液相同的溶液中進(jìn)行差分脈沖伏 安檢測，掃描速度為50mV · s^，電壓范圍為-0.2V~+0.6V。得到差分脈沖伏安圖曰。然后取出 納米免疫傳感器，用去離子水沖洗去除電極表面的電解質(zhì)，備用。
[0071] 在上述納米免疫傳感器上滴涂上述提取液化L，室溫下解育20min"WAg/AgCl電極 為參比電極、銷絲(片）電極為輔助電極，苯并(a)巧納米免疫傳感器為工作電極，組成Ξ電 極測試系統(tǒng)，在與步驟a電解質(zhì)溶液相同的溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安法的檢測，掃描速度為 50mV · s^，電壓范圍為-0.2V~+0.6V。得到差分脈沖伏安圖b。將圖a與圖b疊加后得到圖4。 由圖3得到，b圖的響應(yīng)電流值與a圖相比，響應(yīng)電流值發(fā)生變化，說明抗原與抗體產(chǎn)生了結(jié) 合，也就是說，肉制品中有苯并(a)巧被檢測出來。分別進(jìn)行Ξ次測量，求其平均值，按線性 回歸方程式計(jì)算其苯并(a)巧的濃度。該肉制品樣品中含有苯并(a)巧，其濃度為2.化g/mL。
[0072] 為了驗(yàn)證該方法的有效性，同時(shí)利用高效液相色譜方法測定肉制品中的苯并(a) 巧。
[0073] 表1高效液相色譜法和免疫電極法對肉制品樣品的檢測結(jié)果
[0074]
[0075] ~該方法測得的苯并(a)巧的準(zhǔn)確率達(dá)到96.3%，可W說明此方法在檢驗(yàn)苯并(3)巧~ 上具有有效性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的制備方法，其特征是，以玻碳電極 為基礎(chǔ)電極，采用聚酰胺-胺樹枝狀大分子結(jié)合聚二烯丙基二甲基氯化銨功能化的石墨烯 修飾玻碳電極，然后滴涂納米金溶液，納米金經(jīng)靜電吸附作用固定于修飾電極上，再經(jīng)戊二 醛偶聯(lián)固定多環(huán)芳烴抗體制備成納米免疫傳感器。2. 如權(quán)利要求1所述的用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的制備方法，其特征 是包括以下步驟： a. 電極預(yù)處理 將玻碳電極用粒徑為〇.〇5μπι的氧化鋁拋光粉拋光打磨至電極表面呈鏡面，然后用蒸餾 水沖洗干凈，再依次置于體積分?jǐn)?shù)為50%的硝酸、丙酮、去離子水中超聲清洗2min~6min， 氮?dú)獯蹈桑瑐溆茫? b. 聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯復(fù)合物的制備 準(zhǔn)確稱取〇.2g石墨烯加入到10mL聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶液(PDDA，體積分?jǐn)?shù)為 0.25% )中，超聲處理25min~35min，水洗三次去除過量的石墨稀，制得PDDA功能化的石墨 稀，取O.OlgFODA功能化的石墨稀加入到10mLN，N-二甲基甲酰胺中，使其濃度為lmg/mL， 超聲處理lOmin~20min，得到均勾一致的PDDA功能化石墨稀的N，N-二甲基甲酰胺懸浮液， 備用； 準(zhǔn)確稱取0.02g聚酰胺-胺溶于10mL甲醇中，使其濃度為2mg/mL，超聲處理15min~ 25min，得到均勻透明的聚酰胺-胺的甲醇溶液，然后將聚酰胺-胺的甲醇溶液與PDDA功能化 石墨稀的N，N-二甲基甲酰胺懸浮液按1:1混合均勾，超聲處理30min~40min，制得聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯復(fù)合物； c. 納米金的制備 準(zhǔn)確量取50mL0.lmg/mL的氯金酸溶液置于燒杯中，用玻璃棒攪拌下加熱至沸騰，迅速 加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸鈉溶液，持續(xù)攪拌至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，得到納米金 溶液； d. 納米免疫傳感器的制備 將步驟a中得到的玻碳電極應(yīng)用三電極系統(tǒng)，即以玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl電極 為參比電極、鉑絲電極為輔助電極，在-0.2V~+0.6V的電位區(qū)間，采用LK98BII型微機(jī)電化 學(xué)分析系統(tǒng)以50mV·?Γ1的掃描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10 圈，對玻碳電極表面進(jìn)行活化處理。沖洗玻碳電極后，用移液槍移取3~6yL步驟b得到的聚 酰胺-胺-PDDA功能化石墨烯復(fù)合物滴涂到玻碳電極表面，于室溫晾干，再移取2~5yL納米 金溶液滴涂到修飾的電極表面，于室溫晾干，然后在修飾電極表面滴涂3~5yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5 %的戊二醛溶液活化修飾的電極表面，于4°C條件下活化25~35min，然后用pH為7.4的 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗電極，再滴涂3~6yL多環(huán)芳烴抗體，并于4°C條件下固定2h，再 滴涂3~5yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封閉lh，用pH為7.4的0.2mol/L磷酸 鹽緩沖液反復(fù)沖洗干凈，得到苯并(a)芘納米免疫傳感器，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?. 如權(quán)利要求2所述的用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的制備方法，其特征 是，所述步驟b中聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨稀復(fù)合物的制備的具體步驟內(nèi)容為： 準(zhǔn)確稱取〇.2g石墨烯加入到10mL聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶液(PDDA，體積分?jǐn)?shù)為 0.25% )中，超聲處理30min，水洗三次去除過量的石墨稀，制得PDDA功能化的石墨稀，取 O.OlgPDDA功能化的石墨稀加入到lOmLN，N-二甲基甲酰胺中，使其濃度為lmg/mL，超聲處 理15min，得到均勻一致的TODA功能化石墨烯的N，N-二甲基甲酰胺懸浮液，備用； 準(zhǔn)確稱取〇.〇2g聚酰胺-胺溶于10mL甲醇中，使其濃度為2mg/mL，超聲處理20min，得到 均勻透明的聚酰胺-胺的甲醇溶液，然后將聚酰胺-胺的甲醇溶液與TODA功能化石墨烯的N， N-二甲基甲酰胺懸浮液按1:1混合均勻，超聲處理35min，制得聚酰胺-胺-PDDA功能化石墨 烯復(fù)合物。4. 如權(quán)利要求2所述的用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的制備方法，其特征 是，所述步驟d中納米免疫傳感器的制備的具體步驟內(nèi)容為： 將步驟a中得到的玻碳電極應(yīng)用三電極系統(tǒng)，即以玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl電極 為參比電極、鉑絲電極為輔助電極，在-0.2V~+0.6V的電位區(qū)間，采用LK98BII型微機(jī)電化 學(xué)分析系統(tǒng)以50mV·?Γ1的掃描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10 圈，對玻碳電極表面進(jìn)行活化處理。沖洗玻碳電極后，用移液槍移取5yL步驟b得到的聚酰 胺-胺-PDDA功能化石墨烯復(fù)合物滴涂到玻碳電極表面，于室溫晾干，再移取3yL納米金溶液 滴涂到修飾的電極表面，于室溫晾干，然后在修飾電極表面滴涂4yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的戊 二醛溶液活化修飾的電極表面，于4°C條件下活化30min，然后用pH為7.4的0.2mol/L磷酸鹽 緩沖液沖洗電極，再滴涂5yL多環(huán)芳烴抗體，并于4°C條件下固定2h，再滴涂4yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封閉lh，用pH為7.4的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗干凈， 得到苯并(a)芘納米免疫傳感器，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?. 使用權(quán)利要求1或2擇一所述的用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的檢測方 法，其特征是包括以下具體步驟： a. 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品加入到10mL二甲基亞砜中，再用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至 不同濃度梯度，在苯并(a)芘納米免疫傳感器上涂上各個(gè)梯度的上述苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品溶 液，室溫下孵育15~25min，以Ag/AgCl電極為參比電極、鉑絲(片）電極為輔助電極，苯并(a) 芘納米免疫傳感器為工作電極，組成三電極測試系統(tǒng)，在1.0mm〇l/LK3[Fe(CN)6]+0.1mol/L KC1+0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.0)進(jìn)行差分脈沖伏安法的檢測（掃描速度為50mV· s<，電壓范圍為-0.2V~+0.6V);以苯并(a)芘濃度為零時(shí)電流值和各濃度梯度的電流值的 差值為縱坐標(biāo)，苯并(a)芘濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，得到苯并(a)芘的免疫響應(yīng)電流差值與其 濃度之間的線性曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程式，實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行。 b. 測定 將檢測樣品（肉制品Ι、π)分別粉碎，肉制品I和II各取l〇g樣品，進(jìn)行以下處理，即加入 50mL環(huán)己燒，超聲處理lOmin后過濾到濃縮瓶中，在70°C旋蒸至20mL，移入分液漏斗，用50mL 二甲基亞砜萃取，再用30mL環(huán)己烷提取，棄去環(huán)己烷層，把提取液旋蒸至10mL，用5mL二甲基 亞砜洗滌濃縮瓶，合并二甲基亞砜，加入15mL水，搖勻后過活化后的C18固相萃取小柱抽干， 用30mL正己燒洗脫，收集洗脫液，蒸干后用2mL甲醇定容，經(jīng)0.45μηι濾膜過濾，備用；用 LK98BII型微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)來測定所述的差分脈沖伏安圖，分別進(jìn)行三次測量并記錄 差分脈沖伏安圖，按線性回歸方程式計(jì)算其苯并(a)芘的濃度，此過程在室溫條件下下進(jìn) 行。6. 如權(quán)利要求5所述的用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的檢測方法，其特征 是，所述步驟a中，在苯并(a)芘納米免疫傳感器上涂上各個(gè)梯度的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品溶液 后，室溫下孵育時(shí)間為20min。
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品安全快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于苯并(a)芘快速檢測的納米免疫傳感器的制備方法及其檢測方法，包括：以玻碳電極為基礎(chǔ)電極，采用聚酰胺-胺樹枝狀大分子結(jié)合聚二烯丙基二甲基氯化銨功能化的石墨烯修飾玻碳電極，然后滴涂納米金溶液，納米金經(jīng)靜電吸附作用固定于修飾電極上，再經(jīng)戊二醛偶聯(lián)固定多環(huán)芳烴抗體制備成納米免疫傳感器；將該納米免疫傳感器用于食品中苯并(a)芘的檢測，其結(jié)果與國標(biāo)方法結(jié)果一致，但該方法靈敏度高、精確度高、檢測時(shí)間短，是一種簡便快速、精確度較高的苯并(a)芘的檢測方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N27/48
【公開號】CN105486741
【申請?zhí)枴緾N201510919410
【發(fā)明人】李書國, 王瑞鑫, 馮亞凈, 張?jiān)茻?
【申請人】河北科技大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月11日