一種基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于材料制備和分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及PS小球溶劑揮發(fā)自組裝制備蛋白石 結(jié)構(gòu)光子晶體的方法，尤其涉及一種基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器的制備及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 光子帶隙是光子晶體最重要的特征。光子晶體具有和半導(dǎo)體相似的結(jié)構(gòu)，只是將 半導(dǎo)體中周期變化的原子變成了周期變化的兩種不同介電常數(shù)的介質(zhì)材料。和半導(dǎo)體材料 一樣，介電常數(shù)的周期性排列產(chǎn)生了一定的"勢(shì)場(chǎng)"，當(dāng)兩種材料的介電常數(shù)相差足夠大時(shí)， 在電介質(zhì)界面上會(huì)出現(xiàn)布拉格散射，產(chǎn)生光子帶隙，能量落在帶隙重的光將不能傳播。兩種 介質(zhì)材料的介電常數(shù)比（或折射率比）越大，布拉格散射越強(qiáng)烈，就越有可能出現(xiàn)光子帶 隙。
[0003] 重金屬汞離子在水體中的污染日益引起人們的關(guān)注，其經(jīng)過(guò)食物鏈的生物放大作 用，進(jìn)入人體積累在腦、肝和其他器官中，產(chǎn)生慢性中毒，損害腎、腦、胃和腸道，而且能夠引 起神經(jīng)紊亂，甚至引起死亡。另外，Hg2+能與酶中的氨基、二巰基、羧基、羥基以及細(xì)胞膜內(nèi)的 磷酰基結(jié)合，使酶失活，造成功能和結(jié)構(gòu)損傷，從而阻礙細(xì)胞的生物活性和正常代謝。傳統(tǒng) 的痕量Hg2+檢測(cè)方法主要有原子吸收、電感耦合等離子體發(fā)射光譜、化學(xué)法（沉淀滴定及元 素分析等）、電導(dǎo)檢測(cè)法（電導(dǎo)率測(cè)定及電位滴定法）、光譜檢測(cè)法（熒光及紫外-可見光 吸收檢測(cè)法）和等離子體質(zhì)譜等技術(shù)。然而，這些方法普遍存在檢測(cè)過(guò)程繁瑣、儀器昂貴、 運(yùn)行費(fèi)用高、復(fù)雜的樣品預(yù)處理、需要專業(yè)操作人員等缺點(diǎn)，并不適合現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)和連續(xù) 在線分析。
[0004] 以光子晶體作為布拉格反射鏡面實(shí)現(xiàn)熒光材料的固態(tài)熒光增強(qiáng)。通過(guò)共聚物乳膠 微球的豎直沉積自組裝，在玻璃基底上制備了具有不同光子禁帶的蛋白石（Opal)型光子 晶體，選擇發(fā)射波長(zhǎng)在光子禁帶范圍內(nèi)的有機(jī)熒光染料，由于有機(jī)染料的發(fā)射波長(zhǎng)在光子 禁帶范圍內(nèi)，當(dāng)其受到激發(fā)時(shí)發(fā)射的熒光會(huì)被光子晶體沿禁帶方向反射而不能透過(guò)光子 晶體，因而有機(jī)染料在光晶表面的熒光要比無(wú)光晶結(jié)構(gòu)的玻璃表面明顯的增強(qiáng)。研究表明， Hg2+能介導(dǎo)胸腺啼啶（T)配對(duì)，形成T-Hg 2+-T復(fù)合物，其穩(wěn)定性比正常的Watson-Crick堿 基對(duì)還要穩(wěn)定?；诖颂匦裕ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)特殊的結(jié)構(gòu)，結(jié)合熒光猝滅、納米金凝聚比色、熒光能 量轉(zhuǎn)移、電化學(xué)開關(guān)等信號(hào)傳導(dǎo)模式，近年來(lái)發(fā)展了一系列簡(jiǎn)單快速的均相檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：針對(duì)檢測(cè)分析的高靈敏度、高選擇性需求，提供了一種基于光子 晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的主要目標(biāo)是構(gòu)建一個(gè)基于光子晶體增強(qiáng)熒光的檢測(cè)平臺(tái)，與傳統(tǒng)的核酸 探針傳感器相比，通過(guò)信號(hào)的放大而實(shí)現(xiàn)提高傳感器的靈敏度。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器，由光子晶體、核酸熒光分子探針和 互補(bǔ)核酸序列構(gòu)成。首先合成聚苯乙烯微球或者采用改進(jìn)的StOber法制備Si02球形顆 粒，再采用垂直沉積自組裝法合成Opal光子晶體，噴金后修飾核酸熒光分子探針，通過(guò) T-Hg2+_T的鍵合作用于互補(bǔ)序列配對(duì)，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)Hg2+的目的。包括如下步驟：
[0009] 1、聚苯乙烯微球的合成
[0010] 將一定量純化后的苯乙烯倒入分液漏斗中，依次用NaOH溶液和超純水洗滌，再用 無(wú)水氯化鈣將殘留少量水除去，最后減壓蒸餾得到純化的苯乙烯。室溫下，將苯乙烯單體、 甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超純水和十二烷基苯磺酸鈉一起加入三口燒瓶，攪拌，水浴 加熱后滴加過(guò)硫酸銨，恒溫反應(yīng)12h，最后用冰浴冷卻至室溫，結(jié)束反應(yīng)得到乳白色聚苯乙 烯微球乳液。
[0011] 將苯乙烯單體、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸和十二烷基苯磺酸鈉加入三口瓶后， 調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速為650r/min。水浴加熱到60°C，20min后將過(guò)硫酸銨滴加完畢并調(diào)整水浴加 熱到80°C，恒溫反應(yīng)12h，最后用冰浴冷卻至室溫。整個(gè)反應(yīng)始終在勻速攪拌下進(jìn)行，溫度 控制在（80 ±2) °C。
[0012] Opal光子晶體的組裝也可以是不同粒徑的Si02小球，采用改進(jìn)的StOber法制備 Si0#_形顆粒，通過(guò)調(diào)整氨水和無(wú)水乙醇的比制備不同粒徑的Si02，進(jìn)一步組裝成不同禁 帶的光子晶體，選取相應(yīng)的熒光染料。
[0013] 2、垂直沉積自組裝法合成Opal光子晶體
[0014] 用制得的聚苯乙烯微球乳液，在恒溫恒濕箱中于溫度50°C -70°C，濕度50-70%的 條件下，采用垂直沉積自組裝的方法，將乳膠球沉積在處理好的玻璃片基底上形成規(guī)整的 蛋白石光子晶體薄膜。
[0015] 玻璃片是通過(guò)將載玻片切割成1X3. 5cm2的玻璃片，然后配制體積比為3:1的濃 硫酸（97% )雙氧水（30% )混合溶液，將玻璃片浸泡其中10分鐘以充分清洗玻璃片表面 的污染物（應(yīng)該向雙氧水中注入濃硫酸，此反應(yīng)非常劇烈，應(yīng)在通風(fēng)廚中操作，并戴好防護(hù) 用具）。之后將酸液回收，用大量去離子水沖洗玻璃片，再分別用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醇 超聲清洗10分鐘，最后用氮?dú)獯蹈?，放置于干燥、溫暖、避光的環(huán)境中。
[0016] 3、利用磁控派射儀在光子晶體薄膜表面噴射金，將噴有金的光子晶體浸泡在含有 DNA適配體的溶液中l(wèi)h,然后用去離子水洗滌N2干燥。
[0017] 將100uM的DNA適配體溶液稀釋為10nM的DNA，具體做法是：取luL 100uM的DNA 適配體溶液加10mL無(wú)菌水即得10nM的DNA。
[0018] 4、將上述光子晶體浸泡在含有Hg2+和互補(bǔ)核酸的溶液中40min,然后用去離子水 洗滌N2干燥。
[0019] 含有Hg2+和互補(bǔ)核酸的溶液的配置：
[0020] 首先將ImM的Hg2+溶液稀釋為luM的Hg 2+溶液，具體做法是：稱取固體 HgCl22. 715g,加10mL無(wú)菌水即配成ImM Hg2+溶液，然后取10uL ImM Hg2+溶液，加10mL無(wú) 菌水即配成luM Hg2+溶液，取luL 100uM互補(bǔ)核酸序列溶液加入已配好luM Hg2+溶液中，最 終得到10nM的互補(bǔ)核酸序列一一Hg2+溶液。
[0021] 本發(fā)明的還提供另一種基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感的制備方法，具體包 括以下步驟：
[0022] 步驟1. Si02微球的合成：
[0023] 1. 1將一定量的TE0S與無(wú)水乙醇混合，超聲得到均勻的TE0S溶液，備用；
[0024] 1. 2將步驟1. 1得到的TE0S溶液加入到一定量的氨水和的無(wú)水乙醇和水混合的 溶液中，磁力攪拌2h，離心洗滌，水洗、乙醇洗各2次，60°C在真空干燥箱中干燥24h~48h 即得到Si02微球；
[0025] 步驟2.垂直沉積自組裝法合成Opal光子晶體：
[0026] 將步驟1制備的聚苯乙烯微球乳液，置于恒溫恒濕箱中在溫度為50°C _70°C，濕度 50-70%的條件下，采用垂直沉積自組裝的方法，將聚苯乙烯微球乳沉積在基底上形成規(guī)整 的蛋白石光子晶體薄膜；
[0027] 步驟3.利用磁控濺射儀在步驟2制備得到的光子晶體薄膜表面噴射金，將噴有 金的光子晶體浸泡在含有核酸熒光分子探針的溶液中，靜置〇. 8-1. 2h，然后用去離子水洗 滌，N2干燥，得到連接有核酸熒光分子探針的光子晶體；
[0028] 步驟4.將步驟3所得光子晶體浸泡在含有Hg2+和互補(bǔ)核酸的溶液中35_50min， 然后用去離子水洗滌N2干燥，基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器。
[0029] 進(jìn)一步，所述的基底為玻璃、石英或云母中的一種。
[0030] 進(jìn)一步，所述步驟3中，所述核酸熒光分子探針通過(guò)5 '端修飾的巰基（SH)連接 在噴有金的光子晶體表面。
[0031] 進(jìn)一步，所述步驟4中，所述光子晶體上的核酸熒光分子探針含有25個(gè)堿基，從 3 ^端開始的10、13、16堿基位點(diǎn)為胸腺嘧啶⑴與含有Hg2+和互補(bǔ)核酸5 '端開始的4、 7、10堿基位點(diǎn)胸腺嘧啶（T)通過(guò)T-Hg2+-T鍵合完全堿基互補(bǔ)。
[0032] 進(jìn)一步，所述TE0S與無(wú)水乙醇的體積比為1:10,所述氨水、無(wú)水乙醇和水的體積 比為 1:3-7 :1-5。
[0033] 上述制備的基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器在汞離子熒光檢測(cè)中應(yīng)用。
[0034] 5、通過(guò)熒光發(fā)射光譜圖得到其熒光強(qiáng)度曲線示意圖，熒光強(qiáng)度達(dá)到200。
[0035] 在不同禁帶的光子晶體上修飾核酸熒光分子探針（其中熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)在 其中一種光子晶體的禁帶范圍內(nèi)），比較其熒光發(fā)射光譜圖上的熒光強(qiáng)度。
[0036] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯而易見的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn)：
[0037] 1、通過(guò)光子晶體增強(qiáng)熒光的效果，增強(qiáng)了熒光探針檢測(cè)信號(hào)，提高了檢測(cè)的靈敏 性，減小了最低檢測(cè)濃度和檢測(cè)限。
[0038] 2、結(jié)合單堿基錯(cuò)配原理和與胸腺嘧啶（T)間高特異的親和作用設(shè)計(jì)傳感器，具有 高的檢測(cè)選擇性，可在100倍高濃度雜離子存在下檢測(cè)Hg2+。
[0039] 3、利用Au-S自組裝原理制備傳感界面，簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。
[0040] 4、構(gòu)建了一個(gè)基于光子晶體增強(qiáng)熒光的檢測(cè)平臺(tái)，不僅可以檢測(cè)金屬離子，也可 以檢測(cè)病毒及DNA、RNA等核酸類物質(zhì)。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1是本發(fā)明基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器示意圖。
[0042] 圖2-3是本發(fā)明實(shí)施例2所制備的光子晶體的禁帶波長(zhǎng)。
[0043] 圖4-5是本發(fā)明實(shí)施例2所制備的基于光子晶體增強(qiáng)熒光的汞離子傳感器的熒 光發(fā)射光譜（圖4光子晶體禁帶在646-656之間，圖5光子晶體禁帶在798-799之間）。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面結(jié)合具體是實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 1)采用改進(jìn)的StOber法制備SiOJ#形顆粒，通過(guò)調(diào)整氨水和無(wú)水乙醇的比制備 不同粒徑的Si02。將一定量的正硅酸乙酯（TE0S)與無(wú)水乙醇混合，超聲得到均勻的TE0S 溶液，將上述TE0S溶液加入到一定量的氨水和不同配比的無(wú)水乙醇和水混合的溶液中，磁 力攪拌2h，離心洗滌（水洗、乙醇洗各2次），60°C在真空干燥箱中干燥24h即得到SiOjj 球。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0048] 2)垂直沉積自組裝法合成Opal光子晶體
[0049] 將玻璃片分別于丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗20min，然后置于混合溶液 (H2S<VFP Η 202的體積比為3:1)浸泡一夜。用去離子水沖洗玻璃片，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蟠怪苯?入Si02膠體球溶液中，在恒溫恒濕箱中于60°C自然干燥。
[0050] 3)利用磁控派射儀在光子晶體薄膜表面噴射金，將噴有金的光子晶體浸泡在含有 DNA適配體的溶液中l(wèi)h，然后用去離子水洗滌N2干燥。所用核酸熒光分子探針為單鏈DNA， 熒光基團(tuán)為RhodamineB，核酸熒光分子探針的DNA鏈為（5 '端至3 '端）：
[0051] SH-CCTACTAATGA