，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%吐溫-20，0.01mol/L 的 PBST, pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0022]基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測噻唑烷酮的酶聯(lián)免疫試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標板XI塊；
(2)標準液X 6 瓶:(lmL/瓶)0 ppm、5 ng/mL、15 ng/mL、45 ng/mL、135 ng/mL、405ng/mL ；
(3)抗體工作液12 mL ;
(4)酶標二抗工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)終止液7 mL ； (8)10X濃縮稀釋液 40 mL;
(9)10X濃縮洗滌液 40 mL;
本發(fā)明的試劑盒用于檢測樣品中噻唑烷酮殘留量時，通過以下步驟實施:樣品預處理、用本發(fā)明試劑盒進行檢測、分析結(jié)果。
[0023](1)樣品預處理
配制樣品復溶液(乙腈:甲醇=4:1)研磨代表性樣品，研磨成粉。稱量2 g研磨過后的樣品加入6 mL樣品復溶液，樣品稀釋比為1:3(w/v);在密封的容器里混合，震蕩渦旋1 min;以4000r/min,離心lOmin.取上清液進行分析。
[0024](2)用本發(fā)明試劑盒檢測待測樣品中噻唑烷酮殘留量
取包被有噻唑烷酮抗原的酶標板，加標準品/樣本30 μ L/孔到對應的微孔中，加入噻唑烷酮抗體工作液，70 μ L/孔，然后加入噻唑烷酮酶標二抗工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°c避光環(huán)境中反應30 min ;小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體思干，用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；加入底物液A 50 μ?7孔，底物液B 50 μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應15 min ;加入終止液50 μ?/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；對比待測樣品與標準品的吸光度值大小，定量分析待測樣品中噻唑烷酮殘留量。
[0025](3)分析結(jié)果
百分吸光度值的計算，標準品或樣本的百分吸光度值等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B。一0 ppb標準溶液的平均吸光度值。
[0026]以噻唑烷酮的標準品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標，標準品百分吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，求出直線方程。將樣本的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中噻唑烷酮的實際濃度。
【主權項】
1.檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括酶標板、噻唑烷酮類標準品、噻唑烷酮類抗體工作液、噻唑烷酮類酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。2.檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括以下步驟:酶標板的制備、噻唑烷酮類標準品的制作、噻唑烷酮類單克隆抗體及其工作液的制備、噻唑烷酮類酶標二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。3.根據(jù)權利要求2所述檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的噻唑烷酮類包被抗原是將噻唑烷酮類半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將噻唑烷酮類抗原稀釋成1:20000比例，100 μ L/孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液250 μ!7孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。4.根據(jù)權利要求2所述檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的噻唑燒酮類標準品濃度分別為0 ng/mL、5 ng/mL、15 ng/mL、45 ng/mL、135ng/mL、405ng/mLo5.根據(jù)權利要求2所述檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的噻唑烷酮類蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體是采用噻唑烷酮類人工抗原免疫兔所得，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:60000。6.根據(jù)權利要求2所述檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的噻唑烷酮類酶標二抗工作液用酶標二抗稀釋液稀釋成1:1000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01 mol/L的PBST, pH值范圍7.0-7.5之間。7.權利要求2所述的檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，基于抗原抗體進行間接競爭酶聯(lián)免疫反應，該方法包括以下步驟: (1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液工作液中； (2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻； (3)取包被有噻唑烷酮類抗原的酶標板，加標準品/樣本30μ L/孔到對應的微孔中； (4)加入噻唑烷酮類抗體工作液，70μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應30 min;小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；再加酶標二抗工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應30 min;小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)； (5)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應15?20 min ； (6)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))； (7)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數(shù)值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中噻唑烷酮類的含量。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，所述處理后的樣品是經(jīng)過以下處理的樣品: (1)配制樣品復溶液(乙腈:甲醇=4:1)； (2)研磨代表性樣品，研磨成粉； (3)稱量2g研磨過后的樣品加入6 mL樣品復溶液，樣品稀釋比為1:3(w/v)； (4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋1min ；(5)以4000r/min,離心 lOmin ； (6)取上清液進行分析。
【專利摘要】本發(fā)明為檢測噻唑烷酮類的ELISA試劑盒的制備及其檢測方法，其檢測靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。所述試劑盒包括：包被了噻唑烷酮類抗原的酶標板、噻唑烷酮類標準品、噻唑烷酮類抗體工作液、噻唑烷酮類酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮樣品稀釋液和濃縮洗滌液。噻唑烷酮類檢測試劑盒的原理是固相間接競爭酶聯(lián)免疫反應，把提取的樣品、酶標二抗工作液和抗體工作液加入對應的酶標孔中，孵育一段時間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里將會出現(xiàn)藍色，加入終止液，顏色由藍色變?yōu)辄S色。顯色的深淺與標準品或樣品中噻唑烷酮類的含量成反比例關系。該方法可直接用于檢測保健品中的噻唑烷酮類含量。
【IPC分類】G01N1/28, G01N33/535, G01N33/64
【公開號】CN105277685
【申請?zhí)枴緾N201410356907
【發(fā)明人】洪霞, 毛楠楠
【申請人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月25日