的熒光吸收光譜圖， 從圖中可以看出488nm處的熒光吸收峰紅移在518nm處出現(xiàn)一個新的熒光吸收峰，同時熒 光吸收光譜中577nm處熒光吸收峰隨銅離子濃度的增加而逐漸減小，確定熒光強度與銅離 子濃度的定量關(guān)系并制作標準曲線(如圖4)，其中檢測限（L0D)由方程式L0D=KSyS給出， K=3, &為空白測定的標準偏差（n=6)，S是工作曲線的靈敏度，有關(guān)分析參數(shù)列于表1。由 表1和圖4可知該檢測方法具有很好的線性關(guān)系和較高的分析靈敏度，該檢測方法的最低 檢測下限是lXl〇smol/L。
[0019] 表1不同濃度銅離子的分析參數(shù)
實施例3 在多個10mL的比色管中分別加入lmL磷酸鹽緩沖溶液，再分別加入0.0 lmL摩爾濃度 為1. 0 X 10 3mol/L的1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲的DMF-H20溶液，然后分別加入摩 爾濃度均為1. ox 10 3mol/L的不同金屬離子的標配溶液（Na+、K+、Ca2+、Mg 2+、Ni3+、Mn2+、Zn2+、 Ba2+、Fe3+、Co2+、Cd2+、Pb 2+、Ag2+、Hg2+等不同離子)，用去離子水定容至10mL，搖勻后測定各溶 液的熒光強度(如圖5)，結(jié)果表明當同樣濃度的各種金屬離子分別與探針分子ESN作用時， 只有Cu2+的加入使混合體系在577nm處熒光強度降低發(fā)生熒光淬滅，而其它金屬離子與探 針分子作用時，相比較于空白樣品，其熒光強度沒有明顯變化。表明探針分子ESN對銅離子 的識別具有很好的選擇性。
[0020] 實施例4 本實施例進一步考察了 ESN對銅離子傳感的熒光選擇性，嘗試了環(huán)境水樣中可能存在 的各種金屬離子與銅離子共存時對體系熒光強度的影響。在圖6中，標記為none的組分 為僅含1. 0X 10 5mol/L銅離子時體系的熒光強度，其余為同等濃度銅離子與各種不同濃度 倍數(shù)的其它金屬離子共存時體系的熒光強度，由左至右金屬離子濃度為銅離子濃度的倍數(shù) 分別如下：K+ (100 倍）、Na+ (100 倍）、Ca2+ (100 倍）、Mg2+ (100 倍）、Ni3+ (100 倍）、Mn2+ ( 20 倍）、Zn2+ (20 倍）、Ba2+ ( 20 倍）、Fe3+ (10 倍）、Co2+ (20 倍）、Cd2+ (20 倍）、Pb2+ (50 倍）、Ag2+ (10 倍）和Hg2+(5倍）。由圖可知，ESN對銅離子的響應除略受Ag+和Hg2+的影響外，基本不受 其它共存金屬離子的干擾，具有良好的選擇性。
[0021] 實施例5 縮氨基硫脲基團可以與重金屬汞離子發(fā)生配合作用，使探針分子的熒光發(fā)生淬滅，氮 原子易與銅離子配位，縮氨基硫脲基團中有C=N和C=S雙鍵，而羥基蒽醌與縮氨基硫脲基團 可以形成大的共輒體系，質(zhì)子可以在分子內(nèi)轉(zhuǎn)移形成熒光吸收峰。而體系加入銅離子后，與 C=N鍵上的氮原子絡合配位，氧原子和氮原子、硫原子與銅離子都有一定的絡合作用，阻斷 了質(zhì)子在共輒體系內(nèi)的傳遞，使得蒽醌化合物的熒光強度減弱，發(fā)生熒光淬滅，當銅離子濃 度與探針分子濃度達到1:1時，熒光淬滅的強度達到一個穩(wěn)定值。
[0022] Cu2+與ESN的絡合作用 從實驗數(shù)據(jù)我們可以看出，當加入銅離子濃度與探針分子ESN濃度逐漸達到1:1時，熒 光淬滅的變化值達到穩(wěn)定(如圖7)。
[0023] 實施例6 本實施例將探針分子ESN用于動物腎上皮細胞MDCK (正常細胞）中銅離子的檢測， 將MDCK細胞株解凍后置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24-48h，分別置于六孔培養(yǎng)皿中，每孔內(nèi)容有3mL DMEM培養(yǎng)液，配制摩爾濃度為50 μ Μ的硝酸銅溶液和摩爾濃度為100 μ Μ的探針分子ESN溶 液。取一定的量的硝酸銅溶液分別置于培養(yǎng)板的各孔中，與細胞溶液混合均勻后，置于恒溫 箱中培養(yǎng)12h后，分別用PBS (phosphate-bufferedsaline)沖洗培養(yǎng)皿里的細胞，沖洗干 凈后，加入新鮮的培養(yǎng)液，然后加入處理好的探針分子ESN溶液，放入恒溫箱中0. 5h后，取 出培養(yǎng)皿，再用新鮮PBS沖洗干凈后立即進行聚焦激光掃描顯微鏡的檢測。圖8是MDCK細 胞的激光共聚焦顯微鏡照片，其中A為暗場MDCK細胞熒光圖，B為亮場MDCK細胞熒光圖，從 激光共聚焦顯微鏡照片可知MDCK細胞自身沒有熒光，探針分子ESN進入細胞后儀器可檢測 出細胞的熒光，而在加入銅離子后細胞的熒光被銅離子迅速淬滅減弱，聚焦激光顯微鏡能 夠清楚地捕捉到這個過程(如圖9,其中A為加入探針分子ESN的激光共聚焦顯微鏡照片，B 為繼續(xù)加入銅離子后的激光共聚焦顯微鏡照片)。
[0024] 以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術(shù)人員應該 了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原 理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入 本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種利用1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲化合物作為熒光探針檢測銅 離子的方法，其特征在于該1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲化合物的結(jié)構(gòu)式為：具體檢測步驟為：（1)在多個IOmL的比色管中分別加入ImL 磷酸鹽緩沖溶液，再分別加入〇. OlmL摩爾濃度為I. 0 X 10 3mol/L的1，4-二羥基-9, 10-蒽 醌縮氨基硫脲的DMF-H2O溶液，然后分別加入不同濃度的銅離子溶液，用去離子水定容 至10mL，搖勻后測定各溶液的熒光強度，確定熒光強度與銅離子濃度的定量關(guān)系并制作 標準曲線；（2)在IOmL的比色管中加入ImL磷酸鹽緩沖溶液，再加入0.0 lmL摩爾濃度為 1.0 X 10 3mol/L的1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲的DMF-H2O溶液，然后加入待測溶 液，用去離子水定容至10mL，搖勻后測定待測溶液的熒光強度，根據(jù)熒光強度與銅離子濃度 的定量關(guān)系確定待測溶液中銅離子的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲化合物作為熒光探 針檢測銅離子的方法，其特征在于：所述的磷酸鹽緩沖溶液為pH=7. 2的Ν&2ΗΡ04-Ν&Η2Ρ(^φ 系。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲化合物作為熒光探 針檢測銅離子的方法，其特征在于：所述的DMF-H2O溶劑中DMF與H 2O的體積比為1:99。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲化合物作為熒光探 針檢測銅離子的方法，其特征在于：搖勻混合作用至少25min后測定溶液的熒光強度。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用1，4-二羥基-9, 10-蒽醌縮氨基硫脲化合物作為熒光 探針檢測銅離子的方法，其特征在于：所述的熒光強度測定條件為激發(fā)狹縫5nm，發(fā)射狹縫 10nm，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長577nm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用1,4-二羥基-9,10-蒽醌縮氨基硫脲化合物作為熒光探針檢測銅離子的方法，屬于光分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過實驗考察研究了1,4-二羥基-9,10-蒽醌縮氨基硫脲化合物與多種金屬離子的識別作用，發(fā)現(xiàn)探針分子ESN對銅離子具有很好的選擇性識別作用，且羥基與水的溶解性使得探針分子能夠在水溶液中實現(xiàn)對銅離子的熒光識別，并在生理pH值條件下達到較好的結(jié)果，該方法綠色，對銅離子選擇性專一，靈敏度也比較高，且在較短反應時間內(nèi)起到熒光淬滅作用，該探針分子能夠成功應用于生物活細胞內(nèi)的銅離子檢測。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105352920
【申請?zhí)枴緾N201510641183
【發(fā)明人】時蕾, 潘峰, 劉統(tǒng)信, 麻娜娜, 張貴生, 劉青峰
【申請人】河南師范大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年10月8日