一種檢測吉非替尼耐藥機理的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測吉非尼替耐藥機理的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌在我國及全球范圍內(nèi)都是是發(fā)病率最高、死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌中有 80%為非小細胞肺癌，吉非替尼(Gefitinib)是治療晚期非小細胞肺癌的有效藥物。研究顯 示，與化療相比，吉非替尼具有以下優(yōu)勢：口服給藥;治療毒副作用小；可以與化療取得相 似，甚至好于化療的療效。但是，晚期非小細胞肺癌患者在服用吉非替尼10-12月后會出現(xiàn) 耐藥，導(dǎo)致患者服用藥物藥效降低的后果。盡管目前已對吉非替尼的耐藥機制有一定的了 解，但是，并沒有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致耐藥性的原因，特別是還沒有一個檢測耐藥性的方法，通過該檢 測數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)新的吉非替尼的耐藥機制，從而為開發(fā)延緩或克服吉非替尼耐藥性提供新 的治療策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對目前尚無檢測吉非尼替耐藥機理有效方法，找出耐藥機理原 因這一狀況，提出一種檢測吉非尼替耐藥機理有效方法，為進一步研究抗耐藥物或方法提 供參考依據(jù)。
[0004] -種檢測吉非尼替耐藥性機理方法，該技術(shù)方案包括： ?!)采用iTRAQ定量（同位素標記相對或絕對定量)蛋白組學(xué)技術(shù)對參與吉非替尼耐藥 的蛋白信號分子進行高通量篩選； 采用western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡試驗)技術(shù)驗證，篩選獲得的吉非替尼敏感肺 癌細胞株和吉非替尼耐藥細胞株的差異表達蛋白信號分子； 龜采用MTT(四甲基偶氮唑藍比色)法，證明干擾發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子的表達，可以增 加吉非替尼的敏感性，從而證明新發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子表達水平改變是吉非替尼耐藥的一 種機制。
[0005] 本發(fā)明具有如下顯著效果:通過本發(fā)明技術(shù)方案的實施，有助于檢測到新的參與 吉非替尼耐藥的蛋白信號分子，闡述了吉非替尼耐藥新機制，通過檢測到的新的蛋白信號 分子來設(shè)計抗耐性藥物，達到逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥基礎(chǔ)的目的。
【附圖說明】
[0006] 圖1為iTRAQ定量蛋白組學(xué)分析技術(shù)流程圖。
[0007] 圖2為western blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示圖。
[0008]圖3為MTT技術(shù)檢測結(jié)果顯示圖。
【具體實施方式】
[0009]本發(fā)明的【具體實施方式】如下： 1、參與吉非替尼耐藥蛋白信號分子篩選。
[0010]采用目前國際上公認的iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)對參與吉非替尼耐藥的蛋白信號 分子進行篩選。具體步驟包括：以人肺癌細胞株P(guān)C-9(正常肺癌細胞，對吉非替尼治療敏感） 為對照組，以人肺癌細胞株P(guān)C-9R(將PC-9細胞株采用長時間低劑量吉非替尼治療，獲得的 吉非替尼耐藥細胞株)為實驗組，采用iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選PC-9與PC-9R細胞株差 異表達的蛋白信號分子。iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)具體技術(shù)流程見圖1。
[0011] 2、新發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子在PC-9和PC-9R中是否存在差異表達的驗證。
[0012] 對篩選發(fā)現(xiàn)的，與PC-9相比，在PC-9R中表達上調(diào)的蛋白信號分子，采用western blot技術(shù)對其實際表達水平進行驗證。western blot技術(shù)的主要步驟包括:蛋白提取，蛋白 濃度測定，凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜，抗體孵育和蛋白表達水平檢測等。
[0013] 3、新發(fā)現(xiàn)蛋白信號分子參與吉非替尼耐藥的驗證。
[0014] 對干擾新發(fā)現(xiàn)蛋白信號分子表達的PC-9R和PC-9R本身，進行吉非替尼治療，采用 MTT法比較干擾新發(fā)現(xiàn)蛋白信號分子與否，吉非替尼對PC-9R增殖率的影響，從而證實干擾 新發(fā)現(xiàn)蛋白信號分子表達，可以增加 PC-9R對吉非替尼的敏感性，進而說明，新發(fā)現(xiàn)的蛋白 信號分子介導(dǎo)吉非替尼耐藥，具有作為藥物設(shè)計靶點的潛在價值。
[0015] 如圖1所示：iTRAQ定量蛋白組學(xué)分析技術(shù)流程為:第一步，分別從PC-9和PC-9R細 胞樣品中提取蛋白；第二步，對提取后的蛋白樣品進行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后 續(xù)步驟充分酶解蛋白；第三步，用考馬斯亮藍法(Brandford)法進行蛋白的濃度測定，聚丙 烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢測，每個樣品取等量蛋白，進行胰蛋白酶酶解;第四步，用 iTRAQ試劑標記肽段;第五步，將標記后的肽段進行等量混合;第六步，對混合后的肽段使用 強陽離子交換色譜（Strong Cation Exchange chromatography，SCX)進行預(yù)分離；第七 步，進行液相串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析;第八步，數(shù)據(jù)分析:首先對于質(zhì)譜下機的原始文件，進行峰 識別，得到峰列表。其次建立參考數(shù)據(jù)庫，進行肽段及蛋白質(zhì)的鑒定。最后比較各蛋白在各 樣品之間的相對含量的關(guān)系，從而獲得目標蛋白。
[0016] 如圖2所示:Annexin A1在PC-9R中表達高于PC-9(顏色越黑，表達水平越高）β-actin是內(nèi)參，用于標定蛋白表達的基準。Annexin Α1的分子量為38.5 kDa，0-actin的分子 量為45 kDa。
[0017] 如圖3所示:研究對象采用對吉非替尼耐藥的PC-9R細胞，由于其對吉非替尼耐藥， 所以，隨著吉非替尼濃度的增加，PC-9R的增值率有降低，但是不明顯。如果先對PC-9R細胞 的Annexin A1表達水平進行干擾，然后再采用吉非替尼治療，隨著吉非替尼濃度的增加， PC-9R細胞的增殖率會受到明顯的抑制。說明，Annexin A1參與了吉非替尼的耐藥，是一種 吉非替尼耐藥的新機制。同時，也預(yù)示著，Annexin A1可以作為逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥藥物的革巴 點。
[0018] 表1經(jīng)篩選獲得的PC-9與PC-9R差異表達蛋白信號分子
注:按照上調(diào)率排名，Annexin A1位于第三位。鑒于上調(diào)率前兩位的蛋白信號分子已有 文獻報道，本方案選擇Annexin A1作為新的參與吉非替尼耐藥的信號分子進行申報。
[0019] 上調(diào)率：iTRAQ定量蛋白組學(xué)結(jié)果的一部分，認為Annexin A1在PC-9R中的表達高 于PC-9中的表達，且上調(diào)了 1.96366667倍。
[0020] 上述【附圖說明】和表1中：PC-9為人肺腺癌PC-9細胞;PC-9R為人肺腺癌PC-9細胞耐 吉非替尼細胞;SCX強陽離子交換為;nM為納摩爾每升吉非替尼濃度;Annexin A1為膜聯(lián)蛋 白A1，在PC-9R中表達高于PC-9 (顏色越黑，表達水平越高）。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測吉非替尼耐藥機理的方法，其特征在于:該方法包括:雷采用iTRAQ定量(同 位素標記相對或絕對定量)蛋白組學(xué)技術(shù)對參與吉非替尼耐藥的蛋白信號分子進行高通量 篩選； 這;采用western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡試驗)技術(shù)驗證，篩選獲得的吉非替尼敏感肺癌 細胞株和吉非替尼耐藥細胞株的差異表達蛋白信號分子； :凄采用MTT(四甲基偶氮挫藍比色)法，證明干擾發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子的表達，可W增加 吉非替尼的敏感性，從而證明新發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子表達水平改變是吉非替尼耐藥的一種 機制。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測吉非替尼耐藥機理的方法，其特征在于:蛋白信號分子進行 高通量篩選的具體步驟包括：W人肺癌細胞株P(guān)C-9(正常肺癌細胞，對吉非替尼治療敏感） 為對照組，W人肺癌細胞株P(guān)C-9R(將PC-9細胞株采用長時間低劑量吉非替尼治療，獲得的 吉非替尼耐藥細胞株)為實驗組，采用iTRAQ定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選PC-9與PC-9R細胞株差 異表達的蛋白信號分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測吉非替尼耐藥機理的方法，其特征在于:western blot技術(shù) 驗證的主要步驟包括:蛋白提取，蛋白濃度測定，凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜，抗體解育和蛋白表達 水平檢測。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述檢測吉非替尼耐藥機理的方法，其特征在于：iTRAQ定量蛋白 組學(xué)分析技術(shù)流程為:第一步，分別從PC-9和PC-9R細胞樣品中提取蛋白；第二步，對提取后 的蛋白樣品進行還原烷基化處理，打開二硫鍵W便后續(xù)步驟充分酶解蛋白；第=步，用考馬 斯亮藍法(Bran壯ord)法進行蛋白的濃度測定，聚丙締酷胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，每個 樣品取等量蛋白，進行膜蛋白酶酶解;第四步，用iTRAQ試劑標記膚段;第五步，將標記后的 膚段進行等量混合；第六步，對混合后的膚段使用強陽離子交換色譜（Strong Cation Exchange chromatography，sex)進行預(yù)分離；第屯步，進行液相串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析；第八步，數(shù) 據(jù)分析:首先對于質(zhì)譜下機的原始文件，進行峰識別，得到峰列表。
【專利摘要】一種檢測吉非替尼耐藥機理的方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。該方法包括：①采用iTRAQ定量（同位素標記相對或絕對定量）蛋白組學(xué)技術(shù)對參與吉非替尼耐藥的蛋白信號分子進行高通量篩選；②采用western？blot（蛋白質(zhì)免疫印跡試驗）技術(shù)驗證，篩選獲得的吉非替尼敏感肺癌細胞株和吉非替尼耐藥細胞株的差異表達蛋白信號分子；③采用MTT（四甲基偶氮唑藍比色）法，證明干擾發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子的表達，可以增加吉非替尼的敏感性，從而證明新發(fā)現(xiàn)的蛋白信號分子表達水平改變是吉非替尼耐藥的一種機制。該方法有助于檢測到新的參與吉非替尼耐藥的蛋白信號分子，通過檢測到的新的蛋白信號分子來設(shè)計抗耐性藥物。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105510603
【申請?zhí)枴緾N201610068206
【發(fā)明人】王艷陽, 趙仁, 折虹
【申請人】寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年2月1日