0013] VI.內(nèi)皮的缺損例如裂隙、磨蝕、潰瘍、血腫、血栓、出血在并發(fā)情況下可導(dǎo)致更復(fù) 雜的病變類型，稱為VI型病變。
[0014] VII.該病變經(jīng)常稱為鈣化病變，其中病變中超過50 %由礦物質(zhì)組成。除了鈣化之 外，這些病變還含有豐富的修復(fù)性纖維結(jié)締組織。當(dāng)滯留于此的SMC發(fā)生凋亡和崩解時，它 們的礦化細(xì)胞器變成鈣化的一部分。
[0015] VIII.鈣化病變之后是纖維化病變。纖維化病變可完全由膠原蛋白組成，不含脂 質(zhì)。（Stary H.C.)
[0016] 心血管事件經(jīng)常是斑塊破裂的結(jié)果，其中炎癥與蛋白酶的釋放減弱了纖維帽的肩 部區(qū)域，使得斑塊中的脂肪物質(zhì)與血液相接觸，沉淀形成附壁血栓(Clarkson和Kaplan)。蛋 白酶活性增加連同基質(zhì)產(chǎn)生的減少導(dǎo)致纖維帽變薄，這被認(rèn)為是斑塊不穩(wěn)定的標(biāo)志，其增 加了破裂的風(fēng)險。斑塊的脆弱性及其破裂的風(fēng)險是臨床上關(guān)注的領(lǐng)域。脆弱斑塊 (vulnerable plaque，VP)的沒有標(biāo)準(zhǔn)定義，但是一般認(rèn)可與穩(wěn)定斑塊相比存在三種組織學(xué) 標(biāo)志：
[0017] 1)更大的脂質(zhì)核心（> 全部病變的40%)。
[0018] 2)更薄的纖維帽(65-150微米）。
[0019] 3、）大量急性炎性細(xì)胞。
[0020]定義VP的主要標(biāo)準(zhǔn)包括:活躍的炎癥(存在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞）、具有大 脂質(zhì)核心的薄帽、伴隨表面血小板凝集的內(nèi)皮剝蝕、有裂隙的斑塊以及>90%的動脈狹窄。 其它次要標(biāo)準(zhǔn)包括：表面鈣化結(jié)節(jié)、斑塊內(nèi)出血、內(nèi)皮功能障礙以及向外的重塑（Shin， Edelberg和Hong)。
[0021] 斑塊復(fù)雜性、不穩(wěn)定性和破裂可以通過醫(yī)學(xué)治療和/或生活方式的改變來抑制。但 是，在一些情況下，可能需要更為介入性的方法，即血管成形術(shù)或旁路手術(shù)。
[0022] 目前，診斷工具是基于仍處于開發(fā)之中的靜態(tài)圖象分析，或者基于低技術(shù)的方法 例如與CVD風(fēng)險相關(guān)的心臟收縮壓和舒張壓水平。該領(lǐng)域一直致力于開發(fā)可更好地鑒別高 風(fēng)險患者的多變量分析。一個這樣的模型是SCORE模型（系統(tǒng)性冠狀動脈風(fēng)險評價 (Systematic Coronary Risk Evaluation)模型）。1994年，歐洲動脈粥樣硬化學(xué)會、歐洲心 臟病學(xué)學(xué)會和歐洲高血壓學(xué)會發(fā)表了有關(guān)預(yù)防冠狀動脈心臟疾病的一組建議，并于2003年 進(jìn)行了修訂。此指南是基于幾種評價技術(shù)，其已開發(fā)用于評估無癥狀對象中的CVD風(fēng)險，即 鑒定無癥狀的高風(fēng)險患者。SCORE模型整合了性別、年齡、吸煙情況、收縮壓和總膽固醇或膽 固醇/HDL比值作為風(fēng)險因素(Graham等）。
[0023]為了作出更詳細(xì)的診斷，S⑶RE模型是不夠的，因此使用了成像技術(shù)。因此，主要對 高風(fēng)險組中的患者或者在研究期間使用成像方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 成像技術(shù)
[0025] 冠狀動脈血管造影術(shù)(Coronary angiography，CAG)是目前用于確定狹窄程度的 金標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)。CAG在兩個維度上對血管腔成像，但是其僅限于腔，而非管壁，因此CAG不 能區(qū)分有穩(wěn)定斑塊的動脈和有脆弱斑塊的動脈。CAG常用于確定患者是否需要手術(shù)、血管成 形術(shù)或旁路手術(shù)。為了確定腔狹窄位點是否是晚期斑塊，需要其它技術(shù)，即血管內(nèi)冠狀動脈 超聲（intravascular coronary ultrasound，IVUS)或血管鏡。
[0026] IVUS提供了斑塊和血管壁的二維截面圖，被認(rèn)為是適合表征血管壁以及鈣化的形 態(tài)和程度的方法，但是不適于評估病變中的脂質(zhì)。但是，IVUS是介入性的，需要專業(yè)技術(shù)和 一定的費用，因此其使用并不廣泛。血管鏡檢是另一種了解和鑒定動脈粥樣硬化的有用方 法。血管鏡直接觀察斑塊表面，并且能夠檢測斑塊顏色和血栓形成。但是，血管鏡檢是介入 性的并且在技術(shù)上十分困難，目前為止尚不能檢測斑塊延伸的程度。目前受到許多關(guān)注的 另一種成像技術(shù)是磁共振成象(MRIhMRI是非介入性的，并且能夠鑒定具有高中風(fēng)風(fēng)險的 頸動脈斑塊。另一方面，由于斑塊尺寸小和冠狀動脈的位置，MRI不是用于對冠狀動脈成像 的最佳技術(shù)。其它成像技術(shù)正在開發(fā)之中，即彈性成像術(shù)（elastography)、熱成像術(shù) (thermography)和光學(xué)相干斷層成像術(shù)(Schaar等）。
[0027] 所提到的成像技術(shù)都處于開發(fā)之中，并且均無法單獨地鑒定脆弱斑塊，但是它們 可用于了解破裂之前的分子事件和斑塊周轉(zhuǎn)。目前，在早期階段診斷CVD的唯一機(jī)會是利用 目的患者以及患者近親中產(chǎn)生冠心病、外周動脈疾病和腦血管動脈粥樣硬化疾病的一組風(fēng) 險因素。
[0028] 現(xiàn)有生物化學(xué)標(biāo)志物
[0029] 目前，已知有幾種生物化學(xué)標(biāo)志物是動脈粥樣硬化的風(fēng)險因素。最近，人們致力于 測量血清中的生物化學(xué)標(biāo)志物濃度;脂質(zhì)例如總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高 密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和炎性標(biāo)志物例如C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP)、白細(xì) 胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、腫瘤壞死因子-〇〇即€〇、〇040、0)40配體(0)40〇 等。
[0030]在脂蛋白標(biāo)志物中，有至少兩個重要的進(jìn)展。LDL顆粒的大小似乎預(yù)示了動脈粥樣 硬化發(fā)展的程度。相比于大顆粒濃度的增加，小LDL顆粒濃度的增加與CVD風(fēng)險更加相關(guān) (Gardner，F(xiàn)ortmann，and Krauss)。
[0031 ] HDL-C水平與甘油三酯強(qiáng)相關(guān)，高甘油三酯水平與CHD高風(fēng)險相關(guān)。Jeppesen等的 群體研究（2003)發(fā)現(xiàn)高TG/低HDL-C是IHD(ischemic heart disease，缺血性心臟病）最強(qiáng) 的風(fēng)險因素 (Jeppesen等）。
[0032] 脂質(zhì)譜對于風(fēng)險因素的評價來說非常重要，但是無法了解和測量與斑塊周轉(zhuǎn)相關(guān) 的分子事件。已經(jīng)有建議將許多生物化學(xué)標(biāo)志物作為CVD的風(fēng)險因素，盡管這不是該疾病的 特異性產(chǎn)物。它們包括CRP和骨鈉尿肽(Bone natriuretic peptide，BNP)(參見表1)。表1總 結(jié)了一些已知的CVD標(biāo)志物。
[0033]
[0034」

[0035]
[0036] 表1:目前CVD中生物化學(xué)標(biāo)志物的選擇
[0037] 因此，已經(jīng)提出將一組不同生物化學(xué)標(biāo)志物作為心血管事件的標(biāo)志物。W a n g等 (2006)測定了參與Framingham研究的3200位患者的10種不同生物化學(xué)標(biāo)志物，其記載于表 1。結(jié)論是，對10種生物化學(xué)標(biāo)志物的測量僅對高于標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險因素的診斷有一定貢獻(xiàn)。在10 種生物化學(xué)標(biāo)志物中，B型鈉尿肽水平、C反應(yīng)蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值顯示出標(biāo)志物 與死亡/心血管事件之間的最高相關(guān)性(Wang等）。
[0038] C反應(yīng)蛋白
[0039] C反應(yīng)蛋白（CRP)是肝臟應(yīng)答于不同臨床狀況例如炎癥、感染或外傷而產(chǎn)生的急性 期血清蛋白（Gabay&Kushner 1999) XRP的產(chǎn)生是由受損或病變組織釋放的細(xì)胞因子例如 IL-6誘導(dǎo)的。CRP的生理作用仍然未知，對其促炎癥或抗炎癥作用的討論一直在進(jìn)行。
[0040] 有越來越多的證據(jù)證明，CRP是人類CVD的風(fēng)險因素。在Ridker等(2002)的研究中， 在由28000位健康婦女組成的大群體中對急性心肌梗死、中風(fēng)、冠狀動脈血運重建或者CVD 所致死亡的發(fā)生進(jìn)行了八年隨訪，顯示CRP是比LDL膽固醇更好的未來心血管事件的預(yù)測 物。許多其它研究也報道，基線CRP水平構(gòu)成了心血管事件的獨立風(fēng)險因素（Thompson等 1995，Mendall等1996，Kuller等1996，Ridker等1997，Tracy等1997，Ridker等2000)〇
[0041] 已有推測認(rèn)為，循環(huán)CRP僅反映動脈粥樣硬化過程中發(fā)生的一般性炎癥，而不是疾 病發(fā)病的活性組分。但是，也有一些證據(jù)支持這種觀點，即CRP在動脈粥樣化形成中有作用。 首先，產(chǎn)生CRP的慢性感染也與CVD風(fēng)險增加相關(guān)(Leinonen&Saikku 2002)。其次，我們和其 他人在不同程度的動脈粥樣硬化病變中鑒定到01^(1^711〇1(18&\^11〇6 1987，!^七31^1^等 1995)。最后，CRP已顯示出在體外具有促動脈粥樣化特性:CRP可活化內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生粘附分 子(Pasceri等2000)。其還可降低內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的產(chǎn)生(Venugopal等2002)并增加巨噬細(xì) 胞對LDL的攝取(Zwaka等2001)。
[0042] 腦鈉尿肽
[0043] 腦(B型）鈉尿肽(BNP)是由心室應(yīng)答于心室中心肌細(xì)胞過度拉伸而分泌的肽類激 素。在切割proBNP后，T-proBNP (無活性的N端片段)與活性激素(BNP) -起被釋放到血流中。 BNP和NT-proBNP都已被建議用作潛在的心血管事件生物化學(xué)標(biāo)志物(Wang等）。
[0044] 趨化因子
[0045] 趨化因子也是潛在的CVD標(biāo)志物;趨化因子是在炎癥中產(chǎn)生的低分子量細(xì)胞因子。 與CVD相關(guān)的一種主要趨化因子是單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1) iCP-1似乎在將單核細(xì)胞募 集到動脈粥樣硬化病變中起到早期且重要的作用。在使用猴動脈粥樣硬化模型的研究中， MCP-1的血漿濃度與斑塊大小和斑塊并發(fā)癥高度相關(guān)(Register等）。
[0046]包括膽固醇的脂質(zhì)
[0047]最近，許多人著眼于測定血清中的膽固醇濃度；總膽固醇以及低密度脂蛋白膽固 醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的濃度。在脂蛋白標(biāo)志物中，至少有兩個重要的 進(jìn)展。首先，LDL顆粒的大小似乎預(yù)測了動脈粥樣硬化發(fā)展的程度。相比于大顆粒濃度的增 加，小LDL顆粒濃度的增加與CVD風(fēng)險更加相關(guān)(Gardner等）。其次，LDL顆粒的膽固醇油酸酯 含量可能是CVD風(fēng)險特別重要的標(biāo)志物。在猴中，含有膽固醇油酸酯的脂蛋白顆粒核心的富 集與更嚴(yán)重的冠狀動脈動脈粥樣硬化強(qiáng)烈正相關(guān)(Rudel等），并且對LDL和HDL膽固醇濃度 的貢獻(xiàn)有加合性。另外，這些實驗動物中的發(fā)現(xiàn)也得到了更早的人類研究(Lawrie等）的支 持了，其顯示與正常對照相比，具有低比例膽固醇亞油酸酯的血漿脂蛋白（相反，具有高比 例的膽固醇油酸酯)常見于具有CHD(coronary heart disease，冠心病)并發(fā)癥的患者。 [0048] HDL-C水平與甘油三酯強(qiáng)相關(guān)，高甘油三酯水平與更高的CHD風(fēng)險相關(guān)。Jeppesen 等的群體研究發(fā)現(xiàn)高TG低HDL-C是IHD (缺血性心臟病)最強(qiáng)的風(fēng)險因素。
[0049] 這些脂質(zhì)譜對于風(fēng)險因素的評價來說非常重要，但是不能了解和測量與斑塊周轉(zhuǎn) 相關(guān)的分子事件。已經(jīng)提出將許多生物化學(xué)標(biāo)志物作為CVD的風(fēng)險因素，盡管不是該疾病的 特異性產(chǎn)物。它們包括CRP和ApoE。
[0050] 脂蛋白
[0051] 最常用于預(yù)測CVD的生物標(biāo)志物是膽固醇濃度（總膽固醇和膽固醇/HDL比值）。它 們與其它風(fēng)險因素(例如血壓和LDL水平)一起使用。在之前提到的SCORE模型中同時使用了 這兩種因素。LDL水平是重要的，因為LDL在血液中運輸膽固醇，氧化LDL的積累可促進(jìn)動脈 粥樣硬化(Graham等）。另外，發(fā)現(xiàn)CHD與甘油三酯(TG)水平顯著相關(guān)，其中CHD風(fēng)險的提高與 TG水平提高相關(guān)，而不論LDL-C和HDL-C水平如何，但膽固醇水平仍被視為CVD主要風(fēng)險因素 之一(Jeppeson等）。
[0052] ΑΡ0-Ε
[0053]載脂蛋白E可