檢測生物素酶酶活性的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種檢測酶活性的試劑盒,具體涉及一種檢測生物素酶酶活性的試劑 盒,屬于生物醫(yī)藥檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物素(Biotin)又稱為維生素 B7、維生素 H、輔酶R,是一種水溶性的含硫維生素。 生物素是體內(nèi)4種羧化酶的輔酶,包括糖代謝中的關(guān)鍵酶丙酮酸羧化酶、催化脂肪酸合成第 一步反應(yīng)的乙酰輔酶A羧化酶、在蛋白質(zhì)代謝中起重要作用的丙酰輔酶A羧化酶和β-甲基巴 豆酰輔酶Α羧化酶。生物素的缺乏將導致上述酶活性缺失,引起體內(nèi)糖、脂及蛋白質(zhì)三大營 養(yǎng)物質(zhì)代謝異常,出現(xiàn)線粒體能量合成障礙,引起代謝性酸中毒、有機酸尿癥及一系列神經(jīng) 與皮膚系統(tǒng)損害,嚴重時致死。另外,生物素還是組蛋白的重要修飾成分,參與基因表達與 DNA修復(fù)等過程。
[0003] 生物素酶是一種糖蛋白,廣泛存在于血清、白細胞、成纖維細胞及肝臟等組織中。 生物素酶的主要功能是水解食物中及機體代謝產(chǎn)生的生物胞素和生物素-肽,產(chǎn)生游離的 生物素。雖然生物素在食物中廣泛存在,但絕大部分是以蛋白結(jié)合態(tài)存在,因此,生物素酶 缺陷將導致機體既無法從食物中攝取生物素又無法再生機體代謝產(chǎn)生的生物素,最終使機 體缺乏生物素,引起體內(nèi)糖、脂及蛋白質(zhì)代謝異常,即出現(xiàn)生物素酶缺乏癥(Biotinidase def i c i ency,BD),也稱遲發(fā)型多羧化酶缺乏癥。
[0004] 生物素酶缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳疾病,發(fā)病年齡一般在1周至10歲,平均 年齡3.5個月,但也有幾年后仍無明顯癥狀的。生物素酶缺乏癥臨床表現(xiàn)復(fù)雜,涉及神經(jīng)系 統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng),出現(xiàn)發(fā)育滯后、視力及聽力下降等,患者間癥狀差異較大;生化異 常包括代謝性酸中毒、有機酸尿癥及高氨血癥等,嚴重時出現(xiàn)昏迷甚至死亡。根據(jù)血漿殘余 生物素酶活性大小,可將生物素酶缺乏癥分成兩種類型,即嚴重缺乏型(酶活性〈10%正常 人平均值)和部分缺乏型(酶活性處于正常人平均值的10%~30%)。據(jù)1991年的統(tǒng)計,生物 素酶缺乏癥的全球發(fā)病率約為1/60,000,但不同地區(qū)間發(fā)病率差異很大,例如希臘高達1/ 4,508、土耳其為1/11,000、歐洲10個國家的整體發(fā)病率為1/47,486。在我國尚無發(fā)病率統(tǒng) 計,僅有約20例臨床病例報道,根據(jù)病例分布推測,本病在我國的發(fā)病率可能存在南北差 異。口服游離生物素可以改善或阻止生物素酶缺乏癥的臨床癥狀,療效顯著且無毒副作用。 若能及時確診患者,并終生補充生物素進行預(yù)防治療,患者將正常生長發(fā)育而不受任何影 響,但若診斷較晚,出現(xiàn)發(fā)育滯后、視力及聽力等器質(zhì)性損傷時,這些癥狀將無法恢復(fù)。因 此,早期確診并進行預(yù)防治療,是防治生物素酶缺乏癥的關(guān)鍵。
[0005] 由于生物素酶缺乏癥臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,且與許多其它疾病在臨床表現(xiàn)上有很多 相似之處(如皮疹等),容易被誤診;另外,部分缺乏型患者往往只在受壓(如感染等)情況下 才表現(xiàn)出癥狀,因此不易發(fā)現(xiàn),但他們始終存在發(fā)病風險。若未得到正確及時的診治,致病 及致死率均較高。因此,建立生物素酶缺乏癥的診斷方法,對患者做出早期診斷,對改善生 物素酶缺乏癥患者生存質(zhì)量、提高我國人口出生素質(zhì)具有重要意義。
[0006] 生物素酶缺乏癥可從3個方面進行分析診斷,即生物素酶酶活性分析、體內(nèi)代謝物 水平分析及基因分析,但后兩者只能作為生物素酶缺乏癥診斷的輔助或確證手段。因為基 于代謝物水平很難將生物素酶缺乏癥與其它疾病進行區(qū)分(如全羧化酶合成酶缺乏癥等), 而且代謝物水平常受到發(fā)病狀態(tài)、飲食及用藥等影響,因此基于代謝物水平分析的串聯(lián)質(zhì) 譜技術(shù)等方法只能作為生物素酶缺乏癥輔助診斷措施。對于基因水平的分析,由于存在單 核苷酸多態(tài)性等原因,常常給基因分析帶來不確定性;另一方面,基因的表達翻譯及功能的 實現(xiàn)往往需要一些其它分子或蛋白的參與或修飾,有很多這類機制目前還未完全被揭示, 因此基因分析也不能作為診斷的可靠依據(jù),只適用于對生物素酶缺乏癥的確證及分型。而 酶活性水平分析則基本不存在上述問題,不僅特異性高,而且不受發(fā)病狀態(tài)等影響,因此, 對生物素酶缺乏癥的診斷主要是基于生物素酶的酶活性分析,是生物素酶缺乏癥診斷的金 標準。
[0007] 目前,國際上采用的生物素酶活性分析方法多以人工底物類似物N-生物素 -P-氨 基苯甲酸為反應(yīng)底物,通過檢測其酶促水解產(chǎn)物P-氨基苯甲酸的衍生物的吸光值來檢測酶 活性,此方法較經(jīng)濟,但磺胺類藥物會使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。另外一種可用于生物素酶活 性篩查的反應(yīng)底物為生物素-6-氨基喹啉,同樣是一種人工底物類似物,通過檢測其酶促水 解產(chǎn)物氨基喹啉的熒光值來檢測酶活性,該方法成本較高,且可因較高的白蛋白濃度及使 用某些抗生素而出現(xiàn)假陽性,另外,高甘油三酯濃度會使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。其它方法還有以 熒光及放射性標記的生物素衍生物等為底物的,但均存在費用較高、操作更復(fù)雜、更費時等 問題。值得注意的是,上述方法中均是以人工底物類似物作為反應(yīng)底物,Ebrahim等研究發(fā) 現(xiàn),以天然底物生物胞素為反應(yīng)底物時,酶活性較人工底物高30± 5%。因此,以生物胞素為 底物時,檢測方法具有更高的檢測靈敏度及更寬的檢測限,且更能反映樣本中生物素酶活 性的真實水平。
[0008] 但是,Ebrahim等建立的方法只能用于血清樣本的檢測,樣本用量大,酶活性穩(wěn)定 時間短,且檢測前還必須對樣本進行透析處理,操作復(fù)雜。以上的不足導致該方法無法應(yīng)用 于新生兒篩查,但如前所述,生物素酶缺乏癥必需得到及時的診治,否則將出現(xiàn)不可逆的損 傷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測生物素酶(81〇^1^(1&%40 3.5.1.12)酶活性的試 劑盒,本發(fā)明試劑盒進行檢測時,是以生物胞素為底物,因此具有較高的檢測靈敏度及更寬 的檢測限;并且不需要對樣本進行任何形式的前期處理,可直接用于酶活性檢測,方便快 捷;可在半自動或全自動的熒光光度計或酶標儀等熒光檢測設(shè)備上使用本發(fā)明,比較方便。
[0010] 本發(fā)明提供的一種檢測生物素酶酶活性的試劑盒,它包括獨立包裝的試劑1、試劑 2、試劑3和試劑4;
[0011] 所述試劑1為由緩沖液1、酶活穩(wěn)定劑和生物胞素組成的緩沖體系,所述試劑1的pH 值為3~11;
[0012] 所述試劑2為終止液;
[0013]所述試劑3為中和液;
[0014]所述試劑4為由緩沖液2和衍生底物組成的體系,所述衍生底物為1,2_二乙酰苯、 茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種。
[0015] 上述的試劑盒中,所述試劑1中,所述緩沖液1的摩爾濃度可為50~500mmol/L,所 述酶活穩(wěn)定劑的摩爾濃度可為1~50mmol/L,所述生物胞素的摩爾濃度可為0.05~2mmol/ L;
[0016] 所述試劑2中,所述終止液的質(zhì)量百分含量可為30%~70% ;
[0017] 所述試劑3中,所述中和液的摩爾濃度可為0.2~2mol/L;
[0018] 所述試劑4中,所述緩沖液2的摩爾濃度可為50~500mmol/L,所述衍生底物的質(zhì)量 百分含量可為〇. 05 %~5 %。
[0019] 本發(fā)明提供的試劑盒的具體組成可為:包括獨立包裝的試劑1、試劑2、試劑3和試 劑4;
[0020] 所述試劑1為由緩沖液1、酶活穩(wěn)定劑和生物胞素組成的緩沖體系,所述試劑1的pH 值為5.5;所述緩沖液1的摩爾濃度可為200mmol/L,所述酶活穩(wěn)定劑的摩爾濃度可為 10mm〇l/L,所述生物胞素的摩爾濃度可為2mmol/L;
[0021 ]所述試劑2為終止液,所述終止液的質(zhì)量百分含量可為60% ;
[0022] 所述試劑3為中和液,所述中和液的摩爾濃度可為lmol/L;
[0023] 所述試劑4為由緩沖液2和衍生底物組成的體系,所述衍生底物為1,2-二乙酰苯、 茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種,所述緩沖液2的摩爾濃度可為250mmol/L,所述衍生底 物的質(zhì)量百分含量可為1 %。
[0024] 上述的檢測試劑盒中,所述緩沖液1和所述緩沖液2均選自下述緩沖試劑中至少一 種:
[0025] a)乙酸鈉-乙酸緩沖液,pH為2.6-5.8、b)甲酸鈉-甲酸緩沖液,pH為2.0-5.0、c)梓 檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH為3.0-6.6、d)磷酸氫鹽-檸檬酸