用于快速檢測(cè)苯并(a)芘的納米免疫傳感器的制備方法及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于苯并(a)巧快速檢測(cè)的納米免疫傳感器的制備方法，W及利 用該納米免疫傳感器檢測(cè)肉制品中的苯并(a)巧的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯并(a)巧是一種由4個(gè)苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳控，常溫下為無(wú)色至淡黃色針狀晶體， 性質(zhì)穩(wěn)定。在煎烤、燒烤、油炸動(dòng)物性肉制品的過程中，食品會(huì)產(chǎn)生苯并(a)巧，人和動(dòng)物攝 入苯并(a)巧超出限量的肉制品后會(huì)導(dǎo)致腫瘤和癌變，對(duì)健康造成潛在的威脅。目前，由食 品污染引起的疾病是引起人們廣泛關(guān)注的食品安全問題之一，許多國(guó)家已將苯并(a)巧為 食品有害物質(zhì)監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容之一，如德國(guó)限定肉制品中苯并(a)巧的殘留量為化g/kg，我 國(guó)國(guó)標(biāo)限定肉制品中苯并(a)巧的殘留量應(yīng)在化g/kg W下。已報(bào)道的苯并(a)巧檢測(cè)方法有 液相色譜法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層層析法等，但色譜法、層析法等檢測(cè)方法存在操作繁 瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、結(jié)果分辨性差等缺點(diǎn)。因此，目前許多工作研究者致力于開發(fā)更為快速、準(zhǔn)確的 苯并(a)巧檢測(cè)方法，W提高食品中苯并(a)巧的檢測(cè)效率，同時(shí)要避免出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng) 性的現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)的不足，提供一種用于苯并(a)巧快速檢測(cè)的納米免疫傳 感器的制備方法，還提供一種利用該納米免疫傳感器檢測(cè)食品中苯并(a)巧的方法，本發(fā)明 既具備更加靈敏、快速、易微型化、便于攜帶和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也具備免疫反應(yīng)抗原-抗體結(jié)合的特異性。
[0004] 為解決W上問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明一種用于苯并(a)巧快速檢測(cè)的納米免疫傳感器的制備方法，其特征是，W 玻碳電極為基礎(chǔ)電極，采用聚酷胺-胺樹枝狀大分子結(jié)合聚二締丙基二甲基氯化錠功能化 的石墨締修飾玻碳電極，然后滴涂納米金溶液，納米金經(jīng)靜電吸附作用固定于修飾電極上， 再經(jīng)戊二醒偶聯(lián)固定多環(huán)芳控抗體制備成納米免疫傳感器。
[0006] 所述的用于苯并(a)巧快速檢測(cè)的納米免疫傳感器的制備方法，包括W下步驟：
[0007] a.電極預(yù)處理
[0008] 將玻碳電極用粒徑為0.05皿的氧化侶拋光粉拋光打磨至電極表面呈鏡面，然后用 蒸饋水沖洗干凈，再依次置于體積分?jǐn)?shù)為50%的硝酸、丙酬、去離子水中超聲清洗2min~ 6min，氮?dú)獯蹈桑瑐溆茫?br>[0009] b.聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締復(fù)合物的制備
[0010] 準(zhǔn)確稱取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化錠水溶液(PDDA，體積分 數(shù)為0.25 % )中，超聲處理25min~35min，水洗Ξ次去除過量的石墨締，制得PDDA功能化的 石墨締，取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其濃度為Img/ mL，超聲處理lOmin~20min，得到均勻一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺懸浮 液，備用；
[00川準(zhǔn)確稱取0.02g聚酷胺-胺溶于10m巧醇中，使其濃度為2mg/mL，超聲處理15min~ 25min，得到均勻透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后將聚酷胺-胺的甲醇溶液與PDDA功能化 石墨締的N，N-二甲基甲酯胺懸浮液按1:1混合均勻，超聲處理30min~40min，制得聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締復(fù)合物；
[001^ C.納米金的制備
[0013] 準(zhǔn)確量取50mL O.lmg/血的氯金酸溶液置于燒杯中，用玻璃棒攬拌下加熱至沸騰， 迅速加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的巧樣酸鋼溶液，持續(xù)攬拌至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，得到納 米金溶液；（注：制備納米金使用的玻璃器皿在使用前需經(jīng)銘酸洗液浸泡2地，并沖洗，烘干 處理）。
[0014] d.納米免疫傳感器的制備
[0015] 將步驟a中得到的玻碳電極應(yīng)用Ξ電極系統(tǒng)，即W玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl 電極為參比電極、銷絲電極為輔助電極，在-0.2V~+0.6V的電位區(qū)間，采用LK98BII型微機(jī) 電化學(xué)分析系統(tǒng)W50mV · 的掃描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃 描10圈，對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行活化處理。沖洗玻碳電極后，用移液槍移取3~化L步驟b得到 的聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締復(fù)合物滴涂到玻碳電極表面，于室溫驚干，再移取2~化L 納米金溶液滴涂到修飾的電極表面，于室溫驚干，然后在修飾電極表面滴涂3~化L質(zhì)量分 數(shù)為0.5%的戊二醒溶液活化修飾的電極表面，于4°C條件下活化25~35min，然后用pH為 7.4的0.2111〇1/1憐酸鹽緩沖液沖洗電極，再滴涂3~化1^多環(huán)芳控抗體，并于4°0條件下固定 2h，再滴涂3~扣L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封閉化，用抑為7.4的0.2mol/L 憐酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗干凈，得到苯并(a)巧納米免疫傳感器，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0016] 優(yōu)選的，所述步驟b中聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締復(fù)合物的制備的具體步驟內(nèi) 容為：
[0017] 準(zhǔn)確稱取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化錠水溶液(PDDA，體積分 數(shù)為0.25% )中，超聲處理30min，水洗Ξ次去除過量的石墨締，制得PDDA功能化的石墨締， 取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其濃度為Img/mL，超聲 處理15min，得到均勻一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺懸浮液，備用；
[0018] 準(zhǔn)確稱取0.0?聚酷胺-胺溶于lOmL甲醇中，使其濃度為2mg/mL，超聲處理20min， 得到均勻透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后將聚酷胺-胺的甲醇溶液與PDDA功能化石墨締 的N，N-二甲基甲酯胺懸浮液按1:1混合均勻，超聲處理35min，制得聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締復(fù)合物。
[0019] 優(yōu)選的，所述步驟d中納米免疫傳感器的制備的具體步驟內(nèi)容為：
[0020] 將步驟a中得到的玻碳電極應(yīng)用Ξ電極系統(tǒng)，即W玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl 電極為參比電極、銷絲電極為輔助電極，在-0.2V~+0.6V的電位區(qū)間，采用LK98BII型微機(jī) 電化學(xué)分析系統(tǒng)W50mV · 的掃描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃 描10圈，對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行活化處理。沖洗玻碳電極后，用移液槍移取扣L步驟b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締復(fù)合物滴涂到玻碳電極表面，于室溫驚干，再移取化L納米金溶 液滴涂到修飾的電極表面，于室溫驚干，然后在修飾電極表面滴涂化L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 %的 戊二醒溶液活化修飾的電極表面，于4°C條件下活化30min，然后用抑為7.4的ο. 2mol/L憐酸 鹽緩沖液沖洗電極，再滴涂化L多環(huán)芳控抗體，并于4°C條件下固定化，再滴涂化L質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封閉化，用抑為7.4的0.2mol/L憐酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗干 凈，得到苯并(a)巧納米免疫傳感器，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 使用所述的用于苯并(a)巧快速檢測(cè)的納米免疫傳感器的檢測(cè)方法，包括W下具 體步驟：
[0022] a.標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0023] 取苯并(a)巧標(biāo)準(zhǔn)品加入到lOmL二甲基亞諷中，再用抑為7.4的憐酸鹽緩沖溶液稀 釋至不同濃度梯度，在苯并(a)巧納米免疫傳感器上涂上各個(gè)梯度的上述苯并(a)巧標(biāo)準(zhǔn)品 溶液，室溫下解育15~25min，WAg/AgCl電極為參比電極、銷絲(片）電極為輔助電極，苯并 (a)巧納米免疫傳感器為工作電極，組成Ξ電極測(cè)試系統(tǒng)，在l.Ommol/L K3[Fe(CN)6] + 0.1mol/L KCl+0.2mol/L憐酸鹽緩沖溶液(pH為7.0)進(jìn)行差分脈沖伏安法的檢測(cè)（掃描速度 為50mV · ，電壓范圍為-0.2V~+0.6V); W苯并(a)巧濃度為零時(shí)電流值和各濃度梯度的 電流值的差值為縱坐標(biāo)，苯并(a)巧濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，得到苯并(a)巧的免疫響應(yīng)電流 差值與其濃度之間的線性曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程式，實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行。 [0024] b.測(cè)定
[0025] 將檢測(cè)樣品（肉制品1、11)分別粉碎，肉制品I和II各取lOg樣品，進(jìn)行W下處理，即 加入50mL環(huán)己燒，超聲處理lOmin后過濾到濃縮瓶中，在70°C旋蒸至20血，移入分液漏斗，用 50血二甲基亞諷萃取，再用30血環(huán)己燒提取，棄去環(huán)己燒層，把提取液旋蒸至10血，用5血二 甲基亞諷洗涂濃縮瓶，合并二甲基亞諷，加入15mL水，搖勻后過活化后的Cl姻相萃取小柱抽 干，用30mL正己燒洗脫，收集洗脫液，蒸干后用2mL甲醇定容，經(jīng)0.45皿濾膜過濾，備用；用 LK98BII型微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)來(lái)測(cè)定所述的差分脈沖伏安圖，分別進(jìn)行Ξ次測(cè)量并記錄 差分脈沖伏安圖，按線性回歸方程式計(jì)算其苯并(a)巧的濃度，此過程在室溫條件下下進(jìn) 行。
[0026] 優(yōu)選的，所述的用于苯并(a)巧快速檢測(cè)的納米免疫傳感器的檢測(cè)方法，所述步驟 a中，在苯并(a)巧納米免疫傳感器上涂上各個(gè)梯度的苯并(a)巧標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，室溫下解育 時(shí)間為20min。
[0027] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下顯著的優(yōu)點(diǎn)：
[0028] ①本發(fā)明的納米免疫傳感器用于檢測(cè)肉制品中的苯并(a)巧法與國(guó)標(biāo)法相比，縮 短了苯并(a)巧的檢驗(yàn)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
[0029] ②簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，同時(shí)不限制樣品提取液的顏色。
[0030] ③利用PDDA功能化石墨締與納米金間正負(fù)電荷吸引，提高