緩沖液，pH為2.2-8.0、e)磷酸氫 鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH為2.2-8.0、f)磷酸鹽緩沖液，pH為4.9-8.2、g)檸檬酸-氫氧化鈉-鹽 酸緩沖液，pH為2.2-6.5、h) Tr i s-鹽酸緩沖液，pH為7.1-8.9、i)甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 為8.6-10.6和j)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH為9.16-10.83。
[0026]上述的檢測(cè)試劑盒中，所述酶活穩(wěn)定劑可為MgS04、MgCl2、乙二胺四乙酸二鈉、乙二 胺四乙酸二鉀、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、甘油和二甲基亞砜中至少一種。 [0027]上述的檢測(cè)試劑盒中，所述終止液可為高氯酸、鹽酸、硫酸、硝酸和三氯乙酸中至 少一種的水溶液。
[0028] 上述的檢測(cè)試劑盒中，所述中和液可為碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀和 氫氧化鈣中至少一種的水溶液。
[0029] 利用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)生物素酶酶活性時(shí)，可按照下述方法進(jìn)行：
[0030] 1)將樣本加入至所述試劑1中進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后加入所述試劑2進(jìn)行終止反 應(yīng);將所述反應(yīng)后的體系進(jìn)行離心分離，向得到的上清液中加入所述試劑3進(jìn)行中和至pH值 為7~11;向所述中和后的體系中加入所述試劑4進(jìn)行衍生反應(yīng);檢測(cè)所述衍生反應(yīng)后的體 系在激發(fā)波長(zhǎng)300~500nm和發(fā)射波長(zhǎng)400~600nm下的焚光值；
[0031] 2)將經(jīng)滅活處理后的樣本加入至所述試劑1中進(jìn)行反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后加入所述試 劑2進(jìn)行終止反應(yīng);將所述反應(yīng)后的體系進(jìn)行離心分離，向得到的上清液中加入所述試劑3 進(jìn)行中和至pH值為7~11;向所述中和后的體系中加入所述試劑4進(jìn)行衍生反應(yīng);檢測(cè)所述 衍生反應(yīng)后的體系在激發(fā)波長(zhǎng)300~500nm和發(fā)射波長(zhǎng)400~600nm下的熒光值，作為空白對(duì) 照的熒光值；
[0032]所述反應(yīng)與步驟1)中所述反應(yīng)的條件相同；
[0033] 所述終止反應(yīng)與步驟1)中所述終止反應(yīng)的條件相同；
[0034] 所述衍生反應(yīng)與步驟1)中所述衍生反應(yīng)的條件相同；
[0035] 3)將至少8種不同濃度的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品分別與所述試劑4進(jìn)行所述衍生反應(yīng)，并檢 測(cè)所述衍生反應(yīng)后的體系在激發(fā)波長(zhǎng)300~500nm和發(fā)射波長(zhǎng)400~600nm下的熒光值；以賴 氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，以熒光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0036] 所述衍生反應(yīng)與步驟1)中所述衍生反應(yīng)的條件相同；
[0037] 4)根據(jù)步驟1)中所檢測(cè)的熒光值與步驟2)中作為空白對(duì)照的熒光值的差值和所 述標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到步驟1)中進(jìn)行所述衍生反應(yīng)的賴氨酸的濃度，進(jìn)而得到所述樣本中生 物素酶的酶活性；
[0038] 所述酶活性的單位定義為：以每L樣本每小時(shí)水解所述生物胞素生成的賴氨酸的 微摩爾數(shù)，表示為ymol/L/h。
[0039] 上述的檢測(cè)方法中，步驟1)和步驟2)中，所述反應(yīng)的溫度可為4~60°C，時(shí)間可為 0.5~48小時(shí)，如在37°C的條件下反應(yīng)24小時(shí)。
[0040] 上述的檢測(cè)方法中，步驟1)和步驟2)中，所述終止反應(yīng)步驟中，所述試劑2與所述 試劑1體積比為1:20;
[0041 ] 所述中和步驟中，所述上清液與所述試劑3的體積比可為0.5~3:1，具體可為2:1;
[0042]所述衍生反應(yīng)步驟中，所述上清液與所述試劑4的體積比可為0.5~2:1，具體可為 1:1;所述衍生反應(yīng)的溫度可為4~60°C，時(shí)間可為0.2~2小時(shí)，如在30°C的條件下反應(yīng)0.5 小時(shí)。
[0043]上述的檢測(cè)方法中，步驟2)中，所述滅活處理的方法為煮沸滅活或高溫滅活;所述 高溫滅活的溫度不低于80°C。
[0044] 步驟3)中，所述賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度可為0~150μπιο 1 /L，如0、7 · 5、15、30、60、90、120 和150ymol/L。
[0045] 本發(fā)明提供的試劑盒可用于輔助診斷生物素酶缺乏癥。
[0046] 本發(fā)明提供的試劑盒可直接用于檢測(cè)干血片樣本，可通過將血液滴在吸附材料 上，并經(jīng)過干燥后獲得。所用的吸附材料包括但不限于濾紙等吸水性材料(常用的如903#濾 紙）；干燥可在室溫干燥4~16h，也可通過其它干燥設(shè)備干燥一段時(shí)間實(shí)現(xiàn)。
[0047] 利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所使用的干血片樣本中生物素酶酶活性在室溫條 件下可以穩(wěn)定數(shù)月時(shí)間，在低溫條件下(如_20°C)可以穩(wěn)定數(shù)年時(shí)間，因此有利于樣本的保 存、運(yùn)輸及生物素酶缺乏癥的篩查。
[0048] 本發(fā)明提供的試劑盒還可以用于分析和檢測(cè)源自人體或動(dòng)物的各類標(biāo)本(包括各 種體液、細(xì)胞或組織及其所制成的干片）中的生物素酶酶活力，如可用于血漿、血清、白細(xì) 胞、培養(yǎng)細(xì)胞及其制備的干片等，適用標(biāo)本范圍廣。
[0049] 本發(fā)明提供的試劑盒中的底物為生物胞素(Bi〇cytin，N-d-生物素基-L-賴氨酸）， 其通用結(jié)構(gòu)式如式I:
[0050]
[0051] 它是生物素酶的天然底物，與其它底物相比，該底物具有更小的Km值，以天然底物 生物胞素為反應(yīng)底物時(shí)，酶活性較人工底物高30±5%，因此具有較高的檢測(cè)靈敏度及更寬 的檢測(cè)限。
[0052]利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行生物素酶酶活性檢測(cè)的檢測(cè)原理如下述反應(yīng)方程式所示： [0053]牛物跑累+ HO -生物素..丨..賴氨酸 [0054]賴氨酸+衍生試劑-賴氨酸衍生物
[0055] 樣本中的生物素酶在適當(dāng)?shù)木彌_體系中能夠水解生物胞素，生成賴氨酸，在合適 的溫度(4~60°C)下反應(yīng)一段時(shí)間（0.5~48h)后，反應(yīng)體系中加入終止液使反應(yīng)終止，離心 后取上清液，反應(yīng)過程中生成的賴氨酸再與衍生化試劑反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物即賴氨酸衍生 物，在特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下可檢測(cè)到賴氨酸衍生物特異的熒光。由于生成的賴氨酸量 與生成的熒光產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度成正比，因此檢測(cè)在特定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下的賴氨酸衍 生物熒光值，扣除空白對(duì)照值后，通過以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品與衍生試劑反應(yīng)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就 可以計(jì)算出反應(yīng)中賴氨酸的生成量。
[0056] 使用本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無需對(duì)樣本進(jìn)行任何形式的前期處 理，例如可直接用打孔器在干血片上取下直徑3mm的小片加入反應(yīng)體系中即可檢測(cè)生物素 酶活性，無需提取出生物素酶。而采用如血漿等其它標(biāo)本時(shí)，也無需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行透析、超濾、 層析等純化處理，可直接用于酶活力檢測(cè)，方便快捷。
[0057] 使用本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以獲得干血片中生物素酶活性的定 量結(jié)果，因此可以用于分析、檢測(cè)和診斷生物素酶的酶活力異常導(dǎo)致的各種疾病，特別是由 生物素酶的酶活力異?；蚺R床癥狀類似的各種遺傳和代謝疾病，如生物素酶缺乏癥，鑒別 生物素缺乏癥、羧化全酶合成酶缺乏癥等。
[0058]總之，使用本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，與Ebrahim等建立的方法(Ebrahim 法)相比，具有如下優(yōu)勢(shì)：首先，利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以干血片為檢測(cè)樣本，這 使得本方法可應(yīng)用于新生兒篩查，滿足生物素酶缺乏癥需及時(shí)診治的要求，易于推廣使用。 其次，利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本無需進(jìn)行純化提取等前處理，不僅擴(kuò)大了檢測(cè) 樣本范圍，還降低了操作復(fù)雜性，Ebrahim法只能用于血清標(biāo)本檢測(cè)，且檢測(cè)前必須進(jìn)行透 析處理;第三，酶活穩(wěn)定性更好，本發(fā)明提供的反應(yīng)體系中，生物素酶活性穩(wěn)定時(shí)間超過24 小時(shí)，而Ebrahim法為3小時(shí);第四，減少了標(biāo)本及試劑用量，降低了檢測(cè)成本。
【附圖說明】
[0059] 圖1為實(shí)施例1中制作的賴氨酸濃度與賴氨酸衍生物的熒光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0060] 圖2為實(shí)施例3中干血片中生物素酶催化底物生物胞素水解生成賴氨酸量與反應(yīng) 時(shí)間的線性關(guān)系曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0061 ]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0062] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0063] 實(shí)施例1、生物素酶酶活性的檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用
[0064] (1)檢測(cè)生物素酶酶活性的試劑盒，包括如下組分：
[0065] 試劑 1:
[0066] 乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH5.5) 2U0mnK)i/L 乙二胺四乙酸二鈉 lOmmol/UA:試劑1