一種基于尿中本膽烷醇酮檢測新型睪酮興奮劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于尿中本膽烷醇酮檢測新型睪酮興奮劑的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢測 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 反興奮劑技術(shù)的進(jìn)步保障了競技體育的健康持續(xù)發(fā)展，興奮劑檢測的實施必須嚴(yán) 格遵循世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WorldAnti-DopingAgency,WADA)公布的禁用物質(zhì)檢測規(guī)則。
[0003] 睪酮是經(jīng)常被使用的一種內(nèi)源性類固醇興奮劑。人體自身所分泌的睪酮與藥用睪 酮化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，但研究表明，藥用睪酮與人體分泌的睪酮的碳元素同位素比（ 13c/12c，單 位為％ )不同。藥用睪酮的13C/12C值低于-27%。，而人體自身分泌的睪酮，13C/12C值范圍 為-16. 7%。至-25. 8%。，當(dāng)人體服用藥用睪酮后，13C/12C值會降低。因此，WADA規(guī)定使用同 位素比質(zhì)譜（Isotoperatiomassspectrometry,IRMS)測定碳元素同位素比值（13C/12C， 單位為％ )，以區(qū)分人體分泌的睪酮與體外攝入的藥用睪酮，氣相色譜/燃燒爐/同位素比 質(zhì)譜（gas-chromatography/combustion/isotoperatiomassspectrometry,GC/C/IRMS) 可測定同位素比，以S值（％。）表示。
[0004] 現(xiàn)有研究表明，在碳3位上13C標(biāo)記的睪酮有商品出售，它與藥用睪酮混合后可以 組成一種新型睪酮興奮劑，當(dāng)使用此種新型睪酮興奮劑后， 13c/12c值值）落入人體分泌 的睪酮的13c/12c值值）范圍內(nèi)。因此，已有的檢測方法無法檢測這種新型睪酮興奮劑 了。
[0005] 目前，有基于雄酮的方法用于此種新型睪酮興奮劑的檢測。但是當(dāng)人體攝入多種 藥物，會導(dǎo)致尿樣成分的多樣性及復(fù)雜性。此時檢測尿樣中雄酮時，因干擾因素的存在，會 影響檢測結(jié)果。因此，對此種新型睪酮興奮劑應(yīng)該開發(fā)新的檢測方法，以適應(yīng)不同的檢測情 況。
[0006] 本膽燒醇酮（Etiocholanolone)，別名：還原尿睪酮， 5 0 -androstan-3a-〇l-17-〇ne，分子式：C19H3Q02,為睪酮在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在尿液中與 葡萄糖醛酸結(jié)合，生成本膽烷醇酮葡萄糖醛酸甙，被排出體外，本膽烷醇酮的結(jié)構(gòu)如下：
[0007]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于尿中本膽烷醇酮檢測新型睪酮興奮 劑的方法，用于新型睪酮興奮劑的檢測，本方法檢測靈敏，準(zhǔn)確性高。
[0009] 本申請發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，尿樣中本膽烷醇酮葡萄糖醛酸甙濃度較大，靈敏度 較高，與其它代謝物相比具有較便捷的操作性，并且它是睪酮在人尿中的代謝產(chǎn)物，可以用 于新型睪酮興奮劑的檢測，檢測的關(guān)鍵在于將尿樣中高靈敏度的本膽烷醇酮提取出來，并 將其分子中C-3位標(biāo)記的13C消除，生成新化合物A-失碳-5 0 -雄甾烷-2,17-二酮（A-no r-5 0 -androstane-2, 17-dione)。本申請發(fā)明人經(jīng)研究證實，消除3位碳前后的兩個化合物 的13C/ 12C值值）產(chǎn)生較大差異，利用此特性可以檢測新型睪酮興奮劑。
[0010] 本申請發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，將尿樣中本膽烷醇酮反應(yīng)生成 A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione的方法中，操作條件十分重要，為了得到高產(chǎn)率的新化 合物A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione，需嚴(yán)格遵守所用化學(xué)試劑、化學(xué)試劑用量和操作 步驟。
[0011] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種基于尿中本膽烷醇酮檢測新型睪 酮興奮劑的方法，包括：
[0012] 取尿樣6mL，加入lmLpH= 7. 0的磷酸鹽緩沖液和50yL0 -葡萄糖醛酸甙酶溶 液，混勾，在55°C恒溫水浴中酶解3小時，取出，加入8mL叔丁基甲醚振蕩萃取，離心，吸取 上層有機(jī)溶液，在65°C加熱的情況下用氮氣吹干，再用50yL100%乙腈溶劑溶解，轉(zhuǎn)入 樣品瓶中，封蓋，以HPLC純化，收集24-25分鐘含有本膽烷醇酮的流出液lmL，取50yL的 流出液，在60°C加熱的情況下用氮氣吹干，采用同位素比質(zhì)譜儀分析其碳元素同位素比 (13C/12C)，得本膽烷醇酮的S:值，余下的流出液在60°C加熱的情況下用氮氣吹干，得本膽 烷醇酮；
[0013] 取上述制備的本膽烷醇酮，加入4yL冰醋酸及16yL氧化劑，在68°C保持1小時， 再升溫至90°C保持1小時，得反應(yīng)液，反應(yīng)液用50yL012(：12提取兩次，合并提取液，提 取液用氮氣吹干后，加入20mg無水碳酸鈉及10yL醋酐，在120°C保持2.5小時后，用氮氣 吹干，再加入超純水分散殘渣，用50yLCH2C12提取，有機(jī)層在60°C加熱的情況下用氮氣吹 干，得到A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione，采用同位素比質(zhì)譜儀分析其碳元素同位素比 (13C/12C)，得A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione的52值；
[0014]考察本膽燒醇酮的 5i值與A-nor-5 0-androstane-2, 17-dione的 52值，如 S「S2的差值大于2. 8%。，則表明尿樣為使用新型睪酮興奮劑的尿樣。
[0015] 將差值界限設(shè)為2. 8%。，依據(jù)WADA技術(shù)文件（WADATechnical Document,Availablefrom:https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medic ine/td2014-irms)，檢測誤差為±2. 8%。，取其絕對值為2. 8%〇。
[0016] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0017] 進(jìn)一步，所述HPLC純化的步驟為：進(jìn)樣量為45yL，色譜柱為Z0RBAXSB-C18， 規(guī)格為4. 6mmX250mmX5ym，流動相為乙腈-水系統(tǒng)，洗脫起始流動相體積比為：30 %乙 腈-70%水，等梯度洗脫，于40分鐘內(nèi)完成至流動相為100%乙腈，流速為lmL/min。
[0018] 進(jìn)一步，所述氧化劑由13. 5g的鉻酐、500mL的H20和40mL質(zhì)量濃度70 %的H2S04 組成。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明提供一種基于尿中本膽烷醇酮檢測新型睪酮興奮劑的方法，適用于摻有13C 標(biāo)記的新型睪酮興奮劑，主要是基于尿樣中本膽烷醇酮進(jìn)行檢測，本方法檢測靈敏，準(zhǔn)確性 尚。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1中A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione對照品的GC總離子流圖；
[0022] 圖2為實施例1中A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione對照品的MS質(zhì)譜圖譜；
[0023] 圖3為實施例1中由尿樣中本膽烷醇酮制備的 A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione的GC總離子流圖。
[0024] 圖4為實施例1中由尿樣中本膽烷醇酮制備的 A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione的MS質(zhì)譜圖譜。
【具體實施方式】
[0025] 以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。
[0026] 下面實施例所用A-nor-5 0 -androstane-2, 17-dione對照品由復(fù)旦大學(xué)贈送。
[0027] 實施例1
[0028] -、儀器設(shè)備
[0029] 十萬分之一電子天平：Satorious公司，瑞士；
[0030] 離心機(jī)：LD5_2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；
[0031] 吹氮頭：北京市朝陽區(qū)洼里醫(yī)療器械廠；
[0032] 快速漩渦混勻器：深圳國華公司；
[0033]超純水制備儀：Milli-Q，MILLIP0RE公司；
[0034]氣相色譜 / 質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS) :HP6890/5973,AgilentTechnologies;
[0035]高效液相色譜儀（HPLC):Waters2796 ;自動收集器：WatersFractionCollector III，Waters公司；
[0036]氣相色譜/燃燒爐/ 同位素比質(zhì)譜儀（GC/C/IRMS):DELTAV，ThermoScientific。
[0037] 二、試劑
[0038] 磷酸鹽緩沖液：在0. 2mol/l磷酸二氫鉀水溶液中，逐漸加入0. 2mol/l磷酸氫二鉀 水溶液，用pH計檢測pH值，直至pH= 7. 0。
[0039] 0 _葡萄糖醛酸戒酶（購自Sigma-Aldrich公司）溶液：取0 -葡萄糖醛酸戒酶 0-GlucuronidasefromE.coliIX-A型（Sigma)適量，溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制成 50, 000unit/mL的溶液，置-4°C冰箱保存，備用。
[0040] 三、儀器操作條件
[0041] GC/MS儀器操作條件
[0042] 色譜柱及升溫程序：HP-5毛細(xì)管色譜柱，30mX0. 2mmi.d.X0. 33ym，起始溫度 為160°C，保持1分鐘，以每分鐘6. 5°C的速率升溫至260°C，再以每分鐘3°C的速率升溫至 285 °C，保持3分鐘；
[0043]接 口溫度：300°C;
[0044] 采用恒流模式，柱流速：lmL/min;
[0045] 不分流；
[0046]進(jìn)樣 1yL;
[0047] 質(zhì)譜離子源為EI源，70eV;
[0048] 采集模式：SCAN方式，采集質(zhì)量范圍：5-500amu。
[0049]GC/C/IRMS儀器操作條件
[0050] 色譜柱及升溫程序：HP-5毛細(xì)管色譜柱，25mX0. 2mmi.d.X0. 33ym，升溫程序 為：起始溫度為180 °C，保持1分鐘，以每分鐘6 °C的速率升溫至255 °C，再以每分鐘3 °C的速 率升溫至285 °C，保持3分鐘；
[0051] 進(jìn)樣口溫度：280°C ;不分流；進(jìn)樣1 yL ;
[0052] 采用恒流模式，柱流速：lmL/min(25°C);
[0053] 燃燒爐溫度：1000°C。
[0054] 四、方法
[0055] 取尿樣6mL，加入lmLpH= 7. 0的磷酸鹽緩沖液和50yL0-葡萄糖醛酸甙酶溶 液，混勾，在55°C恒溫水浴中酶解3小時，取出，加入8mL叔丁基甲醚振蕩萃取，離心，吸取上 層有機(jī)溶液，在65°C加熱的情況下用氮氣吹干，再用50yL100%乙腈溶劑溶解，轉(zhuǎn)入樣品 瓶中，封蓋，以HPLC純化，進(jìn)樣量為45yL，色譜柱ZORBAXSB-C18 (4. 6mmX250mmX5ym)， 流動相為乙腈-水系統(tǒng)，40分鐘內(nèi)完成此系統(tǒng)體積比例變化，由30%乙腈：70%水到100% 乙腈，等梯度洗脫，流速為1. 〇mL/min。收集24-25分鐘含有本膽烷醇酮的流出液lmL，取 50yL的流出液，在60°C加熱的情況下用氮氣吹干，采用同位素比質(zhì)譜儀分析其碳元素同 位素比（13C/12C)，得到本膽烷醇酮的^值，余下的流出液在60°C加熱的情況下用氮